线粒体缺陷与多种人类疾病有关，包括癌症(1,2). 近三分之一的哺乳动物线粒体蛋白质组目前没有特征。许多这些无特征化的蛋白质在进化上是保守的，这强烈表明它们执行基本的重要细胞功能(三). 我们启动了一个项目，以确定其中一种蛋白质的功能，在这里命名为Sdh5，使用酵母作为主要模型系统。Sdh5蛋白家族在真核生物和包括立克次体在内的一些原核物种中高度保守，立克次氏体与成为祖先线粒体的细菌有关(图S1) (4,5).
蛋白质组学研究表明，酵母Sdh5（原名EMI5/YOL071W）的线粒体定位(6)，我们通过荧光显微镜观察一株表达Sdh5–绿色荧光蛋白的菌株和表达Sdh5-GFP（绿色荧光蛋白）的菌株的亚细胞分离证实了这一点(图S2和S3). 标记的Sdh5的两种形式都是从本地表达的SDH5型启动子和功能齐全。我们进一步证明Sdh5存在于线粒体基质中()主要是可溶的().
Sdh5是呼吸所必需的，并与Sdh1相互作用。(A类)用（+）或不使用（-）蛋白酶K处理表达Sdh5-HA的菌株的线粒体、低渗肿胀产生的线粒体和1%Triton X-100溶解的线粒体，并用未经处理的线粒体对照（UT）进行免疫印迹分析。Mge1、Tim10和Fzo1分别是基质蛋白、膜间隙蛋白和外膜蛋白。(B类)纯化线粒体的可溶性和膜组分(4)如（A）所示进行免疫印迹。Aco1，可溶性基质蛋白；Sdh1，膜相关基质蛋白。(C类)连续稀释WT和瑞士法郎5将含有空载体（EV）或表达Sdh5-HA的质粒的Δ菌株点在葡萄糖或甘油培养基上，并分别在30°C下生长2或3天。(D类)WT中的耗氧量，sdh5型Δ和sdh1型Δ菌株在棉籽糖培养基中生长到中对数期（±SD，n个=3个生物复制品）。在葡萄糖培养基中也得到了类似的结果。(E类)串联净化洗脱液(4)来自WT菌株和表达Sdh5-His的菌株6/HA用SDS-PAGE溶解，并通过银染色（顶面板）或用Sdh1和HA抗体的免疫印迹（下面板）进行可视化。(F类)纯化WT线粒体的免疫印迹，sdh1型Δ，或sdh2Δ表达Sdh5-HA的菌株。孔蛋白，线粒体负荷控制。
呼吸道缺陷突变体酿酒酵母在葡萄糖等可发酵碳源上是可行的，但在甘油等非发酵碳源中是不可行的。我们发现一株缺失了SDH5型(瑞士法郎5Δ）在葡萄糖培养基上正常生长，但在甘油培养基上生长失败，这种表型被SDH5型-表达质粒(). 这个瑞士法郎5Δ菌株也表现出耗氧量受损，类似于呼吸衰竭sdh1型Δ应变(7) ()以及H的呼吸相关表型2O（运行）2超敏反应和时间寿命缩短(图S4和S5). 这个瑞士法郎5Δ呼吸缺陷不是由于线粒体DNA（mtDNA）缺陷，因为瑞士法郎5Δ菌株弥补了a的甘油生长缺陷ρ0配对试验中的（mtDNA-缺失）菌株(图S6). 因此sdh5型Δ菌株虽然有功能性线粒体基因组，但仍存在呼吸缺陷。
Sdh5-His串联亲和纯化的最终洗脱液的银染色6/HA显示了与野生型相比，标记的Sdh5的两种特异性蛋白质，包括约22kD的Sdh 5本身(). 第二个在~70kD迁移，通过质谱鉴定为Sdh1，琥珀酸脱氢酶（SDH）复合物的催化亚单位。免疫印迹法证实最终洗脱液中同时存在Sdh5和Sdh1(). SDH络合物是三羧酸（TCA）循环和电子传输链（ETC）的组成部分。在后者中，SDH复合体被称为复合体II。它是一种高度保守的异四聚体，以Sdh1和Sdh2为催化亚单位，通过Sdh3和Sdh4锚定在线粒体内膜上(图S12) (8). 两者都有sdh1型Δ和瑞士法郎5Δ突变体缺乏呼吸功能，不能在甘油培养基上生长，但以乙醇为碳源时生长较弱(和图S7)并表现出醋酸盐分泌过多，这是其他四个TCA周期突变体共有的表型(9). Sdh1–Sdh5相互作用的重要性通过观察Sdh5（如Sdh2）在sdh1型Δ应变(). 相比之下SDH2系统导致Sdh5蛋白水平增加()可能是由于缺少主要Sdh1合作伙伴Sdh2的情况下增强了Sdh1/Sdh5复合物的形成。
