Tyrosine nitration of voltage-dependent anion channels in cardiac ischemia-reperfusion: reduction by peroxynitrite scavenging

Meiying Yang; Amadou K.S. Camara; Bassam T. Wakim; Yifan Zhou; Ashish K. Gadicherla; Wai-Meng Kwok; David F. Stowe

doi:10.1016/j.bbabio.2012.06.004

Biochim生物物理学报。作者手稿；PMC 2014年4月14日提供。

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Biochim生物物理学报。2012年11月；1817(11): 2049–2059.

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PMID：22709907

心脏缺血再灌注中电压依赖性阴离子通道的酪氨酸硝化：通过清除过氧亚硝酸盐减少^{^☆}

杨美英,^一阿马杜·卡马拉,^a、，^{e（电子）} 巴萨姆·T·瓦金,^c（c）周一凡,^a、，^d日阿什什·卡迪切拉（Ashish K.Gadicherla）,^一魏梦国,^a、，^d日和大卫·F·斯托^a、，^b、，^e、，^f、，^克，^*

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摘要

超氧化物过量 $({O（运行）}_{2}^{• -})$ 一氧化氮（NO•）形成过亚硝酸盐（ONOO⁻)在心脏缺血再灌注（IR）损伤期间，这反过来会诱导蛋白酪氨酸硝化（tyr-N）。线粒体是ONOO的来源和靶点⁻我们的目的是鉴定心脏IR损伤后显示增强tyr-N的特异线粒体蛋白，并探讨是否抑制 ${O（运行）}_{2}^{• -} / O（运行） N个 O（运行） {O（运行）}^{-}$ IR期间线粒体蛋白tyr-N减少，从而改善心脏功能。我们在这里使用3-硝基酪氨酸抗体的Western blot分析表明，IR增加了35和15 kDa线粒体蛋白的酪氨酸-N。免疫沉淀（IP）和LC-MS/MS鉴定出13个候选蛋白用于tyr-N。IP和Western blot鉴定并确认35kDa tyr-N蛋白是电压依赖性阴离子通道（VDAC）。天然心脏VDAC的Tyr-N与IR在含有外源ONOO的重组（r）VDAC上得到验证⁻。我们还发现ONOO⁻ONOO直接增强rVDAC通道活性和rVDAC酪氨酸-N⁻形成低聚物。白藜芦醇（RES），一种 ${O（运行）}_{2}^{• -} / O（运行） N个 O（运行） {O（运行）}^{-}$ 降低了天然和重组VDAC的酪氨酸-N水平，而抑制NO•生成的L-NAME仅降低了天然VDAC的tyr-N水平。 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻RES和L-NAME在IR期间降低了灌注心脏中的水平，并伴有心功能的改善。这些结果确定了VDAC的tyr-N，并表明减少ONOO⁻心脏缺血再灌注损伤可减弱VDAC的酪氨酸-N，改善心功能。

关键词：线粒体、蛋白质酪氨酸硝化、心脏损伤、VDAC、ROS/RNS清除剂

1.简介

心肌缺血（I）和再灌注（R）损伤期间线粒体功能障碍与钙²⁺过载，活性氧（ROS）过量排放[1–三]和活性氮（RNS）[4,5]这可能导致线粒体蛋白质的有害翻译后修饰（dPTM）[6]. 超氧化物 $({O（运行）}_{2}^{• -})$ ，大多数O的起源₂-衍生自由基，在心脏IR损伤期间过度产生和清除不足[1,7]. 在缺氧或缺血条件下，线粒体电子传输链（ETC）最初处于高度还原状态[1]，导致电子泄漏，因此O₂减少到 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ .再灌注期间， ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 缺血期间开始的生产进一步加剧[1]由于ADP水平降低₂活性氧清除能力差。一氧化氮（NO•）是RNS的前体，在IR期间也可能增加[8,9]. 什么时候？ ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 过量时，它与可用NO反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO⁻) [2,10]是一种高度反应的非自由基，是RNS诱导细胞毒性的强标记物。事实上，ONOO显著增加⁻发生在心脏IR损伤期间[4,5]损伤减少与ONOO释放减少有关⁻[4,5]. ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 是线粒体中产生的一种带电且扩散受限的分子，而NO•是一种不带电且扩散的分子，容易穿过线粒体膜。ONOO公司⁻线粒体的半衰期约为3-5毫秒，是线粒体蛋白质和脂质的强氧化剂[三]. 因此线粒体可以同时作为ONOO的位点⁻生产和ONOO的目标⁻-诱导dPTM[三]. 例如，ONOO⁻通过硝化和氧化关键酪氨酸残基介导线粒体锰超氧化物歧化酶（MnSOD）失活[11,12]. 然而，最脆弱的蛋白质位点，ONOO的机制⁻介导线粒体损伤，心脏功能后果尚不清楚。

一般来说，ONOO⁻可直接氧化分子，分解为NO₂•和•OH，或与CO反应₂形成 $C类 {O（运行）}_{三}^{• -}$ 和否₂• [13]. 这些自由基诱导蛋白质硝化，特别是暴露的酪氨酸残基形成3-硝基酪氨酸（3-NT）[6]. 酪氨酸硝化（tyr-N）不仅是由ONOO引起的RNS诱导应激的既定标志物⁻及其激进产品，但也适用于ONOO⁻介导的细胞毒性；一旦形成，3-NT就相对稳定，硝化会导致有害的蛋白质结构和功能改变[三,13]. 酪氨酸-N本身可能导致蛋白质功能障碍，也可能通过酪氨酸激酶阻止酪氨酸磷酸化[14]. 尽管tyr-N被广泛用作指示ONOO的生物检测⁻一代，我们承认ONOO⁻还可以硝酸化色氨酸和苯丙氨酸，并且它还氧化其他部位，例如FeS中心、蛋白质硫醇和脂质[10]. 此外，酪氨酸-N可能由ONOO诱导⁻气体NO等独立氧化剂₂•由氧化形成 $N个 {O（运行）}_{2}^{-}$ （本身是NO的氧化产物）₂O（运行）₂过氧化物酶，但这种不稳定NO的浓度很高₂•产品可能需要诱导tyr-N[15].

