Hsp90是抗癌战争中不太可能的盟友

摘要

介绍

毫无疑问，任何与癌症相关的感兴趣的蛋白质或基因都会收到多余的药理学建议。热休克蛋白90（Hsp90）也不例外。随着关于Hsp90的每一次新的相互作用和发表，人们对临床应用的热情越来越高。事实上，Hsp90抑制剂正在进行临床试验并取得进展，其在多种癌症中的应用正在扩大。尽管取得了这些成功，但最近几篇关于癌症机制的高调文章[1,2]忽视了这一已经确立的治疗靶点，这些癌症综述的作者认为这并不异常。我们机构内的癌症药理学家经常被临床试验数据或甚至可能以大量伴侣蛋白为靶标的概念蒙蔽了双眼，例如Hsp90，该蛋白没有已知的疾病相关多态性[三,4]. 从表面上看，这似乎是合理的：一个人如何在药理学上以一种对正常细胞生存能力至关重要的蛋白质为靶点，并有一个记录在案的相互作用组，涉及400多个假定客户和十几个细胞途径和过程？

因为一开始很难想象临床上会有什么成功，所以Hsp90抑制剂的应用被放弃了，转而进行纯粹的学术研究，因为制药公司认为这无关紧要。然而，尽管Hsp90蛋白-蛋白质相互作用具有高丰度和多效性，但Hsp90抑制剂已进入临床试验。与直觉相反，最初使Hsp90抑制剂看起来不合适的方面现在显示出了相对于单靶点治疗的优势，包括Hsp90抑制剂在内的联合疗法的潜力应能有效防止或延长酪氨酸激酶抑制剂和其他靶向治疗常见的癌症耐药性的发展[5–7].

为了强调Hsp90抑制剂取得的成功，我们重点介绍了由Synta Pharmaceuticals（美国马萨诸塞州列克星敦）开发的Hsp90抑制物ganetespib的研究结果。在在体外肿瘤细胞毒性研究表明，在1μM（一个容易达到的血浆水平体内)足以在72小时内减少细胞死亡。这表明短时间接触Hsp90抑制剂会对细胞产生永久和持久的影响。这些观察延伸到动物研究。单周剂量100–150 mg·kg⁻¹3周后，实体和血液学异种移植模型的肿瘤减少了50-90%[8]. 最重要的是，在最近的临床研究中，也显示甘奈替比林每周一次治疗非小细胞肺癌患者，总有效率为50%[9,10]. 因此，ganetespib在许多方面的开发是第二代合成Hsp90抑制剂如何超越第一代盖达霉素抑制剂的一个很好的例子。与格尔德霉素相比，Ganetespib不仅表现出更高的疗效和更好的配方，而且还显著降低了心血管和肝毒性副作用[8]. 我们认为，这些持续的进展证明了Hsp90作为药物靶点的有效性。虽然非靶向效应的安全性正在提高，理想的肿瘤效应也在不断进步，但在正常组织中发现的Hsp90靶向肿瘤的机制尚不清楚。

Hsp90，基础

为了构建这篇综述，我们简要概述了Hsp90的基础知识及其已知生物学，然后阐述了Hsp90-在癌细胞和正常细胞之间的区别特征。Hsp90作为一种分子伴侣，帮助其蛋白质客户折叠和细胞内运输，从而在维持细胞蛋白质稳态方面发挥重要作用[11,12]. 在细胞质和细胞核中表达为90kDa蛋白（Hsp90α732氨基酸；Hsp90β724氨基酸），并包含对其大多数细胞功能至关重要的N末端ATP结合域[13]. ATP水解被认为会驱动Hsp90内的各种构象变化，这一过程受到与共伴侣分子的相互作用以及可能的多种翻译后修饰的高度调节(表1) [12,14]. 通过这些机制，Hsp90明显普遍存在的细胞伴侣功能被认为受到了严格的调控。

