生物识别研究国际。2013; 2013: 569206.
冬虫夏草通过Nrf2激活诱导人肺上皮细胞血红素氧化酶-1和金属硫蛋白增加缺氧耐受性
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姆里纳里尼·辛格
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
拉杰库马尔·塔尔萨瓦尼
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
Praveen Koganti公司
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
阿弥陀佛·周翰
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
马尼马兰马尼卡姆
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
克希普拉·米斯拉
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
印度德里提马普尔勒克瑙路国防生理学及相关科学研究所，邮编：110 054
学术编辑：多布罗米尔·多布雷夫
2013年4月18日收到；2013年7月11日修订；2013年7月11日验收。
版权©2013 Mrinalini Singh等人。 这是一篇根据知识共享署名许可证发布的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制原始作品，前提是正确引用了原始作品。
摘要
冬虫夏草是一种生长在喜马拉雅地区的食用菌，在传统医药体系中得到广泛认可。在本研究中，我们报告了冬虫夏草以A549细胞系为模型系统，促进缺氧耐受。水提取物处理冬虫夏草通过诱导抗氧化基因HO1（血红素氧合酶-1）、MT（金属硫蛋白）和Nrf2（核因子红细胞衍生2-样2），显著减弱缺氧诱导的ROS生成、脂质和蛋白质氧化，并保持与对照相似的抗氧化状态。相反，NF水平较低κB（核因子-κB）和肿瘤坏死因子-α观察到这可能是由于HO1、MT和转化生长因子水平较高-β此外，HIF1（缺氧诱导因子-1）及其调控基因的增加；观察促红细胞生成素、血管内皮生长因子和葡萄糖转运蛋白-1。有趣的是，冬虫夏草常压氧治疗不能调节HIF1、NF的表达κB及其调控基因证明冬虫夏草本身对这些转录因子没有影响。总的来说，冬虫夏草治疗通过维持较高的细胞Nrf2、HIF1和降低NF来抑制缺氧诱导的氧化应激κB级。这些发现为冬虫夏草可能用于耐缺氧提供了依据。
1.简介
适应气候是首次前往高海拔地区的人们面临的一个主要问题。极端寒冷、缺氧、低湿度、高风速和高太阳辐射强度等不利环境条件[1–三]导致全球范围内发生高原反应的风险。常见的问题是急性高原病（AMS）、失眠、食欲不振、疲倦、嗜睡、胃部不适、不愿意工作、骨骼和肌肉退化、高空肺水肿（HAPE）、高空脑水肿（HACE），所有这些都会导致不适应气候的人的身心表现下降[4–8]. 这些问题可能会迅速升级，有时结果也可能是致命的。
为了使个体或细胞适应缺氧条件，他们必须能够感知氧张力的变化并做出相应的反应。这些反应的启动可能很快，包括生化内稳态、转录因子的重编程和基因表达，这些变化导致产生对细胞起保护作用的蛋白质。主要的氧和氧化还原敏感转录因子（TF）是核因子-（红细胞衍生2-）样2（Nrf2）、低氧诱导因子1（HIF1）和核因子-κB（NFκB） ●●●●。抗氧化反应元件（ARE-）驱动的基因和酶的表达是由Nrf2 cap‘n’collar bZIP转录因子引导的。其中包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘苷-S-转移酶（GST）、血红素氧化酶（HO）、超氧化物歧化酶（SOD）和铁蛋白。HIF1在缺氧中被选择性稳定，这反过来导致几个基因的激活，如促进红细胞生成的红细胞生成素（EPO）、调节血管张力的一氧化氮合酶（NOS）、促进血管生成的血管内皮生长因子（VEGF）和葡萄糖转运蛋白-1（GLUT1）调节能量代谢。相反，NFκB激活与炎症反应以及调节细胞对氧化损伤的反应有关的基因。法国试验标准κ通过基因网络的诱导，B在先天性和适应性免疫以及细胞生存中发挥着重要作用[9,10]. 所有这些事件对于细胞在缺氧环境中的生存至关重要。
从古至今，草药一直被用来增强身体机能，但直到最近，通过受控临床试验进行的科学审查才被用于研究这种效果。目前有几种草药被用来增强身体机能，而没有科学证据证明其有效性：一种潜在的补充剂还没有很好的特性冬虫夏草（伯克）Sacc，喜马拉雅高山栖息地（海拔3600-5000米）特有的真菌。据报道，这种真菌具有广泛的生物学功能，例如用作春药[11]，止痛药[12]和免疫调节剂[13]和自由基清除剂[14]. 人类临床试验证明了冬虫夏草发酵菌丝体对抗性欲和雄性力下降[15,16]. 在一项针对老年慢性疲劳患者的临床研究中，结果表明，大多数受试者接受冬虫夏草纯菌丝体在疲劳、感冒不耐受、头晕、频繁夜尿症、耳鸣、性欲减退和健忘症方面有显著的临床改善，而安慰剂组没有改善[17–19]. 西藏和尼泊尔高海拔山区的居民消费冬虫夏草声称它给了他们能量并抵消了高原病的症状，而在西方，它被运动员和老年人所消耗。近年来，冬虫夏草已在动物和在体外抗衰老作用、性功能活性和免疫调节等潜在用途的研究[20,21].