两者都有体内和在体外有证据表明，参与氧化磷酸化和凋亡的蛋白质可以在各种疾病和疾病中被硝化[16]. 红外损伤后观察到蛋白质硝化[17–22]但IR对诱导不可逆dPTM改变关键线粒体蛋白结构和功能的作用尚未得到很好的研究。Liu等人[17]利用双向凝胶电泳（2-DE）凝胶和质谱（MS）分析间接鉴定了10种线粒体蛋白质，包括来自氧化磷酸化系统的4个亚基、基质中的5种酶和IR损伤后硝化的电压依赖性阴离子通道（VDAC）。然而，使用特异性抗体对这些酪氨酸-N蛋白进行鉴定，以及使用质谱测定酪氨酸N的特异性位点，还没有进行；目前尚不清楚是否可以通过清除ROS/RNS或抑制一氧化氮合酶（NOS）来减少心肌缺血再灌注期间线粒体蛋白的硝化，以及是否已确定的硝化线粒体蛋白表现出改变的功能。

我们提出一些关键的线粒体蛋白在IR损伤过程中经历酪氨酸-N，并减弱ONOO的形成⁻减少这些蛋白质的酪氨酸-N并导致改善心脏功能。因此，我们的第一个目标是确定在心脏IR损伤后，特异性线粒体蛋白的酪氨酸-N增强。我们确定VDAC是一种酪氨酸-N蛋白，因此将VDAC作为其他研究的重点。虽然其他蛋白质在IR损伤过程中可以被硝化，但基于我们的初步结果，我们将重点放在VDAC上。我们探测了ONOO⁻诱导重组（r）VDAC的酪氨酸-N及其对改变rVDAC通道活性的影响。此外，我们还测试了白藜芦醇（RES，反式-3，4′，5-三羟基二苯乙烯） ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻清除剂和N^G公司-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）是一种非特异性的一氧化氮合酶抑制剂，可降低线粒体蛋白中酪氨酸-N的含量，并与酪氨酸-N-的水平降低有关 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻促进完整心脏IR损伤后的功能恢复。我们在本研究中对分子方面的关注为研究ROS/RNS如何影响线粒体蛋白和导致IR期间心肌功能的改变提供了更深入的机制。这种深入的方法可以为缓解IR损伤提供更好的策略。

2.方法

2.1. 隔离心脏准备和方案

红心大战就地无法用于检测 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻因此，利用豚鼠离体心脏直接关联IR损伤后心脏总氧化应激和离体线粒体功能的变化。我们的动物实验符合实验动物护理和使用指南（美国国立卫生研究院第85-23号，1996年修订）[4,7,23,24]（详见在线补充材料和方法). 全脑缺血30分钟后，或再灌注10、30或60分钟后，取出心脏并立即分离线粒体。在治疗组中，100µmol/L L-NAME或10µmol/L RES灌流10分钟，直到开始全身缺血，以便药物在缺血期间留在心脏中。RES，10µmol/L，对离体大鼠心脏具有心脏保护作用[25]和100µmol/L L-NAME区块增加了ONOO⁻17°C灌注离体心脏的生产[24].

2.2. 检测 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻在孤立的心中

使用细胞内荧光探针二氢乙硫铵（DHE）（分子探针）评估 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 如前所述，在离体心脏中的放射（参见在线补充材料和方法) [7,23,24,26]. 在达到稳定性后，用10µmol/L DHE加载心脏20分钟，然后将残余DHE洗脱20分钟。使用二酪氨酸（二酪氨酸）检测ONOO⁻如前所述间接形成（参见在线补充材料和方法) [24]. ONOO公司⁻与持续灌注的L-酪氨酸（0.3 mmol/L）反应形成荧光二聚体二酪氨酸[9]，组织pH值下的稳定产品[27]. 缺血前用/不用RES/L-NAME处理DHE负载/L-酪氨酸灌注心脏，然后用IR处理。

2.3. 线粒体的分离

在每个功能研究结束时，我们在实验室使用成熟的方法分离心脏线粒体[28–30]稍作修改。所有隔离程序均在4°C下进行。在含有200mmol/L甘露醇、50mmol/L蔗糖、5mmol/L KH的冷冻隔离缓冲液中将心脏切成小块₂人事军官₄在pH 7.15的条件下，5 mmol/L MOPS、0.1%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）和1mmol/L EGTA，然后在含有蛋白酶（5 U/ml，Sigma Cat:P-5495）的2.65 ml分离缓冲液中用超声波均质器均质15 s。在此之后，将含有蛋白酶抑制剂的15 ml分离缓冲液（罗氏全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）快速添加到匀浆中，然后再进行15 s的匀浆。将浆液匀浆在10000 g下离心5 min，然后将颗粒重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的隔离缓冲液中，并在8000 g下离心10 min。然后，将颗粒再次悬浮在含有酶抑制剂的分离缓冲液中并在750 g下旋转10 min；然后收集上清液并在8000 g下再次离心。将所得线粒体颗粒重新悬浮在含有蛋白酶抑制剂的分离缓冲液中，并将其储存在−80°C下以备日后使用。以牛血清白蛋白（BSA）为标准，采用生物红蛋白测定法测定线粒体蛋白含量。

2.4. 线粒体蛋白免疫沉淀

如前所述进行免疫沉淀（IP）[17,31]有微小的变化。将线粒体制粒，然后在含有50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4、150 mmol/L.NaCl、1%脱氧胆酸钠、1%Triton X-100、0.1%SDS和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中冰上溶解30分钟。用30µL蛋白G Sepharose-4B珠（Invitrogen）预清样品在4°C下，用恒定的末端过度摇晃1小时，然后在3000 g下离心5分钟。收集上清液，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液调节至2 mg/ml蛋白质浓度，并用抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体（抗3-NT，Millipore）或抗VDAC抗体（Sigma）进行IP在4°C的温度下，持续不断地端对端摇动过夜。第二天，在添加30µl蛋白G Sepharose-4B珠后，在与上述相同的条件下将混合物再培养2小时。收集珠子并用RIPA缓冲液彻底清洗（五次）。将最终颗粒重新悬浮在50µl样品缓冲液中，该样品缓冲液含有50 mmol/l Tris-Cl、10%甘油、500 mmol/l-β-巯基乙醇、2%十二烷基硫酸钠、0.01%w/v溴酚蓝和蛋白酶抑制剂，pH 7.4，并在95°C下煮沸5分钟。使用SDS-PAGE分离免疫沉淀蛋白。将凝胶银染或进行蛋白质印迹分析。

2.5. 双向凝胶电泳（2-DE）

采用IEF/标准凝胶系统（Bio-Rad）进行2-DE。线粒体颗粒在含有7.8 mol/L尿素、2.2 mol/L硫脲、4%CHAPS和蛋白酶抑制剂的冰上溶解缓冲液中溶解30 min，然后用Amicon 3 kDa（Millipore）脱盐两次。在添加65 mmol/L DTT和1%生物细胞两性电解质（pH3-10）后，立即将来自每个样品的约800µg蛋白质加载到11-cm非线性pH 3–10 IPG条带（Bio-Rad）上。将板条在50 V下再水化12 h，然后在以下条件下进行聚焦：电压首先在20 min内增加到250 V，然后在70 min内线性增加到8000 V，然后保持在8000 V，直到达到26 kVh。然后将聚焦IPG条在0.375 mol/L Tris-Cl、pH 8.8、6 mol/L尿素、20%甘油、2%十二烷基硫酸钠和2%DTT中平衡15分钟，然后在0.375 mol/L Tris-Cl、PH8.8、6mol/L尿素、20%丙三醇、2%十二烷基苯磺酸钠和2.5%碘乙酰胺中平衡15 min。将平衡后的板条加载到预铸凝胶（Criterion™10%，11 cm；Bio-Rad）上，进行二维分离。将凝胶在150V下运行70分钟，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用抗VDAC和抗3-NT抗体进行蛋白质印迹分析。