在过去的二十年中，人们做了大量的工作来描述特定蛋白质与其他称为协同伴侣的蛋白质的相互作用。辅环酮在Hsp90正常功能所需的构象循环中起到辅助作用，充当底物识别蛋白，甚至提供额外的酶活性。主要的共伴侣是含有四三肽重复序列（TPR）结构域的蛋白质，它们与Hsp90 C末端的MEEVD基序结合[15–18]. 在具有TPR结构域的共伴侣中，有Hsp70相互作用蛋白的C末端、Hsp70–Hsp90组织蛋白（Hop）、亲环素40、FK506结合蛋白和蛋白磷酸酶5（PP5）。虽然大多数共同伴侣有助于其他底物蛋白的招募，但其中一些共同伴侣会像异构酶、磷酸酶和连接酶一样为伴侣复合体添加酶功能[19–21]. 其他通过替代结构域与Hsp90相互作用的共同伴侣是Hsp90-ATPase同源物1（Aha1）的激活剂，它通过刺激其ATP酶活性来增强Hsp90的功能[22,23]. 细胞分裂周期37（Cdc37）是与促进肿瘤发生密切相关的共同伴侣，因为它与驱动癌症进展的突变激酶相关[24]. 最近研究表明，Hsp90–Cdc37复合物在不同程度上与三分之二的激肽组结合，同时与连接酶和转录因子的相互作用可以忽略不计[25]. 另一个共同伴侣是p23，负责核激素受体和Hsp90的复合。然而，它的相互作用并不像Cdc37那样有限，因为p23已经在广泛的Hsp90-客户端复合体中发现[26–29]. 与激活的共同伴侣Aha1不同，共同伴侣Cdc37、p23和Hop抑制ATP酶活性。因此，这些共同伴侣增加了这个多层面主伴侣的另一层调控，突显出Hsp90伴侣循环及其折叠功能的复杂性。Hsp90也通过转录调节，主要是通过与转录因子HSF的直接相互作用[30]. 尽管其在正常细胞中的表达水平很高，但据报道，热休克（37–42°C）等细胞应激可诱导Hsp90水平升高两倍[31].

另外两个直系家族成员，葡萄糖调节蛋白94（Grp94）和肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（Trap1），在ATP结合域中具有序列相似性，也被认为是细胞伴侣，以促进线粒体（Trap2）或内质网（Grp94，尽管它们并没有像Hsp90那样表现出同样的复杂性和巨大的相互作用[32]. 与Hsp90一样，Grp94和Trap1也包含一个N端ATP结合域和ATP酶活性，这也是细胞功能所必需的[33–36]. 与Hsp90不同，与Grp94或Trap1相互作用的客户蛋白列表更为有限，定义也不太明确。一些研究小组提出，Grp94和Trap1是可作为癌症化疗的其他潜在靶点，尽管这些蛋白的选择性抑制剂尚未确定。

大多数Hsp90抑制剂的一个令人惊讶的共同发现是，它们对某些肿瘤细胞具有选择性，而对其他细胞没有选择性。几乎没有例外体内，大多数癌细胞比非转化细胞对Hsp90抑制更敏感，无毒剂量表现出抗癌活性。在动物和人类中，Hsp90抑制剂持续在肿瘤中积累，而它们迅速从血浆中清除，似乎不会进入大多数组织[37–43]. 视网膜可能是一个显著的例外。虽然本质上具有特殊性，但在一些使用部分但并非全部Hsp90抑制剂的患者中观察到可逆的眼部毒性[44]. 通常情况下，这发生在较高剂量或长时间接触后，表现为夜视障碍。停药或减少剂量通常可以缓解症状。然而，这种现象的特殊性质表明，视网膜中药物积聚的机制可能与肿瘤细胞不同，可能与最易感患者的某些潜在眼部病理学有关。另外，不同Hsp90抑制剂的结构变化允许不同程度的细胞摄取，视网膜比大多数其他组织更容易受到影响。某些肿瘤细胞优先吸收Hsp90抑制剂这一事实有力地表明，这些细胞内存在有助于Hsp90可药用的特定机制。一个早期的假设表明，在肿瘤细胞中，Hsp90优先存在于伴侣复合体中，据报道，这些多蛋白复合体对Hsp90抑制剂具有较高的亲和力，并且ATP酶活性也较高[45]. 用基于固定化Hsp90抑制剂的亲和树脂进行的实验表明，正常细胞和转化细胞中Hsp90与其共伴侣存在很大的不平衡[46,47]. 一个可以解释药物积聚的简单机制可能是肿瘤细胞比正常细胞表达更多的Hsp90。当然，已经证明转化可以在蛋白水平诱导Hsp90的表达，这也可以在患者分离的肿瘤中进行测量。然而，即使在最极端的情况下，在蛋白质水平上，折叠诱导也最多是2-3倍。如前所述，在正常细胞中，Hsp90被认为占细胞蛋白的1-2%，许多人认为Hsp90的高表达在进化上是保守的。事实上，正常的Hsp90表达水平引发了一个问题，即为什么肿瘤细胞需要诱导更多的蛋白表达。我们将我们的理论与其他理论相一致，即Hsp90的丰度在进化上是出于某种目的而保守的，而不是为了让科学家感到困惑而浪费保护。如果我们能够理解加剧肿瘤差异的机制，那么Hsp90抑制剂将被广泛用于抗击不断演变的癌症斗争。

在这篇综述中，我们讨论了将肿瘤Hsp90与正常组织中大量表达的Hsp90区分开来的机制，从而使其成为可药物治疗的癌症靶点。在区分癌细胞中的Hsp90和非转化细胞中的Hsp90时，最重要的三种机制不是相互排斥的，它们是：（a）诱导Hsp90 mRNA和蛋白质，（b）通过客户关联或翻译后修饰激活蛋白质，以及（c）异位细胞室的定位(图1). 随着我们对Hsp90在肿瘤生物学和正常细胞生物学中的机制差异有了更清楚的了解，Hsp90抑制剂进入常规临床实践的剩余障碍将被克服。有关Hsp90抑制剂的评论，请参阅[37,48–53].

