跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
脑结构功能。2014; 219(2): 527–538.
2013年2月19日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/00429-013-0515-9
预防性维修识别码：PMC3933751型
PMID：23420348

K表达的地区差异+–氯−发育中大鼠皮层中的2个协同转运蛋白

克里斯蒂娜·科瓦奇,1 考斯特夫·巴苏,2 伊莎贝尔·鲁伊勒,2和阿提拉·西克通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

2型氯化钾协同转运蛋白（KCC2）是中枢神经系统神经元细胞内氯离子浓度的主要调节因子，在脊椎发育过程中起着关键作用，而这与其离子协同转运功能无关。KCC2的表达模式在出生后的发育过程中上调，表现出不同脑区的区域和层次特异性差异。我们在出生后的前两周检查了KCC2在发育中的新皮质和古皮质不同区域的区域和超微结构定位。光镜检查显示出生时梨状皮质和内嗅皮质中弥漫的神经膜和离散的漏斗状树突标记。随后，在出生后的第一周开始，弥漫性KCC2标记逐渐开始出现在新皮质的浅层，而梨状、内嗅和嗅周皮质的树突点状标记更加明显。出生后第一周结束时，KCC2的离散树突状表达在所有新皮质和古皮质区域可见。在出生后的第二周内，表达水平没有变化，这表明与海马相比，皮质细胞中KCC2的成人模式在出生后第一周结束时已经建立。定量电子显微镜检查显示，在新皮层和古皮层的表层，KCC2信号主要与质膜相关，但运输囊泡相关免疫信号的数量随着发育而增加。在深层，KCC2免疫标记物均匀分布于质膜和运输囊泡中，随成熟无明显变化。树突棘中KCC2免疫金颗粒数量增加，与突触无关。这一观察结果表明KCC2在脊椎发生和离子协同转运中具有双重作用。

关键词：发育、细胞内氯稳态、KCC2、新皮质、古皮质、脊椎发生、抑制

介绍

中枢神经系统（CNS）中的快速超极化抑制由配体门控阴离子通道（即GABA）介导一和甘氨酸受体），主要由Cl携带的门控电流−HCO的影响较小三 −（法兰特和凯拉2007; 凯拉1994). GABA的作用一甘氨酸受体高度依赖于细胞内氯离子浓度（[Cl−]我). 在成人大脑中，绝大多数神经元具有低[Cl−]我产生Cl−通道开放期间的内流和随后的细胞超极化（Eccles1966; 凯拉1994). 在未成熟大脑的几个区域，如海马体、听觉皮层、小脑、下橄榄或病理状态下（Owens等人。1996; Cohen等人。2002; Kahle等人。2008; Papp等人。2008; Blaesse等人。2009)，由于高[Cl−]我GABA的激活一-或甘氨酸受体导致Cl向外流动−使细胞去极化（Cherubini等人。1991; Ehrlich等人。1999; Zhang等人。1990). 保持静止Cl−平衡电位比静息膜电位更负需要Cl−突触后细胞的挤压机制（汤普森和加韦勒1989). 阳离子氯化物共转运蛋白，包括Na+–K（K）+–2Cl−共转运体（NKCC）和K+–氯−共转运体（KCC）在[Cl的调节中起关键作用−]我在神经系统中（Hiki等人。1999; Race等人。1999; Delpire和Mount2002; Payne等人。2003; Mercado等人。2004). 氯化钾共转运体2（KCC2），只存在于神经元细胞中，负责[Cl−]我通过持续运输K实现体内平衡+和Cl−细胞外（Rivera等人。1999; Payne等人。1996; Lu等人。1999; DeFazio等人。2000).

在神经元发育期间，[Cl−]我从胚胎期到出生后早期显著减少。几行证据表明GABA一-出生后第一周海马锥体神经元介导的兴奋（Cherubini等人。1991; Ben-Ari等人。1989; Gulyas等人。2001)大约在产后第二周开始时消失。GABA的个体发生变化一-[Cl减少引起的受体反应−]我归因于KCC2的发育上调（Williams等人。1999; Rivera等人。1999; DeFazio等人。2000). 尽管最近的研究表明GABA的兴奋作用对于皮层神经元的正常成熟是必要的（Hubner等人。2001; Stein等人。2004; Cancedda等人。2007)，关于出生后早期发育期间KCC2的皮质分布信息有限（Takayama和Inoue2010).