2.6. 蛋白质印迹分析

在样品缓冲液中溶解线粒体颗粒，并在95°C下煮沸5分钟。线粒体样品（100µg）或免疫沉淀物通过SDS-PAGE溶解并转移到PVDF膜上。膜与针对3-NT、VDAC（细胞信号传导）和ANT（腺嘌呤核苷酸转运体，圣克鲁斯）的特异性一级抗体孵育。用与辣根过氧化物酶结合的适当二级抗体培养冲洗过的膜，然后浸入增强化学发光检测溶液（GE Healthcare）中，并暴露于X射线胶片上进行放射自显影。为了监测负载蛋白量，VDAC或ANT蛋白被用作负载控制，因为VDAC和/或ANT是线粒体膜蛋白，它们的检测证实了线粒体分离。用缓冲液（62.5 mmol/L Tris-Cl、2%SDS和100 mmol/L-β-巯基乙醇，pH 6.8）剥离印迹，然后用VDAC或ANT的特异性抗体进行检测。

2.7. 蛋白质条带的凝胶内胰蛋白酶消化

按照Newman等人的描述，将银染凝胶中的蛋白质带切除并切成小块，然后通过胰蛋白酶进行凝胶内消化[32]. 简而言之，在用100 mmol/L Na的1:1溶液去除银离子后₂S公司₂O（运行）_三和30 mmol/L K_三铁₉（中国）₆用50%乙腈和25 mmol/L（NH₄)HCO公司_三/50%乙腈（pH 8.0）。干燥脱水凝胶片，然后用40 ng胰蛋白酶在100µl 25 mmol/l（NH）中消化₄)HCO公司_三（pH 8.0）在37°C下过夜。用乙腈/三氟乙酸（TFA）/水（70:0.1:29.9 v/v/v）从凝胶切片中提取色氨酸片段。干燥提取的样品并制备用于LC-MS/MS或MALDI-TOF MS分析。

2.8. LC-MS/MS质谱法鉴定蛋白质

使用LTQ（Thermo-Fisher）MS与配备Micro-AS自动取样器的Surveyor HPLC系统耦合，对提取的胰蛋白酶片段进行LC-MS/MS分析。在Aquasil，C18 PicoFrit毛细管柱（75 mm×100 mm；新目标）上进行MS/MS分析之前，在线分离胰蛋白酶肽，条件如下：流动相A，0.1%甲酸（含5%乙腈）；和流动相B，分别在95%乙腈中加入0.1%甲酸。采用180 min线性梯度。在1.75 kV电压下对柱中洗脱的离子进行电喷雾。使用SEQUEST搜索引擎分析MS/MS光谱数据，并通过可视化软件程序[33]. SEQUEST搜索参数设置为无固定修改，一个缺失胰蛋白酶裂解位点，肽耐受性为1.2 Da，MS/MS耐受性为0.8 Da，然后根据Uniprot数据库的啮齿动物子集进行搜索。所有鉴定的蛋白质都必须满足1.5%或更低的错误发现率（FDR）。

2.9. MALDI-TOF质谱法鉴定蛋白质

还按照Newman等人的描述进行了MALDI-TOF MS[32]. 简言之，将干燥的提取样品重悬于20µl 0.1%TFA中，并使用Micro-C进行纯化₁₈拉链头（Millipore）。纯化后的样品用1–2µl体积的α-氰基-4-羟基肉桂酸在60%乙腈/0.1%TFA中洗脱，然后直接加载到样品板上，使用Voyager DE PRO MALDI-TOF质谱仪在正离子、反射器、延迟萃取模式下进行分析（Applied Biosystems）。使用Protein Prospector软件分析肽团(http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.html).

2.10. 外源ONOO诱导重组VDAC硝化⁻在体外

由于VDAC被鉴定为心脏IR损伤后的关键tyr-N蛋白，因此我们进一步探索VDAC tyr-N的特异性残基，并确定VDAC的tyr-N是否影响其结构和功能。为此，我们将重组VDAC（rVDAC）暴露于不同浓度的外源ONOO⁻诱导rVDAC的浓度依赖性硝化在体外将大鼠VDAC-1全长cDNA（GenBank:BC072884，购自Open Biosystems）克隆到pET-21a载体（Novagen）中，并在BL21细胞中表达。用BugBuster Master Mix（Novagen）提取rVDAC蛋白，并用Ni-NTA His·Bind树脂（Novagen）纯化。纯化的rVDAC在4°C下通过在pH 7.4下用含有20 mmol/L Tris-Cl、100 mmol/L-NaCl、1%十二烷基二甲基氧化胺（LDAO）和1 mmol/L-DTT的10体积重折叠缓冲液逐滴稀释一体积蛋白进行重折叠[34,35]. 据报道，使用洗涤剂LDAO可使rVDAC的折叠率达到90%，而使用洗涤剂DDM或C8E4的折叠率分别为75%和30%[35]. 复性后，将复性rVDAC蛋白与复性缓冲液（无DTT）在4℃下进行透析，以去除DTT。重组rVDAC用于在体外ONOO硝化⁻.ONOO公司⁻（钙生物化学）浓度通过302 nm处的吸光度测定，消光系数为1670 M⁻¹厘米⁻¹使用前在100 mmol/L NaOH中[36]. 用于rVDAC接触ONOO⁻将500µg 3 mg/ml的rVDAC与0–400µmol/L ONOO孵育⁻在23°C下保持30分钟。ONOO⁻-对处理后的rVDAC进行SDS-PAGE或2-DE，然后用3-NT和VDAC抗体进行Western blot，或用银染法对凝胶进行染色，并切割VDAC条带用于MALDI-TOF MS。

2.11. 重组rVDAC为平面脂质双层以促进通道活性

如前所述，通过将rVDAC并入平面脂质双层（PLB）来监测rVDAC的通道活性[37]. 简单地说，磷脂是通过以5:4:1（v/v）的比例混合磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱（Avanti Polar Lipid，Alabaster，AL）制备的；磷脂在N下干燥₂并在正癸烷中重新悬浮至最终浓度25 mg/ml顺式/反式试验箱中含有10 mmol/L HEPES、500 mmol/L-NaCl和1 mmol/L-CaCl的相同溶液₂pH值7.4。这个顺式会议室在虚拟场地举行反式密室被控制在命令电压下。rVDAC蛋白被添加到顺式腔室。通道并入双层后，ONOO⁻已添加到顺式室并按比例稀释，以达到50µmol/L的所需浓度。使用连接到数字化仪（DigiData 1440，Molecular Devices）的电压钳放大器（Axopatch 200B，Molecule Devices。pClamp软件（版本10，分子器件）用于数据采集和分析。使用Origin 7.5（OriginLab）进行额外分析。

2.12. 统计分析

所有结果均以平均值±SEM表示，并通过单向方差分析（ANOVA）和事后分析（Student–Newman–Keuls检验）进行分析，以确定组间平均值的统计显著差异。值为第页<0.05被认为是显著的（双尾）。

