图3。

RhoA硝化屏蔽肽的研制³⁴硝化作用。 A类，一种以Tyr为中心的生物素化肽³⁴合成了含有QFPEVYVPTVF序列的序列，并与HIV TAT序列偶联。该肽被命名为NipR1（硝化抑制肽1），并被设计为与RhoA中Switch I结构域的瓣区相互作用(左侧面板). 还合成了苯丙氨酸取代肽（NipR1F）作为对照(右侧面板). 将每种肽（100 ng/ml）与重组人RhoA（0.1 mg）混合，并进行生物素下拉分析，以评估每种肽与RhoA结合的能力。B类，从三个独立的实验中显示了一个具有代表性的图像，并证明每个肽都与RhoA具有高亲和力。C类增加生物素化NipR1的浓度（0.3、1、1.5、5和30μ米)与纯化的RhoA和GFP蛋白混合以计算各自的结合常数。NipR1与RhoA结合显示出特征亲和力曲线K（K）_d日2.35±0.84，而NipR1以非特异性方式与GFP结合。RhoA和GFP蛋白在NipR1（5μ米)并暴露于过氧亚硝酸盐供体SIN-1（250μ米)持续1小时。D类蛋白质硝化的Western blot分析表明，在NipR1存在下，RhoA硝化减少，而Nip R1没有减少GFP硝化。E类，SIN-1产生过氧亚硝酸盐（250μ米)在NipR1（5μ米).如果质谱分析表明，NipR1（50μg）肽（2655.4Da，上部面板)至过氧亚硝酸盐（500μ米)产生+45 Da质量位移（27007 Da，下部面板)与NO有关₂酪氨酸的基团加成。我们还观察到酪氨酸氧化。G公司将HLMVEC暴露于非生物素化NipR1和NipR1F肽（100 ng/ml，30 min），然后用LPS（1 EU/ml）处理细胞。两种肽都不能减弱LPS诱导的总硝化蛋白的增加。H（H）和我，NipR1，而不是NipR1F减少了LPS介导的RhoA硝化反应的增加(H（H）)和RhoA激活(我).J型和K（K）NipR1暴露细胞中RhoA活性的降低也减弱了LPS介导的TER降低(J型)并减少细胞之间的间隙形成(K（K）). 数据为平均值±S.E。；n个= 3. *,第页< 0.05与未经处理；†，第页< 0.05与仅LPS。IB公司免疫印迹；IP（IP）免疫沉淀；3-北卡罗来纳州，3-硝基酪氨酸。