KCC2在树突棘的发育中起着重要作用，突触发生和KCC2的过早表达诱导皮层神经元的棘密度增加（Fiumelli等人。2012; Cancedda等人。2007; Horn等人。2010). 最近有人假设，KCC2和肌动蛋白细胞骨架之间的相互作用在发育中的皮层回路的活动依赖性组装过程中起着重要作用，并对大脑可塑性产生功能性影响（Fiumelli等人。2012). 由于KCC2在围生期具有双重功能（离子共转运独立性突触发生和离子共转运），因此了解出生后早期大脑皮层KCC2的表达模式非常重要。

在本研究中，我们检测了KCC2在发育中大鼠大脑不同皮层区域的表达，并使用光镜和电镜分析与海马KCC2表达模式进行了比较。由于之前的研究（即Rivera等人。1999)显示到出生后第二周KCC2表达达到最大水平，我们的研究仅限于这一时期。

材料和方法

动物

20只幼年大鼠（出生后第P0天、第P2-P6天、第12-15天；每个年龄研究2只动物）要么用氯苯丁醇（0.3 mL/100 g体重）深度麻醉，要么冷却，然后用0.9%生理盐水心内灌注，然后用4%多聚甲醛、，和0.05%戊二醛溶于磷酸盐缓冲液中（PB，pH=7.2，0.1 M）。固定后，使用振动棒切割60μm厚的冠状切片。在PB中进行大量清洗后，将切片浸入含25%蔗糖和10%甘油的0.1 M PB混合物中，并在液氮中冻融，以增加免疫染色期间抗血清的渗透性。所有实验均按照国家卫生研究所的指导原则进行。

KCC2的免疫过氧化物酶反应

在每一步之间，在50 mM Tris缓冲盐水（TBS，pH=7.4）中清洗切片三次，每次30分钟，并在TBS中用2%w/v牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）封闭45分钟。然后，用针对KCC2的一级抗体（兔抗KCC2抗血清，1:500）在4°C下孵育2天（Williams等人。1999; Gulyas等人。2001)然后在TBS中使用二级抗体（生物素化山羊抗兔IgG，1:300，4 h，Vector Laboratories），然后与亲和素-生物素复合物（ABC，1:400，Vectors Laboratory）孵育3 h。在TBS中多次洗涤后，使用3′3-二氨基联苯胺四氢氯化物（DAB，Fluka Sigma-Aldrich，Tris中0.05%w/v）进行免疫过氧化物酶反应，镍（Wouterlood1988)作为色原和0.01%v/v H2O（运行）2作为氧化剂。切片用1%OsO处理4在分级乙醇（70%v/v乙醇，含1%w/v乙酸铀酰）和丙氧基中脱水1h，并嵌入Durcupan（Fluka Sigma-Aldrich）中。

KCC2预包埋免疫染色

为了揭示KCC2的亚细胞分布，在获得初级抗血清后，将切片在含有山羊抗兔IgG的TBS中孵育，并将其与1 nm金颗粒（英国阿默沙姆）在4°C下以1:50稀释过夜。然后，用PB清洗组织，在1%v/v戊二醛溶液中固定10分钟，并在增强调节溶液中清洗三次10分钟（Aurion Immunoresearch，Wageningen，荷兰）。最后，用R-Gent银强化溶液（Aurion）强化金颗粒。在免疫金反应结束时，将切片培养在0.5%v/v O中秒O（运行）4在4°C下保持30分钟，并如上所述脱水和包埋。感兴趣的区域被重新嵌入，并在50 nm的切片中连续切片。超薄连续切片收集在formvar涂层单缝铜格栅上，柠檬酸铅复染。

为了揭示KCC2的相对分布，采集了内嗅、梨状和体感皮层的样本。在从预包埋免疫染色光镜切片的表面（最大2μm）切下的超薄切片中检查免疫金颗粒的亚细胞定位。

使用配备Gatan CCD相机的Tecnai 12电子显微镜拍摄电子显微照片。使用配备EXi Blue（QImaging，英国）数码相机的奥林巴斯BX61显微镜分析含有DAB标记的切片。使用Image Pro 7（美国媒体控制论）软件对图像进行分析。

结果

KCC2蛋白在皮层中的分布

为了揭示新皮层和古皮层KCC2表达的年龄依赖性变化，我们研究了不同发育阶段（P0、P2-6和P12-15）KCC2的表达模式。在新生动物（P0）中，在古骨门中存在弥漫性神经纤毛染色和强烈的离散树突标记，已经显示出区域和层特异性模式（图1a） ●●●●。在可能属于锥体细胞的躯体和树突的内嗅和梨状皮质中观察到广泛的标记。KCC2在第1层表达最密集，其次是中间层。在内嗅皮层中，可以看到来自中间层的成束标记强烈的树突，并在浅层形成漏斗状树突树状结构的巢穴标记（图1a1–a3）。在其他皮层区域（如体感、听觉、运动皮层），除了第1层有微弱的神经纤维标记外，KCC2没有表达（图1a4）。在发育早期（P3），内嗅和梨状皮质被大量标记（图2b） ●●●●。KCC2最显著的表达位于第1层，可能是锥体细胞的局部抑制细胞和顶端树突集中的地方。在这个年龄段，第1层的弥散标记开始出现在嗅周和嗅内皮质以及体感、听觉和运动皮质。与P0动物相似，在内嗅皮质和嗅周皮质的浅层观察到可能属于锥体细胞的树突状簇的强标记斑块。此外，第5层锥体细胞的细长锥体状体和粗顶端树突也很明显（图1b1–b3）。主要在细胞体周围同一层树状的基底树突也被广泛标记。第6层可见扩散免疫标记。梨状皮层浅层树突状标记致密；然而，在P0和P3的内嗅皮层中，它更均匀，缺乏斑片状外观。在P4时，几乎所有皮层区域都存在第1层的强扩散免疫染色（图2a） ●●●●。在感觉（体感、听觉）和运动皮层中，巢穴标记被垂直排列的顶端树突束及其漏斗状树突树突分支分开（图2a4）。古皮层（内嗅皮层和梨状皮层）显示出与P3相似的树突和体细胞标记（图2a1–a3）。在P5，内嗅皮质和梨状皮质中可见大量神经元的离散高尔基样树突状和体细胞标记，无弥散神经纤维染色（图2b1–b3）。在体感和运动皮层中，锥体细胞树突束在第2/3层和第1层更为明显。此外，在可能属于锥体细胞基底树突的颗粒上和颗粒下层中观察到微弱的弥散染色（图2b4）。出生后第一周结束时，在P6左右，KCC2的皮质表达达到P14动物的整体染色模式（图三a） ●●●●。在P13，表达在新和古动物界的所有层中变得更加扩散（图三b） ●●●●。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig1_HTML.jpg