3.结果

3.1. ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻IR损伤时离体心脏的产量增加

DHE荧光( ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 排放）在缺血期间增加；再灌注时，它突然下降，但仍高于基线值(图1A，IR10），与我们之前的发现一致[7,23,26]. 类似地，二Tyr荧光（ONOO⁻)缺血时升高并持续升高；再灌注后降至基线水平(图1B，IR10）。时间控制（TC）组DHE无明显变化 $({O（运行）}_{2}^{• -})$ 和DiTry（ONOO⁻)灌注期间的荧光(图1A和B，TC）。

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图1

超氧化物变化的时间进程 $({O（运行）}_{2}^{• -})$ 和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻)IR.A期间的水平：荧光探针DHE，通过其稳定（乙炔）或不稳定和不稳定的2-乙氧基硫（2-OH-E）⁺)产品用于评估细胞内 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 左心室游离壁孤立心脏的在线发射。B：在ONOO存在下由L-酪氨酸形成的二酪氨酸（DiTyr）荧光⁻用于监视ONOO⁻与DHE荧光探针类似。TC：时间控制；IR10:30分钟缺血和10分钟再灌注；N=4-5个心脏/组/探头；数值为平均值±SEM。*：第页<0.05 vs.TC。参见表1用于功能数据。

这些变化 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻代谢物也与离体心脏的功能变化有关。收缩-舒张左心室压（dLVP），收缩和舒张指数(d日LVP（LVP）/日期_最大值和d日LVP（LVP）/日期_最小值)缺血期间LVP分别下降，而舒张压升高(表1IR10、IR60）；再灌注期间，d日LVP（LVP）/日期_最大值,d日LVP（LVP）/日期_最小值dLVP恢复到几乎缺血前值的一半，而舒张期LVP仍显著高于缺血前水平(表1、IR10、IR60）。TC组的心功能随着时间的推移没有变化（参见在线补充表S3). 与缺血前相比，所有组再灌注时的心率无变化(表1).

表1

IR10、60、白藜芦醇和L-NAME治疗IR10组在基线、缺血30min和再灌注10min和60min期间的心功能。

变量	缺血前期	缺血 30分钟	再灌注 10分钟	再灌注 60分钟
dLVP/日_最大值（毫米汞柱/秒）
IR10、60	2440 ± 119	23 ± 1	1450 ± 172	1550 ± 151
IR10+恢复	2429 ± 104	25 ± 1	1913 ± 119^*
IR10+L名称	2778 ± 191	23 ± 1	1799 ± 119^*
dLVP/日_最小值（毫米汞柱/秒）
IR10、60	−2178 ± 128	−32 ± 2	−1151 ± 162	−1255 ± 140
IR10+恢复	−2140 ± 83	−29 ± 1	−1944 ± 190^*
IR10+L名称	−2290 ± 134	−29 ± 1	−1722 ± 83^*
Sys-dia LVP（毫米汞柱）
IR10、60	88 ± 4	0.1 ± 0	38 ± 5	39 ± 4
IR10+恢复	90 ± 4	0.1 ± 0	57 ± 7^*
IR10+L名称	95 ± 5	0.1 ± 0	64 ± 4^*
舒张压（毫米汞柱）
IR10、60	0 ± 0	10 ± 3	17 ± 3	16 ± 3
IR10+恢复	0 ± 0	1 ± 1^*	3 ± 2^*
IR10+L名称	0 ± 0	3 ± 2^*	4 ± 2^*
冠状动脉流量（ml/min）
红外线10，60	21.2 ± 2.2	0 ± 0	18.6 ± 2.4	19.3 ± 2.2
IR10+恢复	21.6 ± 1.8	0 ± 0	19.4 ± 1.4
IR10+L名称	16.3 ± 2.2^*	0 ± 0	15.4 ± 1.6^*
心率（次/分）
IR 10、60	215 ± 5	0 ± 0	212 ± 6	213 ± 4
IR10+恢复	210 ± 3	0 ± 0	214 ± 7
IR10+L名称	215 ± 4	0 ± 0	220 ± 4

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IR10：缺血30min，再灌注10min；IR60仅用于非治疗组；sys–dia LVP，左室收缩压-舒张压；dLVP/日_最大值收缩性指数；dLVP/日_最小值：松弛指数；N=8-10颗心脏/组。数值为平均值±SEM。

^*第页<0.05:IR10+RES，IR10+L-名称与。IR10、60。

3.2. 心脏IR损伤后线粒体蛋白tyr-N增加

隔离心脏实验强烈暗示心脏蛋白tyr-N作为ONOO标记物的潜力⁻-诱导的dPTM。由于线粒体功能障碍在IR损伤中起关键作用，我们同时评估了线粒体蛋白tyr-N的程度。从TC、I30、IR10、IR30和IR60组分离的线粒体用抗3-NT抗体进行Western blotting。在所有组中都检测到几个免疫反应带(图2A). 与TC相比，IR在35kDa和15kDa时导致抗3-NT带信号强度增加。为了排除更强的抗3-NT信号来自大量蛋白负载的可能性，我们选择ANT（~35kDa）蛋白作为负载对照，这在所有组中都是相似的(图2A). 各组间抗3-NT条带与抗ANT条带密度比值DHE荧光（afu）的比较(图2B)明确证实IR组出现增强的抗3-NT免疫反应。

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图2

从心脏分离的线粒体蛋白的tyr-N的评估和tyr-N线粒体蛋白的鉴定。A：用抗3-NT抗体的Western blot评估TC和IR组心脏线粒体蛋白的tyr-N。用抗ANT抗体监测负载线粒体蛋白的数量。B：线粒体蛋白酪氨酸-N的Western blot密度分析。用ImageJ系统测量了35kDa和15kDa左右的抗3-NT带和ANT带的密度，然后将每个抗3-NT条带的密度%归一化为相应ANT带密度的%。A是代表性斑点，B是四个实验的平均值±SEM。*：第页与TC组相比<0.05。TC：时间控制；一：缺血；R：再灌注。MW：分子量。C：从IR组中分离的线粒体蛋白用抗3-NT抗体进行IP处理，然后用所示抗体进行Western blot。通道1和3：线粒体蛋白总裂解物（输入）；通道2和4：带有抗3-NT抗体的IP。MW：分子量；WB：蛋白印迹。D：首先用抗VDAC抗体对TC和IR10组线粒体蛋白中的VDAC进行单独免疫沉淀。免疫沉淀用抗3-NT抗体进行Western blotting，然后剥离膜并用抗VDAC抗体重新缝合。E：使用ImageJ系统测量TC和IR10组中抗3-NT条带和VDAC条带的密度，然后将每个抗3-NT的条带的%密度归一化为相应VDAC条的%密度。WB：蛋白印迹。D是代表性斑点，E是三个实验的平均值±SEM。*：第页<0.05 IR10与TC。