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图1

肿瘤细胞和邻近正常细胞之间的Hsp90差异。诱导肿瘤细胞中Hsp90升高。Hsp90在肿瘤细胞中被激活（红色）并定位于细胞表面，而在正常细胞中，Hsp90只存在于胞浆中。

归纳

首先我们看看Hsp90的差异表达。很少有人会认为Hsp90在肿瘤中的过度表达是相应非肿瘤组织的2-3倍，但即使在基础条件下，Hsp90也很丰富，占细胞总蛋白的1–3%[46,51,54,55]. 热休克蛋白90在热、缺氧和营养剥夺引起的细胞应激下上调，这些通常与肿瘤微环境有关。因此，有人提出，肿瘤中Hsp90的上调对于生存恶劣的微环境至关重要，因为它允许不稳定的排列持续存在，从而驱动肿瘤恶性化[56].

在激素和蛋白激酶依赖性乳腺癌这一临床应用最强的病例中，Hsp90的表达水平已得到很好的表征，并与患者的生存结果相关。首先，最近用免疫组织化学方法评估了正常、癌前和恶性组织中乳腺中Hsp90的表达。与非癌症组织相比，Hsp90在癌症组织中的表达水平更高[57]. Pick及其同事还对乳腺癌细胞系和655例原发性乳腺癌进行了免疫组化分析，其中包括331例雌激素受体阳性（ER+）和324例ER−肿瘤，并在所有乳腺癌细胞株和90%的原发性乳癌中发现可检测到Hsp90的表达。此外，他们报道Hsp90的高表达与预后不良有关[58]. 由于对乳腺癌特定分子亚型的认识，生物统计学家从23个公开可用的基因表达数据库中的4000多名乳腺癌患者的资料中评估了Hsp90基因的表达，并用1000多名患者的总体生存数据进行了注释。他们发现Hsp90的表达呈正常分布，并证实Hsp90高表达与整体生存率低相关[59]. 在黑色素瘤、白血病和人类结肠癌中，Hsp90在转化的甚至更多的恶性肿瘤中升高[60–62]. 非小细胞肺癌和前列腺癌患者的血清中也检测到升高的水平[63,64].

基于这些研究，人们认为Hsp90的高表达是癌症恶性行为的重要致癌信号节点，检测癌细胞中Hsp90上调或激活可能是恶性行为的早期指标。然而，Hsp90表达增加不足以解释导致肿瘤发生的机制。一个差异是，尽管与正常乳腺组织相比，乳腺肿瘤中的Hsp90升高，但膀胱、脾脏和大脑等其他正常组织中的Hps90在总Hsp90与总蛋白的比率中表达更高(图2) [55,65]. 这导致了一种论点，即癌细胞中的蛋白质有一些独特之处，将其与正常组织中发现的Hsp90区分开来。有数百个假定的客户蛋白和30多个可能发生翻译后修饰的位点，人们可以很容易地想象出肿瘤Hsp90蛋白的行为与正常Hsp90不同的场景。

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图2

在各种溶血小鼠组织中标记的Hsp90归一化为总蛋白。荧光标记的小分子抑制剂HS-27检测到活性Hsp90，令人惊讶的是，两个异种移植瘤样本没有表现出最高的活性Hsp90/总蛋白比率。

激活

Hsp90通过与客户蛋白的短暂相互作用与癌细胞生存和生长有关。迄今为止，已有400多名患者被确认，其中许多人参与调控细胞生长、凋亡逃逸、分化和转移的信号转导途径[25,66–68]. 关于目前报道的Hsp90蛋白相互作用的全面列表，请访问Picard实验室的网站http://www.picard.ch/Hsp90Int/index.php.

由于Hsp90抑制剂优先靶向肿瘤，可以推断这些药物靶向Hsp90的一个亚群，并且该亚群显示出Hsp90对抑制剂的高亲和力构象。一种可能性是，Hsp90存在于具有转化特异性癌蛋白的多肽复合物中，如经典突变激酶、人表皮生长因子受体2（Her2）和Bcr-Abl。这些蛋白可能代表调节转化表型的客户蛋白的一小部分。在使用相对无毒剂量时，这些药物可能无法有效抑制调节正常错误折叠过程的潜在Hsp90复合物，并且在任何时候都包含大多数细胞总Hsp90。这种解释导致了这样一种假设，即在正常条件下，Hsp90以动态、低亲和力的方式与客户蛋白相互作用，受ATP和ADP的低亲和力结合和释放调节。一旦发生突变或解除调控（这是癌症表型的特征），这些客户蛋白中的许多可能会与Hsp90表现出异常稳定的关联，代表活跃和可用药状态。