我们对冬虫夏草首次在肺上皮细胞（A549）中补充低氧诱导的氧化应激，其中冬虫夏草在改善氧化应激对缺氧的影响方面，从分子水平进行了研究。此外，评估冬虫夏草在适应高原疾病的过程中，也可以提高使用的可能性冬虫夏草作为一种有效的天然治疗剂。鉴于上述情况，本研究旨在评估冬虫夏草在耐缺氧过程中。
2.材料和方法
2.1. 仪器
HPLC Waters、ASE 350 Dionex Corporation（美国加利福尼亚州桑尼维尔）、分光光度计Bio-Rad.ELISA读卡器（美国分子器件公司）、荧光分光光度仪（美国瓦里安）。
2.2. 试剂
1,1′-二苯基-2-苦味酸[DPPH]、3,4,5-三羟基苯甲酸[没食子酸]、TPTZ[2,4,6-三吡啶-s-三嗪]、6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬-2-羧酸[Trolox]、芦丁、Folin-Ciocalteu试剂和所有其他化学品均来自美国Sigma-Aldrich chemicals。所有HIF1、NF的特异抗体κB、 Nrf2、TNFα、TGFβ、VEGF、EPO、GLUT1、HO1、MT1和HRP结合二级抗体购自美国加利福尼亚州圣克鲁斯生物技术公司。
2.3. 植物材料收集
冬虫夏草菌丝体（凭证样本DIP-CS/2011）从Haldwani国防生物能源研究所获得。冬虫夏草是在雨季（5月至6月）从西北喜马拉雅山脉丘陵地区（海拔4000米以上）的原木和树桩上采集的，这些丘陵地区位于印度乌塔拉坎德皮托拉加尔的不同位置，该植物在自然条件下广泛生长。只选择成熟的子实体（见红棕色的开放盖），取出，用纳米纯水清洗，在干净无尘的环境中阴凉干燥，并用杵和研钵研磨成粉末。
2.4. 提取程序
水提取物冬虫夏草使用配备溶剂控制装置的加速溶剂萃取系统（ASE 350）制备（美国加利福尼亚州森尼维尔迪奥尼克斯公司）。以水为溶剂进行三次萃取。提取程序如下：（i）将粉末样品装入试管，（ii）将高纯度水填充至1500 psi的压力，（iii）静态提取15次min，（iv）用萃取溶剂（细胞体积的60%）冲洗细胞，用N2气体（viii）从细胞中清除溶剂，最后进行减压。在提取期间，对整个系统进行冲洗，以克服任何提取物夹带。将提取物冻干（Allied Frost，印度）并储存在4°C下。
2.5. HPLC指纹图谱
水提取物的HPLC分析冬虫夏草使用配备Waters 515 HPLC泵、Waters 717 plus自动采样器和Waters 2487紫外线检测器的Waters HPLC系统（美国Waters公司）进行。在对称C18 250 mm×4.7 mm ID中进行分离，5μm柱（Waters，USA），保持流动相（0.01 m KH）的等速流速（1 mL/min）2人事军官4pH 3.7:甲醇90:10），在260 nm吸光度下检测到峰。
2.6. 总酚含量的测定
使用基于Folin-Ciocalteu试剂（FCR）的分析，使用20μL提取物储备溶液（1 mg/mL），80μl水，500μFCR的L[22]. 在室温下在黑暗中孵育5分钟后，400μ添加7.5%碳酸钠溶液L。在室温下将混合物在黑暗中进一步培养30分钟，并在765 nm处读取吸光度。使用由没食子酸（0.1 mg/mL）溶液制备的标准曲线，将提取物中的总酚（mg/g）表示为没食子酸当量（GAE）。
2.7. 总黄酮含量的测定
用氯化铝（AlCl）估算总黄酮含量三)其他地方描述的比色分析[23]以芦丁为标准。将1mL提取物添加到4mL蒸馏水中，然后添加0.3mL 5%NaNO2添加了解决方案。5分钟后，加入0.3 mL 10%氯化铝三添加溶液并静置5分钟，然后向混合物中添加0.2 mL 4%NaOH溶液，并用蒸馏水将体积调节至10 mL。在510 nm处读取混合物的吸光度。提取物中的总黄酮含量（mg/g）表示为芦丁当量。