3.3. 用特异性抗体和质谱鉴定tyr-N线粒体蛋白

鉴定上述蛋白质印迹所涉及的增强型tyr-N蛋白(图2A)，我们将IR组的线粒体总蛋白提取物与抗3-NT抗体进行IP。IP后，将免疫沉淀物进行SDS-PAGE，以去除洗涤剂并收集样品进行LC-MS/MS分析。免疫沉淀从加载孔进入SDS-PAGE凝胶的分离凝胶部分后，凝胶运行5分钟，然后银染。收集凝胶上包括所有大小蛋白质的银染蛋白质区域，并将其切成两部分进行LC–MS/MS(图S1车道1，在线补充). 最初，从抗3-NT的免疫沉淀物中获得13个线粒体蛋白(表S1，在线补充). 其中四种是来自ETC的多肽，五种是TCA循环的成分。值得注意的是，两种蛋白质，VDAC和ANT，分子量约为35kDa，与上述Western blot 35kDa-tyr-N蛋白带大小相似(图2A)也获得了。这表明这两种蛋白可能是酪氨酸-N线粒体蛋白的候选蛋白。

我们使用蛋白特异性抗体来进一步鉴定蛋白质印迹上显示的tyr-N蛋白。基于下列候选蛋白质的分子量在线补充表S1以及蛋白质印迹分析(图2A)，我们重点确定ANT和/或VDAC是否为35 kDa tyr-N蛋白。用抗3-NT抗体对IR组线粒体蛋白提取物进行IP分析，然后用VDAC和ANT抗体进行Western blotting。VDAC抗体用于检测抗3-NT免疫沉淀物时检测到免疫反应信号(图2C，车道4）。这对应于用抗VDAC抗体探测的线粒体总蛋白裂解物中一条类似大小的35kDa带(图2C，通道3，输入）或用抗3-NT抗体探测(图2A). 相反，当ANT抗体(图2C，Lane 2）未从抗3-NT免疫沉淀物中检测到免疫反应信号。这些数据强烈暗示VDAC是IR损伤后表现出增强tyr-N的35kDa蛋白。在Western blot上，一个15kDa的线粒体蛋白在IR组中也显示出增强的tyr-N，我们还发现了3个分子量约为15kDA的蛋白质（参见在线补充表S1); 这些酪氨酸-N蛋白的鉴定尚不完整；我们在这里的目的是只关注VDAC。

接下来，我们使用了Tran等人报告的方法[38]比较TC和IR基团中硝化VDAC与总VDAC的相对比率。基于图2A结果，在35kDa蛋白水平上，IR10组显示出与IR60组相似的tyr-N水平，但高于IR30组。因此，我们选择IR10组与本实验和所有其他实验中的TC进行比较。按照方法（见方法2.3）所述，从TC和IR10心脏分离线粒体。首先用TC和IR10组的线粒体蛋白裂解物中的抗VDAC抗体（Sigma）免疫沉淀VDAC。用抗3-NT抗体对免疫沉淀物进行Western blotting，然后用抗VDAC抗体（细胞信号转导）剥离膜并重新缝合。结果显示，TC和IR10组的VDAC蛋白免疫沉淀量相似(图2D与TC组相比，IR10组中免疫沉淀的tyr-N VDAC增加(图2D，上面板）。通过比较tyr-N VDAC带与总VDAC带的相对比率，可以清楚地证实IR使VDAC硝化作用显著增加了约4倍(图2E). 这个结果(图2D，E)与图1所示的用抗3-NT进行的蛋白质印迹的结果相似图2A和B其显示了一种35 kDa蛋白（识别为VDAC），IR组的酪氨酸-N水平高于TC组。

为了进一步证实VADC的tyr-N，TC和IR10组的线粒体蛋白分别进行2-DE，然后用抗3-NT抗体进行Western blots。用抗3-NT抗体印迹后，剥离膜，然后用抗VDAC抗体重新印迹。结果表明，IR10组VDAC斑点（实心斜箭头）对抗3-NT抗体显示出较强的免疫反应性(图S2B、D，在线补充)而在TC组，VDAC斑点（虚线斜箭头）仅显示带有抗3-NT抗体的轻微免疫反应信号(图S2A，C，在线补充). 为什么两个VDAC点显示出对抗3-NT抗体的免疫反应性（实心倾斜箭头，图S2，在线补充)目前尚不清楚IR10组中的情况。

3.4. ONOO公司⁻体外诱导rVDAC的酪氨酸-N

这些实验的目的是鉴定特定的酪氨酸N残基，并进一步确认VDAC的酪氨酸-N。纯化的rVDAC暴露于ONOO⁻（0–400µmol/L）和ONOO⁻-处理后的rVDAC蛋白用抗3-NT抗体进行Western blotting。我们的方法表明，rVDAC可以被低至10µmol/L的ONOO硝化⁻(图3A); 此外，rVDAC的tyr-N信号强度随着[ONOO⁻]增加了。一些rVDAC蛋白的酪氨酸-N在SDS-PAGE凝胶上表现出缓慢的流动性。除了35kDa条带（rVDAC单体）之外，还出现了分子量约为65kDa、100kDa和更高的其他条带。这表明形成了较高分子质量的物种(图3A)并提示tyr-N诱导rVDAC的结构改变，导致蛋白质齐聚。

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图3

ONOO诱导重组（r）VDAC的Tyr-N⁻ 在体外.A:rVDAC与0–400µmol/L ONOO孵育⁻用抗3-NT抗体进行Western blot。用抗VDAC抗体监测rVDAC负荷。B：肽片段的质谱表征⁶²YRWTEYGLTFTEK公司⁷⁴由MALDI-TOF MS测定米/秒1693对应于含有未经修饰的酪氨酸残基的肽，峰标记在米/z1738对应于与米/秒1693年，但有tyr-N残留物，即显示+45质量单位位移的残留物。MW：分子量。

此外，我们检测了与ONOO孵育的rVDAC的特性⁻在这个实验中，我们选择了一种浓度的ONOO⁻即200µmol/L，用于处理rVDAC。治疗后rVDAC出现4个相邻斑点(图S3B和D，在线补充); 其中三个斑点显示出与抗3-NT抗体和抗VDAC抗体相同的信号强度，而大多数对照（非硝化）rVDAC积聚在两个相邻的斑点，并且对抗3-NT抗体没有显示出免疫反应性(图S3A和C，在线补充).

为了确定rVDAC中可能存在的酪氨酸-N残基，我们切除了ONOO⁻-未经处理（0µmol/L）和100、200、400µmol/L ONOO⁻-在银染SDS-PAGE凝胶上处理rVDAC条带，然后将其置于MALDI-TOF MS中。MALDI-to MS分析的灵敏度低于Western blots，因为在MS分析中，样品板上只装载了1–2µl胰蛋白酶消化样品，激光束部分且随机地击中肽片段。因此，对于本实验，ONOO的浓度为100、200、400µmol/L⁻用于治疗rVDAC。MALDI-TOF MS检测到rVDAC的11个总酪氨酸残基中的9个，具体来说，²²是的，⁶²是的，⁶⁷是的，¹⁴⁶是的，¹⁵³是的，¹⁷³是的，¹⁹⁵是的，²²⁵Y和²⁴⁷Y（Y）(在线补充表S2). 在已鉴定的含Y肽片段中，有一个片段，⁶²YRWTEYGLTFTEK公司⁷⁴，显示了ONOO中+45质量单位从m/z 1693移动到1738⁻-经处理的rVDAC(图3B)，与单个NO一致₂组已添加到其中之一⁶²Y或⁶⁷Y.在ONOO中⁻-未经处理（对照）的rVDAC的m/z 1693谱强度在所有四组中最高，而m/z 1738谱没有。在ONOO中⁻-经rVDAC处理后，m/z 1693的光谱强度随着[ONOO]的增加而逐渐降低⁻]而光谱m/z 1738出现在三个ONOO中⁻-治疗的rVDAC组(图3B). ONOO中确定的现场⁻-治疗后的rVDAC可能与IR损伤后的原生VDAC相同，也可能不同。