2003年自然Kamal的论文等。[45]声称肿瘤中的Hsp90完全存在于多肽复合物中，当Hsp90存在于这些特定复合物中时，它具有更高的ATP酶活性和对抑制剂17-AAG的100倍更高的亲和力。然而，一个错误的假设是，所有的Hsp90都有平等的机会结合ATP或其固定在珠上的模拟物。我们和其他人已经证明，只有一小部分（20-30%）的Hsp90与ATP或其配体结合。放射性标记的PU-H71在MDA-MB-468细胞中仅标记30%的Hsp90，在CML细胞中仅为一半[46]. 就共同伴侣参与而言，Kamal等。证明当重组Hsp90时在体外Hsp70、Hsp40、Hop和p23的ATP酶活性最高。莫利克等。此外，经固定化配体识别的Hsp90沉淀了共伴侣分子Hsp70、Hsp40、Hop和Hip，这些共伴侣分子在抗体分离的Hsp70的部分中没有发现，但在流动中发现[45,46]. 因此，假设与配体结合的Hsp90群体也存在于与几个共伴侣的络合物中，但“非活性”池不存在于共伴侣中。在他们的体内他们的分析发现，小鼠肿瘤与非对应正常组织相比，通过western blotting测定的Hsp90总水平差异不大。然而，它们的ATP酶活性更高，对Hsp90抑制剂的亲和力更高[45]因此，不能仅用Hsp90的高表达来解释转化和恶性肿瘤。另一方面，复制这项工作的努力未能显示出在癌症中发现的Hsp90的独特复合物。关于对Hsp90抑制剂具有较高亲和力的复合物，人们认为它是与亲和树脂非特异性结合的产物。我们的实验室已经表明，当配体从固定化珠中延伸出来时，与Hsp90亲和树脂的非特异性结合降低。Hsp90从亲和树脂中洗脱干净且具有竞争力[47]，提出了另一种假设，即当Hsp90与靶向ATP-结合域的抑制剂复合时，应具有化学计量丰度的共伴侣被取代而未被恢复。

阐明Hsp90的客户-伴侣相互作用的研究尚不完整，也没有为这些相互作用提供理论依据。例如，Hsp90不识别大量假定客户蛋白中常见的氨基酸序列，同一家族中结构相似的蛋白质也不以类似方式与Hsp90相互作用，例如表皮生长因子受体和Her2。由于对通过免疫沉淀、酵母双杂交分析或质谱分析等多种方法鉴定Hsp90与客户相互作用的各种方法提出了许多批评，最近的一项研究试图通过表达带有标记的潜在客户蛋白（即激酶、连接酶和转录因子）与必要的共伴侣，以量化的方式研究相互作用，从而绕过先前的障碍。虽然没有确定特定的识别序列或结构，但研究人员得出结论，共伴侣Cdc37提供了对尚未定义的折叠的识别，并且热稳定性和构象稳定性决定了Hsp90与其许多激酶客户的相互作用程度[25]. 讽刺的是，人们也可以从这项研究中得出结论，任何变性蛋白质都比正确折叠的蛋白质更有可能与Hsp90相互作用。当然，蛋白激酶抑制剂的加入通常会降低与Hsp90的结合，这一观察结果支持这种观点。表达的蛋白激酶通常在存在ATP竞争性抑制剂的情况下稳定，这反映在热稳定性的增加。根据我们的经验，使用依赖亲和力下拉列表的分析来研究蛋白质-蛋白质相互作用的研究充满了伪影，设计适当的控制来证明相互作用是真实的并不容易。我们自己在开发靶向Hsp90的亲和树脂方面的经验揭示了进行适当控制以区分直接与Hsp90结合的蛋白质与非特异性蛋白质的重要性(图3).图3研究表明，改变用于固定Hsp90抑制剂的连接物可以显著影响从细胞提取物中回收的蛋白质的模式。例如，人们可以从癸烷连接剂通道中显示的树脂中得出结论，这种树脂除了可以回收Hsp90外，还可以回收大量Hsp90客户端。然而，在与亲和树脂混合之前，通过在细胞提取物中加入游离的Hsp90抑制剂来阻断Hsp90本身与亲和介质的结合，表明尽管Hsp90的恢复被阻断，但其他蛋白质均未受到影响，表明这些都是伪影，与Hsp90无关[47]. 最终，这使我们开发出了一种仅能恢复Hsp90的培养基，而其他包括联合伴侣在内的培养基几乎不能恢复。尽管观察到Hsp90明显以竞争方式恢复Hsp90，但我们对Hsp90与该介质之间缺乏相互作用组感到有些困惑。我们自己从这些研究中得出的结论是，应使用更严格的控制措施重新研究Hsp90相互作用组，例如在对照提取物中加入Hsp90抑制剂，以消除与介质表面的非特异性结合。我们认为这样的研究可能会大大缩短稳定的相互作用组。

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图3

Hsp90选择性亲和介质的定向化学进化。SDS/PAGE银染显示不同侧链修饰对Hsp90恢复和非特异结合蛋白恢复的影响。在与亲和树脂混合之前，在组织提取物中加入1 mM的游离配体（+），证明了对Hsp90的选择性。质谱法用于确定所有结合蛋白。在偶氮-6-PEG树脂结合的蛋白质中，用NaCl/P中的25mM连二亚硫酸钠洗脱_我.聚乙二醇，聚乙二醇。图复制自[47].