Sdh1-Sdh5相互作用可能在功能上很重要，因为瑞士法郎5Δ突变体缺乏SDH活性()，正如之前对sdh1型Δ突变体(10). 另一种TCA循环酶苹果酸脱氢酶的活性不受SDH5型删除(). 由于SDH在ETC中是复合物II，我们在用蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）分离后对ETC复合物进行凝胶内活性染色。如所示，复合II/SDH活性在瑞士法郎5Δ突变，而复合物IV和V的活性正常。然后，我们在BN-PAGE后通过考马斯蓝染色检查ETC复合物的组装和稳定性，发现复合物II/SDH在瑞士法郎5Δ线粒体(). 复杂II/SDH在瑞士法郎5Δ突变体在野生型（WT）的BN-PAGE和瑞士法郎5Δ表达Sdh3-Myc的菌株(). Sdh5不是复合物II/SDH的稳定组分，因为它在BN-PAGE期间在~90-kD SDS敏感复合物中迁移()与杂岩II（~200 kD）不同。这种~90-kD复合物可能是Sdh5-Sdh1（70-kD）异二聚体。
SDH活性和稳定性需要Sdh5。(A类)SDH和苹果酸脱氢酶活性(4)来自WT和瑞士法郎5Δ线粒体，归一化为总蛋白（±SD，n个=3个生物复制品）。(B类)WT和WT线粒体膜BN-PAGE后ETC复合物的In-gel活性测定瑞士法郎5Δ应变。V（V）2，复合V二聚体。(C类)来自WT和瑞士法郎5Δ应变。(D类)使用Myc抗体对BN-PAGE分离的复合物II/SDH进行免疫印迹，以在WT和瑞士法郎5Δ线粒体(E类)使用TAP抗体对BN-PAGE分离的WT和Sdh5-TAP线粒体进行免疫印迹，无需和有1%SDS预处理。波林是一种~440-kD的对照物。(F类)WT和WT线粒体的免疫印迹瑞士法郎5Δ菌株，其中Sdh3或Sdh4被Myc标记，分离为可溶性（sol）和膜（mem）部分(4)，或未分割（总计）。Aco1，可溶性基质蛋白。所示百分比为剩余金额瑞士法郎5Δ线粒体相对于WT线粒体。
所有四个SDH亚单位的水平在瑞士法郎5Δ突变，可能是因为缺乏稳定的SDH复合物时降解(，通道1与通道2）。残留的Sdh1水平高于其他亚单位，但大部分位于可溶性部分，与SDH复合物无关(). 这些数据表明，SDH复合物在没有Sdh5的情况下组装，但该复合物是无功能的，并且Sdh1没有稳定结合。因此，不稳定的复合物更容易降解，并且在BN-PAGE过程中被洗涤剂萃取破坏（分馏如无清洁剂）。
SDH复合物的活性需要多种辅因子，包括Sdh1中的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）(11). 在其他ETC复合物中，除酶活性外，辅因子对复合物的组装和稳定性也很重要(12). 强荧光FAD共价附着在Sdh1上，在SDS-PAGE后可通过凝胶内荧光法检测(13). 删除SDH5型导致Sdh1的FAD辅因子附着（黄素化）完全丧失，尽管Sdh1仍然存在(). 在同一凝胶中观察到的另外两种线粒体黄蛋白的黄变不受任何一种蛋白的影响SDH5型或SDH1型删除().