KCC2在大鼠古皮层和新皮层的发育表达P0（P0）和第3页.一强烈的树枝状标记已经在P0（P0）梨状的(皮尔，a1)，内鼻的(Ent，a2型)和鼻腔周围(佩里，a3)皮层，尤其是表层。在体感皮层(索姆，a4)仅可见微弱弥漫的免疫反应。b条在第3页，KCC2免疫信号在梨状肌中的分布相似(b1号机组)，内嗅的(b2型)和鼻腔周围(b3号机组)皮质区，尽管在深层（3-6）可以观察到比在P0（P0）免疫染色开始出现在新皮质区的表层(b条)比如体感皮层(b4号机组). 延长的锥体状体和粗的顶端树突表示为箭头.比例尺:一,b条：500微米；a1–a4：50微米；b1–b4：50微米

保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig2_HTML.jpg

KCC2在大鼠古皮层和新皮层的发育表达第4页和第5页.一在第4页，古皮层和新皮层都有明显的KCC表达。梨状肌信号强度增加(a1级)，内鼻的(a2类)和鼻周皮质(a3类)尤其是在第3-6层。免疫标记在体感区更均匀(a4类)但在第1层有较强的KCC2表达。请注意a1–a3但不在a4类.b条在第5页梨状肌的信号强度相似(b1号机组)，内鼻的(b2型)和鼻腔周围(b3号机组)皮层，而在体感皮层免疫信号增加(b4号机组)漏斗状顶端树突标记更加明显。Ent公司内嗅皮层，佩里嗅周皮层，皮尔梨状皮质，索姆躯体感觉皮层。比例尺:一,b条：500微米，a1–a4：50微米；b1–b4：50微米

保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig3_HTML.jpg

KCC2在大鼠古皮层和新皮层的发育表达第6页和第13页.一已经在第6页，KCC2标记存在于所有皮层区域，在所有皮层层显示出强烈的树突状标记(a1–a4).b条信号强度和KCC2表达模式在第13页(b1–b4).Ent公司内嗅皮层，佩里嗅周皮层，皮尔梨状皮质，索姆躯体感觉皮层。比例尺 一,b条500微米，a1–a450微米；b1–b4100微米

发育中皮层KCC2的超微结构定位

新生皮质细胞中KCC2的存在已在出生后早期被报道。P0大鼠的原位杂交检测到了低到中等水平的信号，进一步的发育增加到P14（Clayton等人。1998). 上述技术能够检测组织中KCC2的基因表达，但无法提供有关蛋白质表达和蛋白质精确亚细胞定位的信息。因此，在我们的下一部分研究中，我们使用免疫金电镜技术重点研究KCC2蛋白的细胞表面分布。由于KCC2在新皮层和古皮层中的表达模式不同，并且在光镜下浅层标记与深层标记显示出显著差异，因此我们研究了KCC2在这些区域的亚细胞分布。在古皮层，出生后早期P2免疫金颗粒主要定位于树突状质膜；然而，它们也经常与运输囊泡膜有关（图4). 在P6，树突状质膜和内膜结构中发现银强化免疫金颗粒。与P3类似，在兴奋性或抑制性突触附近没有明显的积累。出生后第一周后，KCC2金颗粒的超微结构定位在性质上与P12的模式相似。免疫金颗粒见于树突的质膜中，很少见于体细胞，也见于运输膜上。在新皮质中，我们观察到免疫金分布与古皮质相似。大多数金颗粒与质膜相关，但在运输囊泡上观察到大量金信号。虽然偶尔在树突棘中发现免疫金，但无法确定与突触的明显关联。有趣的是，在脊柱头部很少发现描绘KCC2蛋白亚细胞表达的银强化金颗粒（图5e） ●●●●。如上所述，KCC2通常在运输囊泡或质膜中观察到，但偶尔在树突棘附近观察到（图5a） ●●●●。在P12，当脊椎数量较多时，免疫金信号定位于与内质网相关的脊椎颈部（图5b–d）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig4_HTML.jpg