鉴于基于亲和力的方法可能会导致对客户的错误识别，其他在Hsp90抑制剂存在的情况下检查客户命运的方法可能更具信息性。许多研究试图建立Hsp90患者关联，评估Hsp90抑制后假定患者的命运。最常被引用的是特定客户的降解，而那些持续存在的蛋白质被认为没有Hsp90伴随。这种现象的最好例子是用Hsp90抑制剂治疗的乳腺癌细胞株中Her2的降解。通过western blot，我们可以确认在我们最具选择性的Hsp90树脂上用Hsp90回收Her2[47]. 重要的是，在与亲和介质混合之前，细胞提取物中包含Hsp90抑制剂会阻止这种恢复。然而，我们注意到，活性药物结合的Hsp90相对于Her2的回收率至少高出两个数量级（Hsp90:Her2）。正如Lindquist及其同事的研究所表明的那样，Hsp90与客户之间的相互作用是短暂的，或者是低亲和力的，至少在药物结合状态下是如此[25]. 客户端降级方法也有其警告；例如，众所周知，未折叠蛋白质的命运各不相同&一些蛋白质以不同的动力学降解，而其他蛋白质在折叠不当时形成更稳定的聚集体。因此，缺乏对Hsp90抑制的敏感性不能完全解释相互作用或怀疑客户的相互作用。建立客户的其他注意事项是，只有一小部分Hsp90被认为是活性的，因为它能够在ATP-结合囊中结合抑制剂，剩下的Hsp90池继续其伴随功能。

由于报告的客户存在许多不确定性，并且没有明确的方法来建立一种在没有Hsp90的伴侣功能的情况下稳定的蛋白质的短暂相互作用，因此在癌症中定义Hsp90的一般激活状态的性质将继续难以实现。然而，与正常组织相比，癌症Hsp90在翻译后修饰方面的差异正在取得很大进展。这些修饰现在正在证明它们对ATP酶活性和定位的影响，而定位又反过来影响Hsp90与其他蛋白质的结合。有关报告修改的完整列表，请参阅表1.影响定位的Hsp90修饰突显了癌细胞与正常组织中观察到的一些更强的差异。

本地化

区分致瘤性Hsp90和正常Hsp90的重点放在客户关联领域。翻译后修饰被认为会影响Hsp90与其客户的联系，在过去十年中，Hsp90社区已经开始揭示翻译后修饰如何影响Hsp90。更重要的是，他们已经表明异位定位可以导致大多数癌症更恶性表型的进展。

Hsp90不再被认为只存在于细胞内环境中，但可以在多种癌细胞的表面膜上发现，也可以分泌到细胞外空间[60,69]. 事实上，某些癌细胞中的细胞表面Hsp90高于正常细胞，这使得它成为一个更具吸引力的靶点，以破坏依赖表面Hsp90s进行侵袭和迁移的转移途径。自2004年首次筛查Hsp90参与细胞侵袭和迁移以来，许多研究人员已经表明，阻断或中和分泌的Hsp90对这些转移行为具有抑制作用[70,71]. 虽然我们仍然不了解Hsp90细胞外表达的机制，但某些环境应激和生长因子已被证明可以刺激其分泌途径[72,73]. Hsp90的分泌似乎也受到翻译后修饰的影响，如乙酰化和磷酸化[74,75].

1986年首次发现细胞外存在Hsp90，当时发现一种小鼠肿瘤特异性抗原是一种热休克蛋白，现在被认为是Hsp90[76]. 2004年，有报道称，在一个功能屏幕上发现了Hsp90，该屏幕着眼于细胞入侵所必需的细胞表面蛋白质，但由于Hsp90的细胞丰度，它最初被视为伪影。然而，该筛选得到了验证，并确定Hsp90在细胞侵袭机制中具有重要的生物学意义，因为它与基质金属蛋白酶-2（MMP2）相互作用并激活基质金属蛋白酶-2（MMP2）[70]. 同样在2004年，在流式分析中发现恶性黑色素瘤分离的肿瘤细胞表面表达Hsp90[60]. 同年，人们发现表面Hsp90在发育神经元的迁移中起着作用。Hsp90α和β均在大鼠原代神经细胞表面表达，抗Hsp90抗体抑制细胞运动和板层足形成。在本研究中，进行了粗略测量，以确定表面Hsp90的相对表达。获得了Hsp90表面与总水平的比值，表面Hsp90占细胞总Hsp90的比例小于10%[77]. 其他研究表明，肿瘤细胞系将Hsp90分泌到条件培养基中，而其他经典细胞内蛋白（如肌动蛋白和微管蛋白）的缺乏则表明Hsp90并非来自于溶解的细胞。在一项关于死亡细胞的研究中，丙烯酰胺诱导的坏死导致细胞外释放Hsp90并增加HSF1活性。细胞外Hsp90可以被认为是免疫系统的危险信号，表明某些东西对细胞有害[78]. 然而，目前尚不清楚是什么外部线索触发了坏死细胞中Hsp90的排泄。

