图6。

硝化介导RhoA活化的机制。 A类，RhoA的x射线晶体结构分析表明，Tyr³⁴位于Switch I结构域的一个柔性区域（瓣）中，负责核苷酸结合。B，RhoA皮瓣区域的100-ns分子动力学模拟(蓝色)RhoA在Tyr硝化³⁴(绿色)已执行(左侧面板); 皮瓣区的运动(绿色)也叠加在与GEF蛋白结合的x射线晶体结构RhoA上(粉红色,右侧面板). His-tagged RhoA结构在大肠杆菌BL21菌株。首先，细菌裂解物由His纯化₆镍-硝基三乙酸柱上的标记亲和力。其次，用大小排阻色谱分离亲和纯化洗脱组分中的蛋白质。C考马斯染色鉴定出两条带，并用Western blot分析确认为RhoA。使用MS进一步证实了这两条带都是RhoA，这表明第二条带可能含有翻译后修饰。过亚硝酸根降低了GDP与纯化RhoA的结合。人类重组RhoA暴露于真正的过氧亚硝酸盐（100μ米，30分钟）。D类和E类结合荧光标记GDP的动力学(D类)或GTP(E类)然后使用停流分析进行RhoA。对三个测量值进行平均，并用双分子反应方程进行拟合。硝化作用将GDP与RhoA的结合常数从19.79+1.66降低到4.03+2.87米⁻¹秒⁻¹但不影响GTP结合（仅RhoA=38.66+8.6米⁻¹秒⁻¹ 与RhoA+ONOO=36.19+12.7米⁻¹秒⁻¹).F类，GTP与Y34FRhoA突变体结合的动力学也通过使用mant GTP的停流分析来测量。没有观察到GTP的结合，这表明该突变体不能结合GTP，因此具有催化活性。G公司，Y34FRhoA突变蛋白在HLMVEC中过度表达。48小时后，RhoA蛋白显著增加。H（H），Y34FRhoA突变蛋白的过度表达并没有改变LPS处理细胞的基本RhoA活性或调节RhoA活动的增加。我Y34FRhoA突变蛋白的过度表达也不能调节LPS引起的正常化TER的降低。J型，RhoA催化循环示意图。GDP释放是RhoA激活中的一个速率限制步骤。Tyr协助增加GDP释放³⁴硝化导致更快的GTP重新加载并增加RhoA活性。数据为平均值±S.E。；n个= 3. *,第页< 0.05与pDEST40（空向量）无LPS。