UPS的抑制，而非自噬，诱导TDP-43的耐洗涤剂细胞质聚集物的形成。（A） 在UPS或自噬的各种抑制剂存在下，DOX诱导48小时表达HA–TDP-43构建物诱导的稳定SH-SY5Y系的免疫细胞化学分析。单独使用时，UPS抑制剂（而非自噬抑制剂）诱导形成泛素（Ub）阳性TDP-43大聚集体（箭头）。比例尺：10µm。（B） 从转染FLAG–Ub的HEK293稳定株系中免疫沉淀HA–TDP-43 WT，然后用1µg/ml DOX单独或与3MA或MG132一起诱导24小时kDa）用3MA治疗，再用MG132治疗。变性裂解物的免疫沉淀（右）表明，与FLAG–Ub直接共价连接的HA–TDP-43仅在MG132处理后积累。IB，免疫印迹。（C） TDP-43聚集体是非淀粉样蛋白。在不存在或存在MG132的情况下，通过用DOX诱导48小时，诱导稳定的SH-SY5Y系表达HA–TDP-43构建体。在MG132处理的细胞中，硫黄素T染色检测到淀粉样聚集体，这些聚集体独立于HA–TDP-43的大聚集体（虚线）。MG132处理亲本SH-SY5Y细胞诱导了内源性（Endo）TDP-43水平低的大聚集体（虚线），可能是由于TDP-43蛋白水平的自动调节。比例尺：10µm。（D，E）通过48小时DOX诱导表达HA–TDP-43结构的稳定SH-SY5Y系的四步分馏。WT，上部白色箭头；ΔNLS，中间黑色箭头；CTF，下部黑色箭头。CTF主要溶于低盐（LS）馏分（TX，Triton X-100；Sark，sarkosyl）。请注意，每个步骤中的颗粒以不同的体积重新悬浮，以确保检测到所有部分。各组分的相对浓度为：Lys，1；LS，1；TX，0.5；萨克，3.33；尿素2.5。条形图表示按A处理的细胞的平均值±s.e.m.（F，G）溶解度分级，显示HA–TDP-43 WT（F）和ΔNLS（G）的裂解物（L）、RIPA-可溶物（R）和尿素可溶（U）分数。尿素馏分浓缩10倍。联合使用UPS和自噬抑制剂（†）增加了不溶性高分子量（HMW）TDP-43的数量，尤其是TDP-43ΔNLS（G）。3MA，3-甲基腺嘌呤；Baf，巴非霉素；环氧树脂；MG、MG132；车辆，车辆。