由于细胞内Hsp90在蛋白质组内稳态中起着关键作用，它回避了一个问题，即它的伴侣功能是细胞外所必需的还是它完全起着不同的作用？众所周知，细胞内错误折叠的蛋白质有三种可能的命运：伴侣作用、蛋白水解或聚集。细胞外蛋白似乎也需要伴侣作用。与细胞内液相比，细胞外液的蛋白质浓度较低，血浆中为6%，间质液中为2%，而细胞质中为30%[79]. 据认为，细胞外Hsp90α与共伴侣Hsp70、Hsp40、Hip、Hop和p23一起发挥作用，协助MMP-2的可裂解活化，并且可以独立于ATP进行活化，这是在ATP显著降低的环境中发挥其功能的一个重要特征[80].

正常细胞仅在受热、活性氧、γ射线照射和损伤释放生长因子等不利环境下分泌Hsp90，而肿瘤细胞则组成性分泌Hsp90[72]. 早期研究人员提出，Hsp90是通过非规范分泌途径分泌的，因为Hsp90缺乏分泌蛋白中的传统信号肽以及翻译后修饰，如N-糖基化。此外，Hsp90不定位于内质网和高尔基体，Hsp90-分泌对Brefeldin A治疗有抵抗力，Brefeldin-A是内质网/高尔基体依赖性分泌的经典抑制剂[81]. 事实上，已经证明Hsp90是通过外体途径排泄的[72,82]. 麦克雷迪等。结果表明，当从MDA-MB-231细胞中提取的外泌体应用于伤口愈合试验中的其他侵袭性细胞系时，外源性外泌体和重组Hsp90都能刺激更快的迁移到刮伤区域。对条件培养基进行Hsp90α免疫沉淀，并通过质谱鉴定10个客户蛋白。感兴趣的复合物是Hsp90:膜联蛋白II:tPA:纤溶酶原，它导致纤溶酶的激活，纤溶酶是肿瘤侵袭和癌症转移的关键蛋白[82]. 然而，为什么一些Hsp90针对的是外体分泌，而大多数仍在细胞中？此外，随着最近Stellas的发现，Hsp90的分泌似乎不像最初推测的那样具有亚型特异性等。who表明乳腺癌细胞也分泌β亚型[70,72,73,83].

一些人猜测，蛋白质修饰的众多可能性是否能区分Hsp90的分泌。组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）的敲除导致乙酰化作用增加，而乙酰化作用反过来降低Hsp90中的ATP结合和伴侣活性。质谱显示Hsp90α上的七个赖氨酸残基发生了超乙酰化(表1)乙酰化增加了17-AAG与Hsp90的结合，而中间结构域的K294乙酰化影响了协同伴侣结合。细胞外发现高乙酰化Hsp90并促进其表达在体外乳腺癌细胞侵袭。此外，抗乙酰基Lys69 Hsp90α抗体显著抑制细胞的侵袭性。P300是假定的组蛋白乙酰转移酶，负责乙酰化Hsp90α。Hsp90αK292Q突变体与ATP的结合增强，而其他位点的其他K到Q突变体的结合减弱。然而，所有乙酰化模拟物都表明与生物素化格尔德霉素的结合增强[74]. 虽然乙酰化似乎发挥了作用，但其他人认为是Hsp90α的T5和T7的磷酸化，其他人认为这是C末端截断[75,84]. 结果表明，分泌的Hsp90是一种C末端截短的形式，其分泌通过与含有TPR结构域的蛋白质相互作用受到C末端EEVD基序的调节。研究还表明，Hsp90的分泌由Thr90残基的磷酸化状态决定，由蛋白激酶A和PP5调节。进一步证明Hsp90的分泌是其前侵袭功能的先决条件，阻断分泌的Hsp90可显著抑制肿瘤转移。同时，临床癌症患者血浆Hsp90水平与肿瘤恶性程度呈正相关[84].