2.8. 三价铁还原抗氧化能力测试
FRAP分析使用别处描述的方法进行估算[24]. 新鲜FRAP工作溶液通过混合25mL 300mM乙酸盐缓冲液（3.1g C2H（H）三氧化钠23小时2O和16毫升C2H（H）4O（运行）2，pH 3.6）、2.5 mL 10 mM TPTZ（在40 mM HCl中的2，4，6-三吡啶基-s-三嗪）和2.5 mL 20 mM FeCl三·6小时2O溶液，使用前在37°C下加热。150 μ允许L提取物（1 mg/mL）与2850反应μL的FRAP溶液在黑暗中放置30分钟，在593 nm处读取显色的吸光度。使用从Trolox溶液制备的标准曲线，结果表示为mg Trolox-当量/g提取物。
2.9. DPPH测定
使用别处描述的方法评估DPPH分析[25]. 通过用100 mL甲醇溶解24 mg DPPH来制备DPPH分析储备溶液，然后将其储存在−20°C下，直到需要为止。通过使用分光光度计将10 mL储备溶液与45 mL甲醇混合，在515 nm处获得1.10±0.02单位的吸光度，从而获得工作溶液。150 μ允许L叶提取物溶液与2850反应μ将DPPH溶液置于黑暗中2小时。然后在515 nm处测量吸光度。标准曲线在25至200 ppm Trolox之间呈线性。结果以毫克TE/g提取物表示。
2.10. 2′-叠氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵（ABTS）测定
使用别处描述的方法进行ABTS分析[26]. 将ABTS原液（7 mM）和过硫酸钾（2.45 mM）按1:1的比例混合，并在室温下在黑暗中培养过夜。通过培养250个μL化学生成的ABTS•+含10的过硫酸钾中的自由基μL提取物或抗坏血酸标准品。在添加提取物或标准物后，每隔1、2、5、10和15分钟在734 nm处用分光光度法测量吸光度。不含ABTS的提取物•+作为检测对照。
2.11. 细胞和培养条件
A549电池（1×105 细胞/mL）置于组织培养瓶中，并在常压（21%O2，74%牛顿2和5%CO2)37°C，在补充有10%热灭活胎牛血清（美国圣路易斯西格玛）和青霉素-链霉素（50μg/mL，Invitrogen）。缺氧条件是通过在培养箱（法国圣纳泽尔州Jouan）中用0.5%的氧气培养细胞来实现的2，5%一氧化碳2和94%N2大气。用冬虫夏草提取物（2.5mg/mL原液）溶于培养基中，处理一小时后，将细胞暴露于缺氧中。
2.12. MTT（甲基噻唑四氮唑）细胞毒性试验
MTT法基于代谢活性细胞将黄色四氮唑盐转化为紫色甲赞晶体，提供了活细胞的定量测定。将密度为10000个/孔的细胞接种在96孔组织培养板中，使其在37°C下粘附24小时。然后用2.5、5、10、25、50、100、250、500和1000处理细胞μg/mL浓度冬虫夏草溶解在DMEM介质中。将细胞暴露于常氧和缺氧条件下24小时或48小时，通过MTT法评估细胞毒性。简单地说，50μ向每个孔中添加L MTT（1 mg/mL），并在37°C下培养4 h。福尔马赞晶体在100中溶解μL二甲基亚砜，在室温下摇晃培养5分钟。在570 nm处以630 nm作为参考滤光片获取吸光度。未经处理的细胞给予的吸光度被视为100%的细胞存活率。
2.13. 生化分析
在常氧和低氧暴露后，通过胰蛋白酶化收集细胞，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）清洗。然后在PBS中对细胞进行声波处理10秒，并在4°C下以1500 g离心（德国慕尼黑西格玛公司）10分钟。丢弃含有组织/细胞碎片的颗粒，并使用上清液测定ROS、GSH、脂质过氧化、蛋白质氧化、GR、GPx和SOD活性。通过Lowry等人的方法测定匀浆中的蛋白质含量[27].