Sdh5对Sdh1黄变是必要和充分的。(A类)重量，瑞士法郎5Δ和sdh1型Δ线粒体通过SDS-PAGE进行解析并成像(4)用于共价FAD（顶面板）或免疫印迹（下面板）。(B类)荧光凝胶图像（上图）和免疫印迹（下图），如（A）所示，用WT或flx1型Δ瑞士法郎5Δ含有EV、CEN质粒的菌株SDH5型(flx1Δ：每个细胞约1个拷贝），或2μ质粒SDH5型（O/E:~10个副本/单元）。条形图显示标准化FAD荧光（±SD，n个=3个生物复制品）（底部面板）。(C类)His-tagged酵母Sdh1单独或与Sdh5或Sdh2在大肠杆菌，纯化并分析FAD荧光，如（A）和考马斯蓝染色。
WT细胞中Sdh5过度表达不会增加Sdh1黄变(，车道1与车道2），可能是由于黄变作用已经达到化学计量。Sdh5过度表达的显著影响可能需要Sdh1黄变减少，正如线粒体FAD转运体Flx1缺失导致线粒体FAD减少的菌株所观察到的那样(13,14). 这个flx1型Δ突变体几乎没有显示Sdh1黄变，但Sdh5过度表达将黄变恢复到WT水平的50%左右(，泳道4和5）。如所示，在大肠杆菌-表达Sdh1，但当Sdh5而不是Sdh2同时表达时显著增加。这些数据表明，Sdh5对Sdh1黄变既必要又充分。
酵母Sdh5的氨基酸序列与其人类同源基因C11orf79（我们在这里将其重命名为hSDH5）有44%的同源性（从163个残基中的33到158个）(图S1). 我们假设hSDH5是SDHA（人类Sdh1）黄变所必需的，因此也是SDH活性所必需的。先前的遗传学研究表明，导致SDH活性丧失的突变是一种罕见的神经内分泌肿瘤副神经节瘤（PGL）的遗传形式。在四种家族性PGL综合征（PGL1至PGL4）中，PGL1、PGL3和PGL4与SDHD公司,SDHC公司、和SDHB公司分别为(15). PGL2（联机孟德尔遗传，男性编号：%601650）的基因尚未确定，但它映射到染色体11q13.1，即hSDH5型基因(16).
我们测序了hSDH5型来自上述荷兰PGL2血统不同分支的三名受影响个体(17). 在所有三个个体中，我们发现外显子2的单核苷酸c.232G>a变化(图S8)导致Gly78→ 精氨酸78蛋白质最保守区域的（G78R）突变(图S1). 400名未受影响的对照个体均未携带c.232G>A突变。在受影响的谱系中，在所有45名遗传该单倍型的个体中发现该突变与疾病单倍型共分离，而在44名无该单倍体的未受影响成员中未检测到该突变。33名突变患者已经患上了这种疾病，但没有7名患者（2009年中位年龄=74岁）从母亲那里遗传了这种突变(). 这表明一种类似SDHD的亲本特异性遗传模式。只有5名父亲突变的个体（2009年中位年龄=42岁）没有出现显性PGL。因为疾病的外显率随着年龄的增长而增加(17)，这些个体可能在未来发展为肿瘤，或者肿瘤可能已经存在但尚未被发现。
一个人SDH5型PGL2功能丧失突变。(A类)杂合c.232G>A突变与PGL2谱系中的疾病分离(17). 黑色符号、受影响人员；白色符号，未受影响的人；+，杂合突变；NT，未测试。带数字4的钻石代表四个未受影响的个体。因母体11号染色体上携带突变而未受影响的个体标记为m。出于隐私原因，一名健康母体突变携带者和五名未受影响父体突变携带者未出现在系谱中。(B类)人类肿瘤、细胞系和小鼠组织样本的荧光凝胶图像（顶面板）和免疫印迹（下面板）。