虽然Hsp90靶向外体分泌的确切机制尚不清楚，但已经明确的是，细胞外Hsp90在驱动非能动肿瘤细胞变得能动和侵袭方面发挥着关键作用。Hsp90促进肿瘤侵袭三步模型中的每一步：细胞外基质降解、癌细胞粘附和迁移[85]. 这些事件很可能与细胞内的伴侣功能相协调，这些功能促使细胞变得更恶性。这些观察是在Hsp90抑制及其对细胞运动和细胞侵袭期间细胞骨架结构和重塑的影响的背景下进行的。Hsp90的抑制导致细胞运动性降低，与丝状足类、片状足类和坚韧皮层肌动蛋白束的减少有关，并导致褶皱减少。Hsp90抑制还与解酒石酸相关的formin-2的丢失和Ras同源基因家族成员a的减少有关，这两者都是形成跛足和产生收缩力所必需的。抑制Hsp90可刺激Hsp90可溶部分中肌动蛋白的下拉增加。这些观察结果表明，在抑制Hsp90时，Hsp90与可溶性肌动蛋白（G-actin）和αB-crystallin的相互作用增加，这可能是细胞外周肌动蛋白跑动减少的原因。当用17-AAG抑制时，肌动蛋白增强的青色荧光蛋白和肌动蛋白加强的黄色荧光蛋白显示荧光共振能量转移减少50%，17-AGA处理使MDA-MB-231-GFP细胞的反向细胞侵袭减少80%。抑制Hsp90也会导致表面Hsp90表达减少[86]. 鉴于细胞外Hsp90研究的许多进展，仍存在几个问题。细胞外信号如何与外体转运机制进行通信，从而将Hsp90送出细胞？细胞外信号是选择性地导致Hsp90分泌并留下其他外泌体蛋白，还是它们只是触发了外泌体囊泡的整体分泌？细胞内Hsp90总分泌量的百分比是多少？

我们可以从药理学角度提出的最重要的问题之一是，是否可以利用Hsp90的表面表达来提高未来Hsp90抑制剂的安全阈值。我们的实验室目前正在探索一种假设，即表面Hsp90的表达可能有助于许多Hsp90抑制剂的肿瘤选择性。这一假设是由最近的数据驱动的，这些数据使用了与荧光团相连的细胞非渗透性Hsp90抑制剂，表明一部分体外表达的Hsp90被重新内部化，导致药物积聚（Barrott等。，未发布的结果）。通过扩展这一观察结果，可以想象许多Hsp90的主要抑制剂通过类似的机制优先进入肿瘤细胞，并且可能已经被偶然地优化了。这样的说法并非没有可能。根据我们自己在发现Hsp90抑制剂方面的经验，虽然我们最初的高通量先导物是通过洗脱与ATP亲和柱结合的天然Hsp90来识别的，但随后在基于细胞的分析中对所有分子的生物活性进行了评估[41]. 这些分析包括生长抑制和作用机制的证据，包括抑制Her2表达、诱导Hsp70和S6磷酸化。一般来说，在这一阶段，引起明显细胞毒性的化合物将被视为二级化合物，不再进一步研究。其他研发Hsp90抑制剂的团队很可能会寻求这种途径。因此，测试Hsp90抑制剂是否具有更高的c（c）日志P（P）与我们目前的临床活性Hsp90抑制剂相比，这些值对正常细胞的毒性更大，因此更容易自由扩散。这一发现将具有重大意义，因为Hsp90抑制剂的开发仅通过与表面Hsp90的相互作用穿透细胞，可能大大改善了安全性，从而延长了这类药物的治疗窗口。

联合治疗

通常，当Hsp90抑制剂连续给患有人类肿瘤的动物注射时，肿瘤停止生长。然而，当停用抑制剂时，肿瘤往往会再次生长(图4). 通常，实体瘤患者在使用多种结构无关的Hsp90抑制剂治疗时也会出现同样的现象。这些观察结果与该蛋白在维持肿瘤生长和Hsp90抑制剂抑制这些途径中的作用一致。由于这些原因，Hsp90抑制剂作为单一疗法的使用可能有限，尽管最近的观察表明，某些肿瘤类型可能比其他肿瘤类型对Hsp90抑制更敏感，并且单一疗法可能足以促进肿瘤减少甚至细胞死亡。在最近仅使用ganetespib的II期研究中，观察到肿瘤中含有ALK易位的非小细胞肺癌患者有50%的令人鼓舞的应答率[87]. 然而，将Hsp90抑制剂与现有化疗药物或更尖端的药物（如赫赛汀、拉帕替尼或格列卫）结合使用，在该领域引起了极大的兴奋。图4表明药物SNX5422和赫赛汀的组合不仅显著且持久地缩小肿瘤（即使在停药后），而且具有协同作用。联合治疗的论据在于，人类癌症的基因组测序表明，任何一种癌症中都存在大量的驱动基因突变[88,89]. 肿瘤内部异质性可能会促进肿瘤的进化和适应，并阻碍依赖单个肿瘤活检样本结果的个性化药物策略[90]. Hsp90抑制剂在预防肿瘤耐药性方面发挥着独特的作用，因为癌基因严重依赖于Hsp90来伴随其因突变而不稳定的构象。这种依赖性被称为癌基因成瘾。由于许多突变癌蛋白对Hsp90活性“上瘾”，Hsp90抑制剂能够影响多个靶点和通路，从而阻止癌基因转换，这是产生耐药性的主要机制[91,92].