发育中皮层KCC2的超微结构定位。一,b条电子显微照片显示免疫金颗粒在内嗅皮层的分布第3页在树突质膜中经常观察到银强化的金颗粒(黑色箭头)和运输囊泡(打开的箭头). 注意KCC2标记与突触前或突触后膜无关(双箭头).c（c）,d日KCC2在树突状轴树突状质膜和树突状体感皮层运输小泡中的亚细胞定位第06页.e、 （f）在P12，梨状皮层中，免疫金颗粒主要存在于树突状质膜和运输囊泡中，但不存在于突触周围。d日枝晶，秒脊椎，星号突触前终末。比例尺 一2微米，b–f1微米

保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig5_HTML.jpg

KCC2不定位于大脑皮层的脊椎头部第12页老鼠。一显示免疫金颗粒在树突质膜中分布的电子显微照片(黑色箭头)和运输囊泡(打开箭头). 树枝状棘(秒)接收兴奋性突触(双箭头)未标记。突触前终末描述为星号.b–d段当在脊柱中观察到免疫金信号时，在与内质网相关的脊柱颈部发现了免疫金信号(箭头).打开箭头描述运输囊泡中的金颗粒。e（电子）在极少数情况下，在脊椎头部观察到银强化金颗粒。d日枝晶，秒脊椎，星号突触前终末。比例尺1微米

为了更好地了解KCC2的可能功能，我们量化了免疫金信号在古皮层和新皮层中的分布（表1). 在内嗅皮层的浅层（第一层和第二层）中，大多数金颗粒在P0时出现在质膜上，只有22.8%与运输小泡有关。随着发育，该比率发生了变化，在P12，在运输囊泡上发现了47.3%的金颗粒（图6a） ●●●●。早期树突状棘很少观察到免疫金信号（P0时为1%），P12时增加到10%以上（图6a；表1). 在内嗅皮层深层，质膜/转运泡相关免疫信号比率与表层不同。虽然与表层一样，随着发育，运输囊泡相关的金颗粒数量增加（P2:53.5%；P12:66.8%），但总的来说，在质膜上发现金信号的频率较低。在深层中，刺中的金颗粒比表层中的更少，在P12处仅达到2.8%（图6b；表1).

表1

定量EM研究中分析的金颗粒的百分比和数量

P0（P0）第2页第3页第4页第6页第12页
Ent公司索姆Ent公司索姆Ent公司索姆Ent公司索姆Ent公司索姆Ent公司索姆
S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类 S公司 D类
质膜（%）77.2–––76.746.584.9–66.63569–61.740.265.743.166.733.761.64952.733.258.248.4
运输囊泡（%）22.8–––23.353.515.1–33.46531–38.359.834.356.933.366.338.45147.366.841.851.6
脊椎（%）和n个 1 (1)–––3.3 (4)02.7 (2)–1.8 (6)0.6 (1)21 (6)–2.1 (3)1.6 (2)5.1 (5)1.6 (5)2.9 (9)1.5 (5)5.9 (19)1.9 (8)10.3 (17)2.8 (6)13.4 (26)2.7 (10)
颗粒数量101–––1204373–338157287–14112299311315332323431165217194366
保存图片、插图等的外部文件。对象名为429_2013_515_Fig6_HTML.jpg

定量分析KCC2免疫信号在古皮层和新皮层中的亚细胞分布。在两个内鼻的浅层(一)和躯体感觉(c（c）)皮质中，运输囊泡相关免疫金颗粒的数量随着成熟而增加。在深层(b条,d日)我们没有发现类似的增长。在所有层和区域中，树突棘中的免疫金颗粒数量随着年龄的增长而增加。赖特 Y（Y）图表的轴表示脊椎中免疫金颗粒的百分比

在体感皮层中，深层的P0和P2几乎没有KCC2表达，因此未对P0样本以及深层的P2和P3进行定量EM研究。与古皮层相似，在P3（69%），质膜标记在表层占主导地位，随着成熟，运输囊泡相关标记增加（P3:31%；P12:41.8%）。在深层，运输囊泡和质膜相关免疫金颗粒的分布大致相同（图6; 表1). 与古皮层相似，脊椎表层的免疫信号比率随着年龄的增长而增加，达到13.4%。每当我们发现靠近不对称或对称突触的金粒子时，我们都会测量到突触边缘的距离。平均距离在0.13至0.47μm之间变化，标准偏差较大（0.07–0.33μm）。

讨论

在这项研究中，我们检测了KCC2在发育中的大鼠大脑中的细胞和亚细胞表达模式。我们的光镜和电镜免疫组化分析显示KCC2蛋白具有明显的区域特异性分布和年龄相关性增加。首先在新皮质的基底部（梨状皮质和内嗅皮质）检测到强烈的KCC2标记。在新生动物的表层，树突和体细胞标记明显。在发育过程中，KCC2的表达逐渐增加，出生后第一周达到成年模式。相反，在新皮质区，P0动物没有免疫染色，只有在P3后才出现第1层的弥散标记。信号强度随着年龄的增长而增加，并且可以看到可能来源于2-3层和5层锥体细胞的漏斗状树突标记。与古皮层类似，可检测到与年龄相关的蛋白质表达增加，P6无法将信号强度与青春期（P15）区分开来。