2.14. 细胞内氧化还原状态的测定
使用荧光染料2,7-二氯荧光素二乙酸酯（H2-DCFH-DA）测量细胞内氧化还原状态水平。简单地说，细胞用HBSS清洗一次，然后在含有5-10的同一缓冲液中培养μg DCFH-DA，在37°C下放置30分钟。使用Spectra Max Gemini EM（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）在485nm的激发和530nm的发射下检测细胞内荧光。
2.15. 脂质过氧化
采用别处描述的方法，通过测量硫代巴比妥酸（TBA）反应形成的丙二醛（MDA）作为硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）来评估脂质过氧化[28]. 以硫代巴比妥酸盐为标准，脂质过氧化物水平表示为nmol MDA/mg蛋白质。
2.16. 蛋白质氧化
用2，4-二硝基苯肼（DNPH）衍生后，通过测定羰基来测定蛋白质氧化[29]. 羰基含量根据其摩尔吸收系数计算为22000 m−1 厘米−1结果表示为nmol蛋白羰基/mg蛋白。简单地说，在50°C下培养等量上清液和10 mM DNPH/2M HCl 60分钟。然后用20%三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白质，并通过1400 g离心10 min去除未反应的DNPH。用冷乙醇/乙酸乙酯（1:1）混合物洗涤沉淀三次，最后将沉淀溶解在1 M NaOH中。在450 nm处测量吸光度，得出羰基含量为nmol/mg蛋白质。
2.17. 酶和非酶抗氧化剂
还原型谷胱甘肽（GSH）水平通过其他地方描述的方法进行荧光测量[30]. 根据制造商的说明，使用商业试剂盒（Randox）测定谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘苷还原酶（GR）的活性。
2.18. 细胞蛋白制备与蛋白质印迹
在指定的处理后，用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞三次，并在冰镇裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，120 mM NaCl，10 mM氟化钠，10 mM焦磷酸钠，2 mM EDTA，1 mM原钒酸钠，1mM苯基甲基磺酰氟、1%NP-40和蛋白酶抑制剂混合物）。细胞裂解物通过12000 rpm离心30分钟进行澄清。40 μg蛋白质在10–12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上溶解，然后将其转移到硝化纤维素膜上（0.45μ). 用相应的一级抗体（Nrf2、HO1、MT、NF）探测膜κB、 TNF公司α、TGFβEPO、GLUT1、VEGF），然后是HRP结合的次级抗体。使用化学发光试剂（美国西格玛）检测免疫印迹，并使用X射线胶片（美国纽约州罗切斯特柯达市）显影免疫印迹条带。使用Labworks软件（UVP BioImaging Systems）通过密度测定进行定量。
2.19. 数据分析
所有实验均在三种不同的场合进行，数据均以平均值±标准偏差表示。数据采用单向方差分析，然后采用Dunnet检验，用GraphPad软件进行对照组和各组的比较。统计显著性估计为5%。
3.结果
3.1. 用总酚、黄酮含量、抗氧化活性和指纹图谱对冬虫夏草水提取物进行化学标准化
描述了冬虫夏草。提取物的总酚含量为15.9±0.08 mg/g，类黄酮含量为10.6±0.05 mg/g(). 提取物的抗氧化活性为5.75±0.38，30.2±1.54，16.2±1.02μ分别通过DPPH、ABTS和FRAP分析证明的M TE/g提取物().显示260 nm处的HPLC色谱图。腺嘌呤的存在，腺嘌呤是冬虫夏草在提取物中的保留时间为6.43。腺嘌呤含量为0.71%w/w。
3.2. 冬虫夏草对缺氧A549细胞活性和活性氧生成的影响
我们使用不同的氧气百分比（0.1%、0.5%、1%和5%O）来测定单独缺氧的效果2)或与各种浓度的冬虫夏草提取物（5–250μg/mL）对细胞活性和活性氧生成的影响。细胞暴露在不同比例的氧气中，活性氧种类增加，细胞死亡。缺氧的细胞毒性作用取决于氧气浓度（图–和–，深灰色条）。用不同浓度的提取物处理细胞可以防止缺氧暴露后细胞死亡和活性氧的产生，其保护作用是剂量依赖性的（图–和–，浅灰色条）。因为0.5%O2显示约51%的细胞死亡和250μg/mL冬虫夏草提取物对细胞活力和活性氧生成的影响最大，所有后续实验均使用上述氧气百分比和提取物浓度进行。
水提取物的细胞保护作用冬虫夏草A549细胞暴露于不同的氧百分比（0.1、0.5%、1%或5%O）2; （a） –（d）持续48 h。与未暴露细胞（黑条）相比，暴露于低氧的细胞显示细胞死亡（深灰色条），这取决于氧百分比。水提取物处理细胞冬虫夏草缺氧暴露后细胞存活率增加，提取物的疗效呈剂量依赖性（浅灰色条）*P（P）< 0.05.