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图4

体内SNX-5422的药理学。对BT-474荷瘤裸鼠的影响(n个=10）与载体一起服用或（1）10 mg·kg⁻¹SNX-5422（SNX）口服，每周三次，（2）曲妥珠单抗（TZB）3 mg·kg⁻¹每周静脉注射两次，（3）10mg·kg⁻¹SNX口服，每周三次，TZB 3 mg·kg⁻¹每周静脉注射两次或（4）40mg·kg⁻¹SNX每周三次。所有药物治疗组的给药时间仅为前3周。所有组均随访6个月或直到因肿瘤负担而死亡。图转载自[41].

Hsp90抑制剂有可能绕过或降低靶向治疗中的耐药性，但由于癌症的发展，对Hsp90抑制的耐药性也确实存在。然而，p23、Aha1或Cdc37等共伴侣的沉默已被证明对Hsp90的抑制具有显著的敏感性[93–95]. 由于Hsp90抑制允许HSF1的三聚体化和活化，并且HSF1升高与肿瘤发生的各个阶段有关，因此人们正在努力寻找HSF1抑制剂，可以与Hsp90抑制剂一起使用，以最大限度地减少Hsp90的抑制负面影响[96,97]. HSF1激活后，Hsp70转录显著上调，这通常用于基于细胞的Hsp90抑制剂疗效检测中的读数。然而，Hsp70诱导是另一种能够驱动许多肿瘤发生的伴侣。研究人员已经表明，靶向Hsp70具有治疗价值，因为肿瘤在组成形式上过度表达诱导形式[98]. 因此，抑制Hsp90和诱导型Hsp70的联合治疗可能是一种通过消除Hsp70诱导的有害影响来治疗癌症的强大方法。

结论

虽然一些人仍然不知道Hsp90抑制剂在临床上的进展，但其他人，包括Hsp90社区的成员，仍然怀疑目前17种Hsp90抑制物中是否有任何一种会成功退出临床试验并进入市场。我们认为有一天，Hsp90抑制剂将在临床上普及，在Hsp90抑制物的肿瘤学应用中，这些药物将被用作一线化疗药物，与其他有效的抗癌疗法相结合，以防止或延长耐药性的发展。在近期内，Hsp90抑制剂和尖端靶向治疗的联合治疗显然是最有希望的。如果在动物与Herceptin等药物的联合研究中观察到的疗效和肿瘤消除方面的一致协同作用在人体试验中成立，那么也许我们正在看到实际的“治愈”，而不仅仅是考虑在短期内阻止疾病进展。正如我们所讨论的，除了联合治疗之外，Hsp90生物学的其他方面可能会使其更容易被药物治疗。研究癌细胞和正常组织中Hsp90的差异可能会揭示如何靶向Hsp90以及如何改善其治疗窗口的其他策略。我们关注的其中一个问题是异位表达的Hsp90在转移进展中的作用。尽管尚未在人体活检样本中证实，但如果异位Hsp90的表达与转移进展之间存在相关性，则这可能具有诊断和治疗重要性。如果异位Hsp90的表达与不良预后相关，则可作为早期生物标记物，以区分惰性形式与侵袭性疾病。我们对开发仅以体外表达的Hsp90为靶点的Hsp90inhibitors的前景感到特别兴奋，该抑制剂可以提高Hsp90抑制剂的选择性，并向肿瘤细胞传递肿瘤杀伤有效载荷。在所有这些扩展Hsp90治疗潜力的有形可能性之上，是由Hsp90调节和调节的相关蛋白的共同伴侣/伴侣机制。一次真诚地客户已经确定并得到验证，可以设想一些策略，可以选择性地抑制这些蛋白-蛋白质相互作用，从而可能使Hsp90治疗具有高度的针对性和疾病特异性。

最后，从药理学家的角度来看，将Hsp90作为与21世纪药物发现相关的癌症靶点，可以从中吸取教训。显然，治疗癌症的新疗法并不总是像过去那样显而易见，也就是说，不能假设“癌症的标志”涉及点突变，而仅此一点就意味着可用的靶点。并非所有的目标都是“Gleevec类型的故事”。如果我们假设是这样的话，我们很可能会错过一些好机会。第二个教训是，尽管Hsp90药物尚未上市，但独立数据的大幅增长强烈表明这将很快发生，尽管存在一些副作用问题，如视网膜毒性。这种地面膨胀是不言而喻的，其形式是目前临床上正在发展的独立衍生抑制剂的数量。在这些独立的途径中，我们计算出了六种结构不同的支架，目前Hsp90抑制剂的临床应用都是基于这六种支架。在未来涉及非常规靶点的药物研发工作中，如果我们没有明显的基因数据来验证靶点，我们应该寻找类似的趋势，以确保制药公司不应忽视此类靶点。

致谢

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