KCC2表达与端脑发育相关

我们的神经解剖学观察结果与之前使用原位杂交、Western和Northern杂交、核糖核酸酶保护分析和电生理技术进行的研究一致（Clayton等人。1998; Rivera等人。1999; Lu等人。1999; 福田等人。1998; DeFazio等人。2000). 发育研究指出，中枢神经系统KCC2表达的个体发育与神经元成熟相一致，遵循尾-嘴模式（Li等人。2002; Stein等人。2004). KCC2蛋白首先在胚胎发育期间的脊髓有丝分裂后神经元和皮层下神经元中检测到，然后在高级大脑结构中逐渐增加（Stein等人。2004; Wang等人。2002). 有趣的是，在出生时，脊髓和脑干中已经建立了成人蛋白质水平。在皮层神经元中，KCC2的表达从出生前开始，出生后增加（Stein等人。2004; Wang等人。2002). 一般来说，当一个特定的未成熟神经元到达其在皮层的最终位置时，就可以检测到KCC2 mRNA。在小脑中，已经在E12检测到KCC2转录物，这是小脑神经元轴突延伸形成的发育阶段（Hatten等人。1997). 在大脑皮层的基础老部分，如梨状皮层，E13和E16之间产生神经元，同时也报告了KCC2转录物的强烈信号（Clayton等人。1998). KCC2的表达与皮质神经元的分化平行增加。出生后即刻，古皮层区域的特征是在表层出现强烈的体细胞和树突状标记（P0）。据推测，梨状体、内嗅皮质中的树突顶端被KCC2强烈染色。新皮质神经元在E14开始分化较晚，在E20左右完成神经生成（拜耳1980,1986). 在E15.5皮层的蛋白质印迹分析中已经检测到微弱的KCC2蛋白信号，在E18.5进一步增加。然而，在E18.5时，mRNA的表达主要局限于梨状皮质，在P3周围的新皮质区首先可见微弱信号，P7显著增强了该信号（Stein等人。2004). 我们发现新皮质中KCC2的表达与以前的免疫组化研究一致（Stein等人。2004; Clayton等人。1998; Wang等人。2002; Takayama和Inoue2010). 一般来说，在大鼠新皮质的感觉区P3和P4开始出现弥散标记。与之前的报道类似，在进一步发育过程中，观察到整个新皮质KCC2表达增加，并在出生后第一周达到成人水平。这些观察结果可能解释为什么GABA一-受体激动剂在新生儿脑干癫痫中很有用，但只能在晚年控制中枢神经系统嘴侧部分的癫痫发作。

与海马体类似，新皮层也表现出KCC2蛋白水平的发育增加，尽管后者在出生后第一周左右就已经达到了成年表达模式（Gulyas等人。2001; Wang等人。2002; Stein等人。2004; Takayama和Inoue2010). 有趣的是，KCC2在发育过程中的表达模式可能在不同物种之间发生变化。KCC2 mRNA在胚胎期E42已经大量存在于豚鼠海马体中，并且在出生后发育期间没有显著上调（Rivera等人。1999).

KCC2的亚细胞定位

电镜观察显示，在发育早期，KCC2不仅定位于运输小泡，而且主要定位于树突状质膜。与海马相比（Gulyas等人。2001)随着年龄的增长，KCC2-免疫活性转运小泡逐渐减少，在新皮质和古皮质的表层，转运小泡相关免疫金颗粒的数量稳步增加。这一发现表明，在皮层细胞中，KCC2的合成和向质膜的转运在发育过程中增加。对观察结果的另一种解释是树突质膜中KCC2循环增加。在深层，我们没有观察到类似的趋势，并且在转运小泡中发现了大部分KCC2免疫信号，可能是因为在深层中，我们分析了更多的体细胞，在体细胞浆中发现了许多免疫金颗粒，而在质膜上很少。

在海马体中，KCC2在兴奋性突触附近高度表达，可能与突触外GABA接近一受体（Gulyas等人。2001; Baldi等人。2010). 此外，在丘脑中继细胞中，还发现KCC2与皮层传入形成的不对称突触密切相关（Bartho等人。2004). 与之前的观察相反，在皮层中，KCC2似乎与抑制性或兴奋性突触无关。虽然在树突棘中观察到了免疫金颗粒，但大多数情况下，我们在脊柱器械或靠近脊柱颈部的地方观察到了它们。虽然我们在棘的质膜上发现了金颗粒，但它们是从突触随机分布的。随着脊髓成熟KCC2信号的增加，提示KCC2在围生期的主要作用是脊髓发生。或者，皮层细胞中KCC2的功能是降低细胞内Cl−浓度独立于抑制性突触传入的兴奋性，而不是参与海马体低渗肿胀的体积调节控制（Gulyas等人。2001).