3.5. 白藜芦醇或L-NAME治疗可降低线粒体蛋白tyr-N

接下来我们研究了IR期间蛋白酪氨酸-N的增加是否归因于ONOO的增加⁻由NO•和 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 在缺血30分钟前用L-NAME或RES处理心脏，然后进行IR，用抗3-NT抗体的Western blot再次评估线粒体蛋白的tyr-N（见结果3.2）。与未治疗组相比，RES和L-NAME均降低了35kDa的tyr-N（鉴定为VDAC）和15kDa的线粒体蛋白(图4A、B). 这些数据表明ONOO⁻在IR损伤诱导的线粒体蛋白硝化过程中产生，尤其是VDAC的酪氨酸-N。

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图4

L-NAME和白藜芦醇（RES）对线粒体蛋白tyr-N的抑制作用。A：在缺血开始之前，将离体心脏在不使用或使用L-NAME（100µmol/L）或RES（10µmol/L）的情况下处理10分钟。再灌注后，分离线粒体，用抗3-NT抗体Western blot检测线粒体蛋白酪氨酸-N。通过用抗ANT（A，下面板）重制膜来评估线粒体蛋白的负载量。B：使用ImageJ系统测量约35kDa、15kDa和ANT带处的抗3-NT带密度，然后将每个抗3-NT条带的密度归一化为相应的ANT带。A是代表性印迹，B是以三份为单位进行的所有实验的平均值±SEM。#：第页与IR10相比，<0.05。

为了将L-NAME和RES对线粒体蛋白tyr-N的预防作用与IR损伤期间的心脏保护联系起来，我们监测了ONOO⁻和 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 孤立心脏在线生产。L-NAME衰减的二酪氨酸荧光（ONOO⁻)缺血期间的水平(图5B). 我们之前表明L-NAME降低了冷诱导ONOO⁻生产，但它没有改变 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 排放[24]. 因为RES干扰了DiTyr荧光信号，我们只能监测 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ DHE荧光发射。RES衰减DHE荧光( ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 在缺血期间诱导并在再灌注期间完全阻断(图5A). L-NAME和RES降低二酪氨酸/DHE荧光与再灌注期间心功能的显著改善相关(表1). 整体而言，减少 $O（运行） N个 O（运行） {O（运行）}^{-} / {O（运行）}_{2}^{• -}$ IR期间产生的蛋白酪氨酸-N降低，同时改善了再灌注后的功能恢复。

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图5

L-NAME和白藜芦醇对 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻在隔离的心脏中产生。的级别 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻如第2节所述，分别用DHE（A）和L-酪氨酸（B）在线测量。以任意荧光单位（afu）表示的DHE/二酪氨酸荧光强度在基线时归一化为零。*：第页与IR10+RES/L-NAME相比，<0.05。TC：时间控制；IR10：缺血30min，再灌注10min；RES：白藜芦醇；L-名称：NG-硝基-L-精氨酸甲酯；MW：分子量。

3.6. 白藜芦醇在体外降低rVDAC酪氨酸-N

为了验证L-NAME和RES在IR期间减弱VDAC酪氨酸-N，rVDAC与ONOO孵育⁻（0–100µmol/L），有或没有RES或L-NAME；使用抗3-NT抗体通过Western blot再次评估rVDAC tyr-N。ONOO孵化⁻导致rVDAC的tyr-N(图6A). 100µmol/L的RES可消除rVDAC的酪氨酸-N，而L-NAME（100µmol/L）则无影响。RES对ONOO的抑制作用⁻诱导的rVDAC酪氨酸-N是浓度依赖性的，因此大于10µmol/L的RES可以抑制由20µmol/L ONOO诱导的rVDC酪氨酸-N⁻(图6B). 这表明L-NAME仅在NOS存在的情况下抑制NO的生成，而RES同时清除这两种物质 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻.

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图6

L-NAME和白藜芦醇（RES）对重组（rVDAC）酪氨酸-N的抑制作用在体外.A:rVDAC与ONOO孵育⁻（0–100µmol/L），添加或不添加L-NAME（100µmol/L）或RES（100µ），并使用抗3-NT抗体进行Western blot。用VDAC抗体监测rVDAC负荷。B： 20µmol/L ONOO孵育rVDAC的Western blot分析⁻不含或含有5–100µmol/L RES和抗3-NT抗体。数值为三个实验的平均值±SEM。*：第页与未经处理的VDAC相比，<0.05。

3.7. ONOO公司⁻增强rVDAC电导

我们接下来调查了ONOO⁻将rVDAC重组为PLB后，通过记录单通道电导改变rVDAC活性。我们假设ONOO⁻是诱导rVDAC酪氨酸-N的主要物种。rVDAC表现出特征电压依赖电导(图7A)，类似于本机VDAC(图S4，右侧面板，在线补充) [37]. ONOO的影响⁻在膜电位为−10 mV的条件下，对rVDAC进行监测。在控制条件下，初级rVDAC弦电导约为1.8 nS，如18 pA的单位电流振幅所示(图7B). 当50µmol/L ONOO⁻添加后，通道活性随着多个高电导状态而增强，如−25 pA和−30 pA的电流振幅所示(图7B). 这些实验表明，50µmol/L ONOO⁻直接增强rVDAC电导。

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图7

ONOO的影响⁻关于重组（r）VDAC通道活性。A：控制条件下，rVDAC响应从−80到+80 mV的斜坡电压协议的特征电压依赖性。B：添加ONOO的效果⁻rVDAC活动。对照组和添加50µmol/L ONOO后显示电流痕迹⁻在−10 mV的膜电位下获得。在对照中，初级电导为1.8 nS。ONOO的应用⁻多重电导状态证明，触发了VDAC的增强开放。还显示了相应的所有点的幅度直方图。

4.讨论

酪氨酸-N的功能和生物后果取决于被硝化的蛋白质以及特定蛋白质中硝化的程度和位置[39]. 鉴定线粒体蛋白的酪氨酸-N应有助于确定这种dPTM在疾病状态中的潜在致病作用，并为如何以及在何处针对这些dPTM提供靶向治疗指导。尽管之前有报告[8,17]IR损伤诱导线粒体蛋白的酪氨酸-N，到目前为止，只有少数蛋白质被鉴定出来，并且没有直接证据表明VDAC硝化或特异性硝化酪氨酸残基。在这里，我们使用蛋白质组分析和IP分析来寻找在离体灌流心脏IR期间发生酪氨酸-N增强的特定蛋白质。我们发现，在IR期间，VDAC（一种关键且丰富的线粒体外膜（OMM）蛋白）是tyr-N的靶向蛋白在体外实验证实rVDAC可以被ONOO硝化⁻在任何一个⁶²Y或⁶⁷Y站点。此外，我们的结果表明rVDAC tyr-N可能引发rVDAC的齐聚反应，ONOO⁻增强rVDAC通道电导。因此，VDAC的硝化可能导致其结构和功能的改变。

