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方法分子生物学。作者手稿；PMC 2014年4月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
方法分子生物学。2013; 1010: 35–43.
数字对象标识：10.1007/978-1-62703-411-1_3
PMCID公司：PMC3987700型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院508515
PMID：23754217

清醒头枕小鼠皮层突触结构的经颅双光子成像

广阳,冯·潘,保罗·C·张,弗兰克·古登，以及文彪干
版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

经颅多普勒双光子显微镜可以对活动物完整皮层中的神经元、胶质细胞和血管系统进行长期成像。到目前为止，这项技术主要用于获取麻醉动物的图像。在这里，我们描述了清醒的头枕紧张小鼠皮层神经元结构的高分辨率双光子成像的详细方案。在麻醉小鼠中，手术在1小时内完成。动物从麻醉中恢复后，可以在几分钟到几天内多次进行双光子成像，从而可以对突触可塑性和病理进行纵向研究，而不会出现麻醉试剂引起的并发症。

关键词：双光子激光扫描显微镜、体内成像、树突状脊柱、树突形丝状足、突触可塑性

1引言

经颅双光子激光扫描显微镜（TPLSM）是一种微创技术，用于以秒到年的间隔以高光学分辨率成像大脑结构[1–20]. 通过创建颅骨厚度约为20μm的薄颅骨窗[2,20]，可以在距软脑膜表面300–400μm深的皮层内成像荧光标记的突触结构[1,2,6,10]. 这种方法大大有助于我们理解正常和病理条件下小鼠皮层中突触的发育和维持[2–4,6,7,10,11,17–21]. 迄今为止，经颅双光子成像研究主要是在全身麻醉下对小鼠进行的，这对于获得具有最小运动伪影的高分辨率图像至关重要。虽然麻醉对于减少成像采集过程中的运动伪影很重要，但它会改变大脑活动的正常模式，并对发育中的小鼠皮层中的树突棘和丝状体产生暂时影响[22]. 在这里，我们描述了清醒的头枕紧张小鼠突触结构的经颅双光子成像方法。该方法可用于研究清醒小鼠皮层中个别树突状突起和轴突静脉曲张的动力学，每隔几分钟到几天重复一次。它为研究健康和疾病中的突触可塑性和病理学提供了重要工具。

2材料

2.1实验动物

在皮层神经元中表达荧光蛋白的转基因小鼠（例如，thy1-YFP系）[23,24]3-4周龄时。

2.2手术试剂

  1. 氯胺酮-二甲苯嗪混合物（KX）：20 mg/ml氯胺酮（美国爱荷华州道奇堡）和3 mg/ml二甲苯嗪（美国爱荷华州谢南多阿）。在室温下储存。
  2. 无菌润滑眼膏（DEL Pharmaceuticals）。
  3. 双刃剃须刀（CAMB Machine Knives International LLC，产品目录号CMK169S）。
  4. 无菌酒精准备垫（Fisherbrand）。
  5. 高速微型钻头（精细科学工具）。
  6. 微型钻钢毛刺（精细科学工具）。
  7. 显微手术刀片（Surgistar，#6900）。
  8. 两根钢筋：长30mm，直径1.6mm。
  9. 氰基丙烯酸酯胶（Loctite 495）。
  10. 牙科用丙烯酸树脂（Motloid）：使用前混合。
  11. 人工脑脊液（ACSF）：119 mM NaCl，26.2 mM NaHCO三，2.5 mM KCl，1 mM NaH2人事军官4，1.3 mM氯化镁2，10 mM葡萄糖；含5%CO的气体2/95%O210–15分钟，然后添加2.5 mM CaCl2.过滤器使用0.22μm过滤装置进行消毒，并储存在4°C下。
  12. 硅胶低粘度套件（世界精密仪器）：使用前混合。

2.3成像设备

  1. 头部固定板(图1;看见也可参考。20)：将两个18×18×18 mm的钢块粘到14×10×0.1 cm的钢板上。木块放置在距离板的短边约2厘米处，彼此相距2厘米。在每个块上钻一个带内螺纹的孔，以容纳¼英寸的螺钉。每个螺钉都有一个垫圈。
    保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-508515-f0001.jpg

    头部受限清醒动物制剂示意图。颅骨支架包括两条平行的钢筋，用氰基丙烯酸酯胶和牙科粘接剂牢牢固定在颅骨上。感兴趣的大脑区域位于中央，颅骨的圆形区域（通常直径约0.5–1 mm）变薄至约20μm。在成像过程中，将颅骨固定器拧紧到颅骨固定板的钢块上，以减少运动伪影