功能含义

我们的光镜和定量电镜观察支持了KCC2蛋白在出生后大鼠大脑中受发育调控的观点。我们发现，这种表达在出生时较低，在皮层发育过程中以神经元和层特异性的方式增加。KCC2蛋白的发育上调与大鼠中枢神经系统GABA信号的改变有关（Ben-Ari等人。1989; Zhang等人。1990; Wu等人。1992; Owens等人。1996). 高[Cl−]我已经从许多大脑结构中的未成熟神经元中证明（Owens等人。1996; Hara等人。1992; 罗尔布和斯皮策1996). 因此，在出生后早期，GABA一-发现介导的反应是去极化的（Ben-Ari等人。1989). 出生后第一周结束时，在新皮质和海马中观察到逐渐向超极化反应转变（Rivera等人。1999; Cherubini等人。1991; Owens等人。1996; Dammerman等人。2000; Yamada等人。2004). 这是我们发现成人表达模式在新皮质中建立的时期。高[Cl的潜在机制−]我在胚胎成神经细胞和新生神经元中仍没有完全阐明。两种对抗性的工作机制，活性内向氯离子的存在−转运机制（NKCC）和有效氯的缺乏−牵涉到挤压系统（KCC2）。已经报道了两个共转运体的互补表达模式（Wang等人。2002; Clayton等人。1998). 在出生后早期发育期间，随着NKCC1表达减少，KCC2表达增加。我们在新皮质和古皮质中观察到的KCC2表达的发育时间很可能解释了Cl的成熟变化−出生后生活中的体内平衡和GABA功能。缺少KCC2的皮层神经元显示细胞内Cl受损−法规（Zhu等人。2005)证明KCC2对Cl至关重要−成熟皮层神经元的内稳态。

最近的研究强调了KCC2在形态成熟中的重要性（Cancedda等人。2007)和脊柱密度调节（Fiumelli等人。2012)皮层神经元。有趣的是，离子转运功能对脊椎的形成来说不是必需的，重要的一步是KCC2与树突状细胞骨架的相互作用（Fiumelli等人。2012; Li等人。2007; Horn等人。2010). 根据最近的观察结果，我们发现KCC2蛋白的很大一部分与质膜无关，而是定位在细胞质中。我们的发现为KCC2的双重作用提供了超微结构证实：质膜相关KCC2可能调节Cl−稳态，而在细胞质中，它在自旋和突触发生中发挥作用，这与蛋白质的共转运功能无关。

致谢

作者感谢凯·凯拉博士对手稿的批判性阅读。这项工作由加拿大卫生研究院（MOP 81105）、人类前沿科学基金会（RGY-0073/2006）和医学研究理事会（G1001235）向A.S。