为了进一步探讨酪氨酸-N诱导机制，在缺血前将RES或L-NAME灌注到离体心脏，并应用于rVDAC蛋白。在离体心脏中，RES和L-NAME均降低VDAC tyr-N，抑制ONOO的形成⁻IR后心功能改善。体外，RES，但不是L-NAME，直接阻止ONOO诱导的rVDAC的tyr-N⁻最后，在体外rVDAC的tyr-N确认体外RES确实可以清除ONOO的结果⁻总的来说，我们的研究表明VDAC tyr-N在IR损伤期间发生，并且清除 ${O（运行）}_{2}^{• -} / O（运行） N个 O（运行） {O（运行）}^{-}$ 减少NO生成可降低IR期间VDAC的tyr-N。

4.1. VDAC tyr-N的位置和功能变化

先前的研究表明，在IR损伤期间，VDAC tyr-N可能会在小鼠心脏中发生[17]，在老年老鼠心脏中[31]，以及急性烟雾吸入后大鼠海马组织中[40]. 在这些研究中，基于2-DE凝胶或抗3-NT IP蛋白混合物上抗3-NT阳性蛋白斑点的MS分析，建议将VDAC作为硝化蛋白。然而，没有直接证据表明VDAC tyr-N或ONOO抑制剂/清除剂减弱的VDAC tyl-N⁻此外，tyr-N对rVDAC通道电导的影响尚不清楚。基于我们涉及MS分析、IP和电生理学的多方面方法，我们提供了VDAC tyr-N发生在心脏IR损伤期间的确凿证据。此外，tyr-N似乎使rVDAC和ONOO齐聚⁻增加rVDAC通道电导状态。我们还新近报道，VDAC酪氨酸-N的部分预防与心功能改善有关。

蛋白质酪氨酸-N是一个选择性过程，因为并非所有蛋白质都能被硝化。蛋白质被硝化的可能性受特定蛋白质的细胞和亚细胞定位的影响[41]. 大多数硝化剂寿命很短[42,43]，因此被硝化的蛋白质必须位于ONOO位点附近⁻形成。因为NO•是一种可扩散的分子 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 扩散受限，主要产生于线粒体，ONOO⁻最有可能形成于线粒体。作为OMM中最丰富的蛋白质，VDAC很可能高度暴露于ONOO⁻因此，在红外损伤期间，VDAC很可能是ONOO攻击的容易目标⁻随后的轮胎编号为N。

我们检查了ONOO的直接功能影响⁻用ONOO处理并入PLB的rVDAC⁻发现50µmol/L ONOO⁻增强rVDAC通道活性，如多个高电导状态所示。这可能会增加代谢产物在“泄漏”OMM中的运输。较高的电导状态可能允许细胞色素的释放c（c）通过VDAC穿过OMM，与线粒体通透性转换孔（mPTP）无关。如何ONOO⁻增强VDAC通道电导尚不清楚。

尽管我们发现ONOO⁻诱导较高的rVDAC通道电导状态，但在心脏IR损伤期间，较高或较低的VDAC通道传导状态是否导致线粒体功能受损尚不确定。我们最近报道了外源性NO•对心脏VDAC的浓度依赖性双相抑制作用[37]. 峰值抑制发生在生理相关的NO•水平，这与线粒体通透性转换孔（mPTP）开放延迟有关。因此，NO诱导的mPTP开放延迟以及VDAC的低传导状态可能有助于心肌保护。这将支持我们的假设，即ONOO⁻-诱导的VDAC高电导状态对心脏功能有害，而假定的保护性NO•诱导的低电导状态有益。

很可能是ONOO⁻-诱导的VDAC tyr-N导致结构改变，因为tyr-N使中性tyr残基成为带电残基；这可能会改变VDAC的三级结构。事实上，我们发现rVDAC硝化导致其齐聚成二聚体或三聚体(图3,,6).6). 凯南[44]据报道，VDAC1的齐聚与细胞色素有关c（c）多种刺激诱导多种细胞类型的释放和凋亡。尽管我们没有直接表明VDAC tyr-N与细胞死亡有关，但我们最近的数据表明，IR诱导细胞色素的释放c（c）[45]与线粒体蛋白的tyr-N同时发生（尤其是根据我们当前的研究，VDAC）。因此，我们的研究表明VDAC tyr-N可能与线粒体介导的细胞死亡有关。

硝化目标rVDAC残留物缩小为⁶²Y或⁶⁷Y.能够产生酪氨酸-N的特定酪氨酸残基由蛋白质的结构和酪氨酸（Y）残基周围的局部环境决定[41]. 大多数酪氨酸-N残基都存在于脯氨酸或甘氨酸等诱导性氨基酸附近的环结构中[41,46]. 负电荷残基的接近，如谷氨酸或天冬氨酸，也有利于酪氨酸硝化[41,46]. 在我们的含tyr-N的肽序列中，⁶⁷Y与转诱导残基甘氨酸和负电荷残基谷氨酸相邻，很好地符合蛋白质tyr-N结构决定簇的共同特征。此外，基于对VDAC三维结构的解释，⁶⁷Y位于β_三和β₄股[47]. 因此，⁶⁷Y很可能是rVDAC中的硝化残留物，但目前⁶²不能排除Y。

4.2. IR损伤后线粒体蛋白tyr-N减少，恢复速度加快

现在有充分证据表明RNS/ROS诱导的蛋白酪氨酸-N是心脏IR损伤的关键因素[19,48]. 抑制NOS活性可降低蛋白质硝化水平和IR损伤程度[5]. 我们目前和之前的研究中，我们测量了ONOO⁻即左心室中的二Tyr荧光[24]和冠状动脉流出液[4]证明用L-NAME抑制NOS可以减弱ONOO的增加⁻IR损伤期间诱发(图5B). 为了支持这些先前的心脏研究，我们在此报道L-NAME也降低了IR诱导的线粒体蛋白tyr-N(图4A)，同时改善再灌注期间的功能恢复(表1). ONOO的二酪氨酸荧光信号快速下降⁻离体心脏再灌注的原因是流出物中游离二Tyr的冲刷。总的来说，通过减少NO生成来减少VDAC tyr-N，从而减少ONOO⁻L-NAME可能在改善IR损伤中起支持作用。

为了进一步评估线粒体蛋白酪氨酸-N在IR损伤中的作用，我们测试了RNS/ROS抑制剂/清除剂（即RES）对降低蛋白酪氨酸N和改善功能恢复的作用。RES据称具有抗炎、抗衰老、抗肿瘤和心脏保护功能[49]. RES可能直接与ONOO反应⁻充当功能性ONOO⁻食腐动物在体外从而防止或减轻ONOO⁻-诱导酪氨酸-N[50]. 虽然RES降低了低氧诱导的 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 心肌细胞中的放射物已被报道[51]，完整心脏缺血期间的RES治疗涉及清除或抑制 ${O（运行）}_{2}^{• -} / O（运行） N个 O（运行） {O（运行）}^{-}$ ，随后线粒体蛋白tyr-N减少，尚未见报道。