  2. 带有CCD摄像头的解剖立体显微镜。
  3. 带水浸物镜的TPLSM显微镜：我们使用了Bio-Rad 2001多光子显微镜或配备锁模激光系统的定制多光子显微镜。对于这两个系统，激光系统（海啸和千禧X，光谱物理，美国加利福尼亚州山景城）的波长可从690 nm调谐到1000 nm，脉冲重复频率为80 MHz，脉冲宽度小于100 fs。激光扫描系统与垂直荧光显微镜耦合。对于定制单元，使用奥林巴斯激光扫描系统，探测器（光电倍增管）放置在目标附近，以便于信号检测。显微镜配有10×空气和60×水扩散物镜。

3方法

所有与手术和成像相关的动物实验应符合相关机构和国家动物护理指南。

3.1安装头部固定器

  1. 通过腹腔注射（5-6μl/g体重）KX对小鼠进行麻醉。等待5-10分钟，直到达到手术麻醉水平(看见附注1)并将鼠标放在棉垫上。用一滴眼膏润滑双眼(看见附注2). 可在棉垫下方插入加热垫，以保持约37°C的体温。
  2. 用双刃剃须刀片彻底剃掉头皮大部分的头发。去除残留的头发，用无菌酒精准备垫清洁头皮。
  3. 进行中线头皮切口，切口大致从颈部（耳朵之间）延伸至头部前部（眼睛之间）。
  4. 用一把弹簧剪刀小心地切断位于头皮和下面肌肉和颅骨之间的筋膜，注意不要切断血管。
  5. 用高速微干燥器轻轻去除颅骨表面的结缔组织。避免接触中线、前角和lambda缝合线，以及颞肌和枕肌。
  6. 根据立体定向坐标定位要成像的大脑区域，并用铅笔标记该区域。
  7. 将两根相距约1厘米的钢筋放置在铅笔标记的中心。确保钢筋与头骨标记区域相切(图1) (看见附注3).
  8. 在颅骨表面和与颅骨接触的两根钢筋表面涂一薄层氰基丙烯酸酯胶(看见附注4).
  9. 在氰基丙烯酸酯胶层完全干燥之前，快速涂抹一层新混合的厚牙胶(看见附注5). 避免在标记的颅骨区域直接涂抹牙科粘接剂(看见附注6).

3.2创建颅骨薄窗

  1. 等待约15分钟，直到牙科水泥层固化，头部固定器与颅骨结合良好。通过将钢筋的两端轻轻插入颅骨固定板的钢块和垫圈之间，将头部固定器连接到颅骨固定钢板。拧紧两个螺钉以完全固定头部(图1).
  2. 使用高速微干燥器去除覆盖在标记颅骨区域的任何残留氰基丙烯酸酯胶。
  3. 用一滴ACSF浸入颅骨外露区域。使用高速微驱动器将颅骨的圆形区域变薄（通常直径约0.5–1 mm；图1)在解剖显微镜下的标记区域(看见注释7). 在减薄过程中，间歇进行钻孔，以避免摩擦导致的过热。ACSF有助于软化骨骼和吸收热量。定期更换ACSF并冲洗掉骨骼碎片。
  4. 用钻头去除致密骨的外层和大部分海绵骨。在变薄过程中，流经海绵骨的血管可能会出血。这种出血通常会在几分钟内自行停止。
  5. 在取出大部分海绵骨后，解剖显微镜下通常可以看到骨内剩余的同心腔，这表明钻孔正在接近内部致密骨层。在此阶段，颅骨厚度仍应大于50μm。用显微手术刀片继续颅骨削薄，以获得非常薄（约20μm）和光滑的制备（约200μm直径）(看见附注8). 在稀释过程中，用常规荧光显微镜反复检查制剂，直到可以清楚地看到感兴趣区域的树突和棘。
  6. 完成颅骨细化后，用连接到立体解剖显微镜上的CCD摄像机拍摄大脑血管的高质量照片(图2a). 这张图片用于标记即将进行的实验中的成像区域。
    保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms-508515-f0002.jpg

    清醒头枕动物精细神经元结构的重复经颅TPLSM成像。(一)头枕紧张、清醒的动物准备中薄薄的颅骨颅骨窗口的CCD摄像头视图。通过变薄的颅骨可以清楚地看到皮层血管系统，并将其作为一个里程碑，在随后的时间点重新定位成像区域。(b条)1个月大时清醒动物初级体感皮层中相同树突状节段在4和8小时内的体内延时成像（改编自参考文献。22). 大多数树突棘在8小时内保持稳定，而树突丝状足类(星号)经历了快速的更替。显示了包含感兴趣树突段的三维图像堆栈的二维投影。比例尺：500μm(一)，2微米(b条)

  7. 在头骨顶部涂一层硅胶，保护变薄的区域，然后将鼠标放回家庭笼子进行恢复(看见附注9).