工具书类

  • Baldi R，Varga C，Tamas G.KCC2沿海马主细胞轴-体-树突状轴的差异分布。欧洲神经病学杂志。2010;32(8):1319–1325. doi:10.1111/j.1460-9568.2010.7361.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bartho P，Payne JA，Freund TF，Acsady L.KCl共转运体KCC2在丘脑中继核和网状核中的差异分布。欧洲神经病学杂志。2004;20(4):965–975. doi:10.1111/j.1460-9568.2004.03562.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 拜耳公司。大鼠海马区的发育。I.用3H-胸腺嘧啶核苷放射自显影检查神经发生。《计算机神经学杂志》。1980;190(1):87–114. doi:10.1002/cne.901900107。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 拜耳公司。大鼠初级嗅皮层的神经发生。国际神经科学发展杂志。1986;4(3):251–271. doi:10.1016/0736-5748（86）90063-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ben Ari Y、Cherubini E、Corradetti R、Gaiarsa JL。未成熟大鼠CA3海马神经元的巨大突触电位。生理学杂志（伦敦）1989;416:303–325. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Blaesse P、Airaksinen MS、Rivera C、Kaila K.阳离子氯协同转运蛋白和神经元功能。神经元。2009;61(6):820–838. doi:10.1016/j.neuron.2009.03.003。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cancedda L，Fiumelli H，Chen K，Poo MM。兴奋性GABA作用对体内皮层神经元的形态成熟至关重要。神经科学杂志。2007;27(19):5224–5235. doi:10.1523/JNEUROSCI.5169-06.2007。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cherubini E、Gaiarsa JL、Ben-Ari Y.GABA：出生后早期的兴奋性递质。《神经科学趋势》。1991;14(12):515–519. doi:10.1016/0166-2236（91）90003-D。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Clayton GH、Owens GC、Wolff JS、Smith RL。阳离子-Cl的Ontogeny−大鼠大脑皮层共转运体的表达。大脑研究开发大脑研究。1998;109(2):281–292. doi:10.1016/S0165-3806（98）00078-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Cohen I，Navarro V，Clemenceau S，Baulac M，Miles R.关于体外人类颞叶癫痫发作间期活动的起源。科学。2002;298(5597):1418–1421. doi:10.1126/science.1076510。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Dammerman RS、Flint AC、Noctor S、Kriegstein AR。发育新皮质层1中的兴奋性GABA能神经丛。神经生理学杂志。2000;84(1):428–434.[公共医学][谷歌学者]
  • DeFazio RA、Keros S、Quick MW、Hablitz JJ。钾偶联氯离子共转运控制大鼠新皮质锥体神经元的细胞内氯离子。神经科学杂志。2000;20(21):8069–8076. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Delpire E，Mount DB。与氯离子共转运缺陷相关的人类和小鼠表型。《生理学年鉴》。2002;64:803–843. doi:10.1146/annurev.physiol.64.081501.155847。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 埃克尔斯JC。兴奋性和抑制性突触作用的离子机制。Ann N Y科学院。1966;137(2):473–494. doi:10.1111/j.1749-6632.1966.tb50176.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Ehrlich I，Lohrke S，Friauf E.大鼠听觉神经元中甘氨酸从去极化到超极化的转变是由于年龄依赖性氯离子调节。生理学杂志。1999;520（第1部分）：121–137。doi:10.1111/j.1469-7793.1999.00121.x。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Farrant M，Kaila K。GABA（A）受体信号的细胞、分子和离子基础。大脑研究进展。2007;160:59–87. doi:10.1016/S0079-6123（06）60005-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Fiumelli H，Briner A，Puskarjov M，Blaesse P，Belem BJ，Dayer AG，Kaila K，Martin JL，Vutskits L（2012）阳离子氯协同转运蛋白KCC2在体内树突棘发生中的离子转运非依赖性作用。大脑皮层（出版中）[公共医学]
  • Fukuda A、Muramatsu K、Okabe A、Shimano Y、Hida H、Fujimoto I、Nishino H。细胞内Ca2的变化+由GABAA受体激活和Cl还原诱导−新生大鼠大脑皮层梯度。神经生理学杂志。1998;79(1):439–446.[公共医学][谷歌学者]
  • Gulyas AI、Sik A、Payne JA、Kaila K、Freund TF。KCl协同转运蛋白KCC2在大鼠海马兴奋性突触附近高度表达。欧洲神经病学杂志。2001;13(12):2205–2217. doi:10.1046/j.0953-816x.2001.01600.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hara M、Inoue M、Yasukura T、Ohnishi S、Mikami Y、Inagaki C。细胞内Cl分布不均匀−在大鼠海马神经元中。神经科学快报。1992;143(1–2):135–138. doi:10.1016/0304-3940（92）90250-B。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hatten ME、Alder J、Zimmerman K、Heintz N.小脑细胞规范和分化相关基因。神经生物电流。1997;7(1):40–47. doi:10.1016/S0959-4388（97）80118-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hiki K、D'Andrea RJ、Furze J、Crawford J、Woollatt E、Sutherland GR、Vadas MA、Gamble JR。新型人类K蛋白的克隆、表征和染色体定位+–氯−共同运输人。生物化学杂志。1999;274(15):10661–10667. doi:10.1074/jbc.274.15.10661。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Horn Z，Ringstedt T，Blaesse P，Kaila K，Herlenius E。胚胎小鼠中KCC2的过早表达通过离子转运诱导依赖机制干扰神经发育。欧洲神经病学杂志。2010;31(12):2142–2155. doi:10.1111/j.1460-9568.2010.07258.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Hubner CA、Stein V、Hermans-Borgmeyer I、Meyer T、Ballanyi K、Jentsch TJ。KCC2的破坏揭示了K–Cl协同转运在早期突触抑制中的重要作用。神经元。2001;30(2):515–524. doi:10.1016/S0896-6273（01）00297-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kahle KT、Staley KJ、Nahed BV、Gamba G、Hebert SC、Lifton RP、Mount DB。