我们首次报道RES处理部分抑制了DHE荧光（ ${O（运行）}_{2}^{• -}$ )在缺血期间诱导，并在完整灌注心脏的再灌注期间消除，以及线粒体蛋白tyr-N减少。Goh等人[51]据报道，在离体灌流大鼠心脏中，IR期间RES治疗可减少LDH释放，改善缺血后LV功能的恢复，并增加Akt和p38MAPK活性。在我们的研究中，我们还发现，在缺血前给予RES并在缺血期间存在于心脏，可以改善IR后的心脏功能，这与Goh等人的报告一致[51]. 此外，我们的在体外rVDAC实验表明，RES可直接、完全抑制ONOO诱导的rVDAC的酪氨酸-N⁻而L-NAME没有。因此，RES可能是 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 排放物和/或ONOO清除剂⁻; 它不仅降低了IR损伤后线粒体蛋白，特别是VDAC的酪氨酸-N，而且改善了心脏收缩和舒张。尽管RES已被证明刺激NOS生成NO，但当给予预处理心脏对抗IR损伤时[43]，在我们的实验中，产生的NO•很可能转化为ONOO⁻因为丰富 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 然后导致VDAC硝化。

我们暗示ONOO⁻在很大程度上负责观察到的酪氨酸-N和ONOO的主要影响⁻是诱导酪氨酸-N。因此，我们研究的局限性在于ONOO⁻不仅可以诱导酪氨酸，还可以诱导其他芳香族残基的PTM，并且酪氨酸可以被非ONOO额外硝化⁻氧化剂，如其他亚硝酸盐和过氧化物酶。

总之，我们已经确定VDAC是在IR损伤期间经历增强tyr-N的线粒体蛋白之一。L-NAME和RES可能会减弱体外模型，但只有RES废除了ONOO⁻-诱导VDAC硝化在体外，因为可能没有no•存在。此外，L-NAME，尤其是RES对VDAC酪氨酸-N的抑制，不仅表明VDAC酪蛋白-N发生，而且还表明ONOO的减弱⁻在ONOO中产生的酪氨酸-N减少VDAC的酪氨酸-N并同时改善IR后的心功能⁻-处理后的rVDAC具有选择性和位点特异性，并伴随着rVDAC蛋白齐聚。ONOO公司⁻-经处理的rVDAC也会导致增强的通道电导状态。本研究的结果表明，VDAC可能与其他未知的线粒体tyr-N蛋白一起，在IR损伤期间介导心脏功能障碍中起着关键作用。针对特定蛋白酪氨酸-N位点的靶向可能是保护线粒体蛋白质和器官免受氧化损伤的独特方法。

补充材料

支持数据

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确认

作者衷心感谢吉姆·海斯纳（Jim Heisner）进行了隔离心脏实验，迪娜·法德尼斯（Deena Phadnis）提供了技术援助，马丁·比恩格拉贝尔（Martin Bienengraeber）博士和米莎·梅多拉（Meetha Medhora）博士对审阅这份手稿的有益评论。

资金来源

这项工作得到了美国国家卫生研究院（HL095122给AKSC，HL089514给DFS，PO1GM066730给Z.J.Bosnjak PI）、美国心脏协会（0855940G给DFS）的部分资助；和退伍军人管理局（绩效评估8204-05P至DFS）。

缩写

${O（运行）}_{2}^{• -}$	超氧化物
否•	一氧化氮
ONOO公司⁻	过氧亚硝酸盐
提尔	酪氨酸
酪氨酸-N	酪氨酸硝化
红外	缺血再灌注
IP（IP）	免疫沉淀
虚拟数据中心	电压依赖性阴离子通道
皇家经济学会	白藜芦醇
RNS公司	活性氮物种
L名称N^G公司	硝基-L-精氨酸甲酯
PTM公司	翻译后修改
玫瑰红	活性氧物种
电子不停车收费系统	电子传输链
3-北卡罗来纳州	3-硝基酪氨酸
DHE公司	二氢乙炔
二酪氨酸	二酪氨酸
LVP（LVP）	左心室压
公共后勤局	泡嵌入平面脂双层

脚注

^✩脚注：这项工作的初步报告：美国财务会计准则委员会JLB5892010；美国财务会计准则委员会J639.14, 2011; FASEB J 678.192012年。

披露

没有。

附录A补充数据

本文的补充数据可以在网上找到http://dx.doi.org/10.1016/j.bbabio.2012.06.004.

工具书类

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心脏缺血再灌注中电压依赖性阴离子通道的酪氨酸硝化：通过清除过氧亚硝酸盐减少☆

杨美英

阿马杜·卡马拉

巴萨姆·T·瓦金

周一凡

阿什什·卡迪切拉（Ashish K.Gadicherla）

魏梦国

大卫·F·斯托

关联数据

摘要

1.简介

2.方法

2.1. 隔离心脏准备和方案

2.2. 检测O（运行）2•−和ONOO−在孤立的心中

2.3. 线粒体的分离

2.4. 线粒体蛋白免疫沉淀

2.5. 双向凝胶电泳（2-DE）

2.6. 蛋白质印迹分析

2.7. 蛋白质条带的凝胶内胰蛋白酶消化

2.8. LC-MS/MS质谱法鉴定蛋白质

2.9. MALDI-TOF质谱法鉴定蛋白质

2.10. 外源ONOO诱导重组VDAC硝化−在体外

2.11. 重组rVDAC为平面脂质双层以促进通道活性

2.12. 统计分析

3.结果

3.1.O（运行）2•−和ONOO−IR损伤时离体心脏的产量增加

表1

3.2. 心脏IR损伤后线粒体蛋白tyr-N增加

3.3. 用特异性抗体和质谱鉴定tyr-N线粒体蛋白

3.4. ONOO公司−体外诱导rVDAC的酪氨酸-N

3.5. 白藜芦醇或L-NAME治疗可降低线粒体蛋白tyr-N

3.6. 白藜芦醇在体外降低rVDAC酪氨酸-N

3.7. ONOO公司−增强rVDAC电导

4.讨论

4.1. VDAC tyr-N的位置和功能变化

4.2. IR损伤后线粒体蛋白tyr-N减少，恢复速度加快

补充材料

支持数据

确认

缩写

脚注

工具书类

心脏缺血再灌注中电压依赖性阴离子通道的酪氨酸硝化：通过清除过氧亚硝酸盐减少^{^☆}

2.2. 检测 ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻在孤立的心中

2.10. 外源ONOO诱导重组VDAC硝化⁻在体外

3.1. ${O（运行）}_{2}^{• -}$ 和ONOO⁻IR损伤时离体心脏的产量增加

3.4. ONOO公司⁻体外诱导rVDAC的酪氨酸-N

3.7. ONOO公司⁻增强rVDAC电导