第1和第2道，散发性PGL肿瘤；3至5道，PGL2肿瘤（hSDH5 G78R）；泳道6和7、HEK293和HepG2人细胞系；通道8和9，正常小鼠骨骼肌（skM）和肝脏。(C类)将含有EV或表达WT或G78R hSDH5-Myc的HEK293细胞的裂解液用与Myc抗体结合的琼脂糖珠免疫沉淀。对裂解液、洗脱液和未结合部分进行FAD成像（顶部面板）和免疫印迹（下部三个面板）。(D类)连续稀释WT和瑞士法郎5在葡萄糖或甘油培养基上发现含有EV或表达酵母Sdh5-Myc、WT人Sdh5-Myc或G78R hSDH5-Myc质粒的Δ菌株，并分别在30℃下培养2或3天。(E类)荧光凝胶图像（顶面板）和（D）中五种菌株的全细胞提取物的免疫印迹（下面板）。PGK，加载控制。FAD荧光标准化为Sdh1蛋白水平，并表示为相对于WT的百分比（Flavo%，±SD，n个=3个生物复制品）。
三名PGL2患者的肿瘤中SDHA黄变减少约95%(hSDH5型G78R）与两名散发PGL患者的对照肿瘤或与培养的人类胚胎肾和肝癌细胞以及小鼠骨骼肌和肝组织的对照肿瘤进行比较(). hSDH5的线粒体定位不受该突变的影响(图S9). 正如在酵母中观察到的那样，SDHA与WT-hSDH5-Myc共免疫沉淀。然而，G78R hSDH5突变显著削弱了hSDH4与SDHA的相互作用，并略微降低了hSDH蛋白的水平(). 我们得出结论，G78R突变破坏了hSDH5的稳定性，并损害了其与SDHA的相互作用。
当在酵母中表达时SDH5型启动子WT-hSDH5补充了瑞士法郎5Δ甘油生长缺陷，但G78R突变没有影响(). 任何单个SDH亚单位或提议的SDH伴侣TcM62的过度表达(18)未能补充瑞士法郎5Δ突变表型(图S10). 此外，一个广泛的高拷贝抑制屏幕瑞士法郎5利用酵母基因组文库发现Δ甘油生长缺陷SDH5型但没有发现其他抑制基因。因此，具体的救援瑞士法郎5天然水平表达的Δ甘油生长缺陷hSDH5型是酵母对人类Sdh5功能保护的有力证据。此外，hSDH5在瑞士法郎5Δ突变株将酵母Sdh1的黄变增加到WT水平的77%，但G78R突变株没有影响(). G78R缺乏活力hSDH5型酵母中的突变可能是由于蛋白质的不稳定().
共价FAD插入蛋白质的机制存在争议。尽管其他共价辅因子是由特殊酶插入的(19)，提出了一种用于黄变的自催化机制(20). 然而，共价FAD与Sdh1的连接显示需要至少一个额外的蛋白质(21)，我们假设为Sdh5。Sdh5是参与FAD附着的化学反应（酶功能），还是仅仅维持Sdh1的构象，使其易受自催化FAD附着（伴侣功能）的影响，这是一个有待解决的问题。
识别hSDH5型作为PGL2级该基因具有潜在的临床意义。大约70%的头颈部PGL家族病例是由于SDHB、SDHC，或SDHD公司(22)，10%的散发性PGL病例与SDHB公司或SDHD公司(23,24). 中的突变SDHB、SDHC、和SDHD公司也在胃肠道间质瘤中检测到(25)嗜铬细胞瘤(24)、肾细胞癌(26)和其他疾病(27). 可以想象，hSDH5型突变可能是基因突变阴性患者疾病发展的基础SDHB、SDHC、和SDHD公司。包括hSDH5型将允许进行更全面的基因检测，这建议用于PGL的临床管理，即使是零星病例(28). 对于SDHAF1型该基因编码一种参与SDH组装的蛋白质，最近被确定为婴儿白质脑病的致病因素(29). 总之，从酵母中以前没有特征的线粒体蛋白开始，我们通过生化和遗传分析表明，该蛋白在呼吸复合体的生物发生和功能中起着关键作用，其突变失活导致人类对肿瘤的易感性。