水提取物的抗氧化作用冬虫夏草A549细胞暴露于不同的氧百分比（0.1、0.5%、1%或5%O）下2; （a） –（d））持续48小时。与未暴露细胞（黑条）相比，暴露于低氧的细胞显示出活性氧水平升高（深灰色条），这取决于氧百分比。冬虫夏草低氧暴露后活性氧种类减少，提取物的疗效呈剂量依赖性（浅灰色条）*P（P）< 0.05.
3.3. 脂质过氧化
由于缺氧暴露导致氧化应激增加，我们测定了脂质过氧化水平。低氧暴露导致脂质过氧化显著增加，MDA水平升高。然而，冬虫夏草与相应的缺氧暴露细胞相比，治疗显著抑制了低氧诱导的脂质过氧化(;P（P）< 0.05). 正常氧细胞和冬虫夏草处理后的细胞保持在常氧条件下。
在（0.5%O2)分光光度法测定缺氧48h。在暴露于低氧的细胞中，观察到脂质过氧化和蛋白质氧化显著增加，并且用冬虫夏草摘录。实验一式三份。数值为三个单独实验的平均值±SE*P（P）< 0.05.
3.4. 蛋白质氧化
用DNPH衍生A549细胞后，通过测定蛋白质羰基含量来测定缺氧对蛋白质氧化的影响。结果表明，与对照组相比，缺氧暴露细胞中的蛋白质氧化显著增加。冬虫夏草处理明显抑制了蛋白质羰基水平的形成(;P（P）<0.05）。在用冬虫夏草保持在相对于常氧对照细胞的常氧条件下。
3.5. 谷胱甘肽状态与抗氧化酶活性
为了评估内源性非酶抗氧化剂的水平，测定了谷胱甘肽。与常氧对照细胞相比，A549细胞暴露于低压缺氧导致GSH水平显著降低(;P（P）< 0.05).冬虫夏草低氧暴露后，治疗显著增加了谷胱甘肽水平，但两组间无差异冬虫夏草处理常氧细胞和控制常氧细胞().
表1
水提取物的保护作用冬虫夏草缺氧对细胞抗氧化状态的影响。
| 治疗 | GPx（单位/升） | 超氧化物歧化酶（U/mL） | 希腊（U/L） | 谷胱甘肽（mM） |
|---|
| 控制 | 400.7 ± 38.8 | 24.4 ± 1.74 | 42.3 ± 2.23 | 9.01 ± 0.32 |
| 缺氧 | 328.0 ± 22.2* | 48.4 ± 3.46* | 14.9 ± 0.82* | 3.34 ± 0.26* |
| 控制+提取 | 400.9 ± 18.9 | 26.6 ± 2.02 | 43.8 ± 2.84 | 8.83 ± 0.33 |
| 缺氧+提取物 | 386.9 ± 20.4 | 32.7 ± 2.46* | 44.7 ± 2.62 | 7.86 ± 0.38 |
如所示，相对于常氧细胞，暴露于缺氧导致SOD活性显著增加，GPx和GR活性降低(P（P）< 0.05).冬虫夏草治疗使这些酶的水平保持在与对照值相似的水平，表明氧化应激降低。
3.6. 血红素氧化酶-1和金属硫蛋白水平
考虑到冬虫夏草治疗显著抑制了低氧暴露细胞的ROS并维持了其抗氧化状态，我们研究了这种防止氧化应激的能力是否通过Nrf2、HO1和MT介导。因此，通过免疫印迹法测定了Nrf2，HO1和MT3的相对水平。相对于常氧对照细胞，细胞暴露于缺氧导致Nrf2、HO1和MT显著增加().冬虫夏草与正常氧细胞相比，治疗和低氧暴露进一步增加了Nrf2、HO1和MT水平的表达。
的影响冬虫夏草抗氧化转录因子（Nrf2；（a））及其调控基因血红素氧合酶-1（HO1；（b））和金属硫蛋白1（MT；（c））在A549细胞（0.5%O）中表达的处理2)缺氧暴露48小时后，Nrf2、HO1和MT水平显著增加，并且在缺氧暴露后冬虫夏草摘录。这些数字代表了三个独立的实验。用肌动蛋白对其进行标准化，以观察其表达的任何变化。
3.7. NF的作用κ细胞保护学B
研究NF的作用κB介导的保护诱导机制冬虫夏草NF处理κ检测B及其靶基因。它是调节炎症介质的关键转录因子。我们测定了活性NF的相对水平κB通过免疫印迹。细胞缺氧导致NF显著增加κB级；然而，冬虫夏草治疗显著减弱NFκB表达式().