阳离子-氯离子协同转运蛋白在神经系统疾病中的作用。国家临床实践神经学。2008;4(9):490–503. doi:10.1038/ncpneuro0883。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kaila K.神经系统中GABAA受体通道功能的离子基础。神经生物学进展。1994;42(4):489–537. doi:10.1016/0301-0082（94）90049-3。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Li H，Tornberg J，Kaila K，Airaksinen MS，Rivera C.胚胎啮齿动物中枢神经系统发育过程中氯离子协同转运蛋白的表达模式。欧洲神经病学杂志。2002;16(12):2358–2370. doi:10.1046/j.1460-9568.2002.02419.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Li H、Khirug S、Cai C、Ludwig A、Blaesse P、Kolikova J、Afzalov R、Coleman SK、Lauri S、Airaksinen MS、Keinanen K、Khiroug L、Saarma M、Kaila K、Rivera C。KCC2与树突细胞骨架相互作用，促进脊柱发育。神经元。2007;56(6):1019–1033. doi:10.1016/j.neuron.2007.10.39。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lu J，Karadsheh M，Delpire E.出生后大鼠脑中K-Cl协同转运蛋白KCC2神经特异性亚型的发育调节。神经生物学杂志。1999;39(4):558–568. doi:10.1002/（SICI）1097-4695（19990615）39:4<558:：AID-NEU9>3.0.CO；2-5.[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mercado A，Mount DB，Gamba G.中枢神经系统中的电中性阳离子-氯化物协同转运子。神经化学研究。2004;29(1):17–25. doi:10.1023/B:NERE.0000010432.44566.21。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Owens DF、Boyce LH、Davis MB、Kriegstein AR。通过革兰菌素穿孔贴片记录和钙成像证明胚胎和新生儿皮质切片中的兴奋性GABA反应。神经科学杂志。1996;16(20):6414–6423. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Papp E，Rivera C，Kaila K，Freund TF。短暂前脑缺血后海马神经元易损性与氯化钾协同转运蛋白2免疫反应性之间的关系。神经科学。2008;154(2):677–689. doi:10.1016/j.neuroscience.2008.03.072。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Payne JA、Stevenson TJ、Donaldson LF。大鼠脑中假定的K–Cl协同转运蛋白的分子特征。一种神经特异性亚型。生物化学杂志。1996;271(27):16245–16252. doi:10.1074/jbc.271.27.16245。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Payne JA、Rivera C、Voipio J、Kaila K.神经沟通、发育和创伤中的氯离子共转运体。《神经科学趋势》。2003;26(4):199–206. doi:10.1016/S0166-2236（03）00068-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Race JE、Makhlouf FN、Logue PJ、Wilson FH、Dunham PB、Holtzman EJ。新型K–Cl共转运蛋白KCC3的分子克隆和功能表征。美国生理学杂志。1999;277（6第1部分）：C1210–C1219。[公共医学][谷歌学者]
  • Rivera C、Voipio J、Payne JA、Ruusuvuori E、Lahtinen H、Lamsa K、Pirvola U、Saarma M、Kaila K、The K+/氯离子−共转运体KCC2在神经元成熟过程中使GABA超极化。自然。1999;397(6716):251–255. doi:10.1038/16667。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Rohrbough J，Spitzer NC.细胞内氯离子的调节−Na（+）依赖Cl的水平−共传递区分脊髓神经元中去极化和超极化GABAA受体介导的反应。神经科学杂志。1996;16(1):82–91. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stein V，Hermans-Borgmeyer I，Jentsch TJ，Hubner CA。KCl共转运体KCC2的表达与神经元成熟和低细胞内氯化物的出现平行。《计算机神经学杂志》。2004;468(1):57–64. doi:10.1002/cne.10983。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Takayama C，Inoue Y.出生后小鼠体感皮层氯化钾共转运体2（KCC2）、GABA和囊泡GABA转运体（VGAT）的发育定位。神经科学研究。2010;67(2):137–148. doi:10.1016/j.neures.201.02.010。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Thompson SM，Gahwiler BH.活动依赖性去抑制。二、。细胞外钾、速尿和膜电位对ECl的影响−海马CA3神经元。神经生理学杂志。1989;61(3):512–523.[公共医学][谷歌学者]
  • Wang C、Shimizu-Okabe C、Watanabe K、Okabe A、Matsuzaki H、Ogawa T、Mori N、Fukuda A、Sato K。大鼠大脑中KCC1、KCC2和NKCC1 mRNA表达的发育变化。大脑研究开发大脑研究。2002;139(1):59–66. doi:10.1016/S0165-3806（02）00536-9。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Williams JR、Sharp JW、Kumari VG、Wilson M、Payne JA。神经元特异性钾-氯协同转运蛋白KCC2。抗体的发展和蛋白质的初步表征。生物化学杂志。1999;274(18):12656–12664. doi:10.1074/jbc.274.18.12656。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • 伤口血FG.顺行神经解剖追踪菜豆-白细胞凝集素结合γ-氨基丁酸、胆碱乙酰转移酶或5-羟色胺的免疫细胞化学。组织化学。1988;89(5):421–428. doi:10.1007/BF00492597。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wu WL，Ziskind-Conhaim L，Sweet MA。大鼠脊髓甘氨酸和GABA介导突触的早期发育。神经科学杂志。1992;12(10):3935–3945. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Yamada J、Okabe A、Toyoda H、Kilb W、Luhmann HJ、Fukuda A.Cl−NKCC1介导幼年大鼠新皮质神经元摄取促进GABA去极化作用。生理学杂志。2004;557（第3部分）：829–841。doi:10.1113/jphysiol.2004.062471。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zhang L，Spigelman I，Carlen PL.未成熟大鼠海马脑片CA1神经元GABA能抑制的全细胞斑贴研究。大脑研究开发大脑研究。1990;56(1):127–130. doi:10.1016/0165-3806（90）90171-T。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Zhu L，Lovinger D，Delpire E。缺乏KCC2表达的皮层神经元显示细胞内氯化物的调节受损。神经生理学杂志。2005;93(3):1557–1568. doi:10.1152/jn.00616.2004。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
来自的文章大脑结构与功能由以下人员提供施普林格