3.3习惯

小鼠从手术中醒来后，在实验开始前使其习惯于成像设备。

  1. 将小鼠头部固定器连接到颅骨固定板上，然后将仪器固定到TPLSM显微镜载物台上。根据动物的年龄和体重，可以使用身体约束装置(看见附注10) [25].
  2. 将清醒的头枕式老鼠在黑暗中放置约10分钟，然后将其放回笼子。
  3. 重复步骤1和2每次习惯化训练。实验前，最多进行三次间隔的居住。

3.4 TPLSM成像

  1. 将动物的头部固定器连接到颅骨固定板上，然后小心地剥下覆盖颅骨的硅胶。用ACSF清洁变薄的颅骨区域，并将颅骨固定板固定在TPLSM显微镜台上。
  2. 在荧光显微镜下选择一个适当细化的区域进行成像，并在CCD脑血管图上标记所选区域(看见副标题3.2，步骤6)通过观察邻近血管的模式(图2).
  3. 将TPLSM调谐至适当的波长（例如，YFP为920 nm）。如果可能，使用高数值孔径水浸物镜（例如，60×，1.1 N.A.）获取图像。
  4. 获取低倍荧光标记的神经元过程堆栈（例如，60×物镜；200μm×200μm；512×512像素；2μm步长），它与CCD脑血管图一起作为精确定位同一区域的精细地图(图2a) (看见附注11和12).
  5. 在不改变载物台位置的情况下，拍摄高倍率图像（例如，66.7μm×66.7μm；512×512像素；0.75μm步长：图2b)来自同一地区。通常在软脑膜表面以下约100μm范围内进行脊柱成像(看见附注11和12).
  6. 成像后，在暴露的头骨顶部涂抹硅胶，并将小鼠放在家中的笼子里，直到下一次成像(看见附注9).

3.5重新成像

清醒动物成像适用于无麻醉干扰的多阶段成像。根据实验的设计，可以在第一次观看后几分钟、几小时到几天内重新拍摄(看见附注13).

  1. 仔细取出覆盖在颅骨上的硅胶，根据脑血管图找到变薄的区域，并用TPLSM显微镜检查图像质量。如果在前一次成像后3天进行了重新成像，则可能需要重新精简颅骨。
  2. 在荧光显微镜下找到先前成像的区域。根据TPLSM下的低放大率地图对齐区域，然后放大到更高的放大率以进一步对齐区域。区域与第一个视图精确对齐后，使用TPLSM拍摄图像。

致谢

这项工作得到了AFAR和老年痴呆症协会（NIRG-11-205362）对G.Y.的资助。；NIH（R01 NS047325）和阿尔茨海默病协会（IIRG）至W.B.G。

脚注

1在手术过程中，用一把钝镊子夹住动物的脚，检查是否没有眨眼反射，通过测试动物的反射来持续监测麻醉深度。必要时注入更多KX。

2眼睛组织脱水会对眼睛造成永久性损伤。

三1–1/4英寸的金属丝可以用作钢筋，为幼鼠（小于15克）制作头部固定器。如果两个横杆距离太近，则在成像过程中目标可能无法聚焦到大脑中。

4颅骨固定对清醒、头枕紧张的动物成像至关重要。在涂抹胶水之前，可以使用空气除尘器确保头骨完全干燥。如果颅骨支架与颅骨结合不好，在成像过程中可能会从头部分离。

5使用牙科粘接剂在标记的颅骨区域周围形成一个良好的环境。当使用浸水透镜时，这有助于在成像期间将ACSF固定到位。

6如果牙齿粘结剂意外覆盖了有标记的大脑区域，在粘结剂凝固之前，立即用显微手术刀片将其刮掉。

7尽可能减少颅骨要变薄以便成像的区域，因为变薄较大的区域会增加对底层皮层造成损伤的可能性。

8在变薄过程中，将显微手术刀片保持在约45°的角度，注意不要将颅骨向下推压到大脑表面或穿透骨骼，因为轻微的脑外伤或出血可能会导致炎症和神经结构破坏。利用TPLSM对颅骨自荧光成像，可以直接测量颅骨厚度。在稀释过程中定期测量颅骨厚度可以帮助初学者防止颅骨过度稀释。

9在没有任何保护措施（ACSF或硅胶）的情况下，将变薄的颅骨区域长时间暴露在空气中可能会对其下方的脑组织造成损伤。

10在没有身体约束的情况下，可以从3周大和更年轻的小鼠身上获得树突棘的稳定图像。对于体重超过12克的小鼠，可以在其背部放置一个半切塑料圆筒（直径约3厘米），以减少成像过程中的身体运动。

11在成像过程中，应始终使用鼠标ACSF进行客观浸入。如果成像质量突然下降，请检查透镜是否完全浸没在ACSF中。

12我们通常使用10-30 mW范围内的激光强度（在样品处测量），以最小化光毒性。

13如果相邻两次成像之间的间隔时间超过2天，则可能需要更换硅胶。

工具书类

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