Western blot分析显示NF显著增加κB（a）和促炎细胞因子TNFα（b） 而抗炎细胞因子TGF水平没有变化β（c） 缺氧后A549细胞（0.5%2)暴露48小时。用提取物处理细胞可防止NF增加κB和TNFα低氧暴露后的水平。此外，TGF增加β水平也很明显冬虫夏草处理过的细胞。这些数字代表了三个独立的实验。这些被归一化为β-肌动蛋白（d），以观察表达的任何变化。
自NF以来κB调节炎症介质，我们测定促炎和抗炎分子，如TNFα和TGFβ。TNF大幅增加α低氧暴露后相对于对照细胞的水平。然而，TGF没有变化β低氧暴露后的细胞内有明显的水平。冬虫夏草治疗显著减弱缺氧诱导的TNF增加α级别。有趣的是，转化生长因子的水平β增加于冬虫夏草处理().
3.8. 冬虫夏草对HIF1表达及其调控基因的影响
免疫印迹法检测A549细胞HIF1水平。结果表明，缺氧暴露期间HIF1表达显著增加。有趣的是，冬虫夏草缺氧条件下处理的细胞HIF1蛋白进一步增加(). 了解缺氧和冬虫夏草处理后的细胞导致其下调基因的表达增加，对EPO、GLUT1和VEGF进行western blotting，这些基因分别促进红细胞生成、葡萄糖转运和血管生成。缺氧和缺氧状态下，VEGF和GLUT1蛋白水平显著增加冬虫夏草处理过的细胞。EPO蛋白在缺氧和冬虫夏草处理().
缺氧后A549细胞HIF1（a）和HIF1调节基因，即EPO（b）、GLUT1（c）和VEGF（d）的免疫印迹分析2)暴露48小时冬虫夏草缺氧暴露后HIF1、EPO、GLUT1和VEGF水平增加。这些数字代表了三个独立的实验。这些被归一化为β-观察肌动蛋白（e）表达的任何变化。
4.讨论
在初步实验中，A549细胞暴露于0.1%、0.5%、1%和5%不同比例的氧气中24–48小时，结果显示细胞死亡率为70–77%、42–51%、32–44%和15–27%，活性氧种类分别增加6.6–7.4、5.3–6.7、4.3–5.1和3.5–4.3倍。研究结果表明，细胞死亡是由于氧含量和缺氧持续时间控制的氧化应激增加所致。根据初步数据，氧的最佳百分比为0.5%2以0.1%O计2氧气百分比将细胞存活率降低至23–30%，而氧气浓度分别为1%和5%2导致最小的细胞死亡。在另一项研究中，细胞暴露于不同浓度的冬虫夏草提取物（2.5–1000μg/mL），并且A549细胞没有表现出任何毒性就其本身而言. The concentration of冬虫夏草提取低于5μg/mL无效，细胞处理超过250μg/mL不能进一步提高提取物的功效；因此，有效剂量范围为5–250的数据μg/mL仅在图中显示–和–.水提取物的有效剂量范围冬虫夏草缺氧48h暴露时间为5～250小时μg/mL；然而，最佳结果是250μg/mL（相对于所有氧气百分比）。因此，我们使用了0.5%的O2和250μg/mL冬虫夏草除MTT和ROS外的所有研究中的提取物。
本研究表明冬虫夏草通过增加Nrf2和HIF1以及减少NF，可以显著改善缺氧耐受性κB转录因子。这反过来导致抗氧化基因、抗氧化酶、EPO、VEGF和GLUT1水平增加，促进更好的氧合、氧气输送和葡萄糖转运。同时NF减少κB水平导致促炎细胞因子如TNF的表达降低α抗炎细胞因子TGF的表达增加β所有这些变化都有助于提高冬虫夏草处理过的细胞。据我们所知，我们首次证明了冬虫夏草诱导耐缺氧治疗。
缺氧期间，可还原为H的氧气较少2细胞色素氧化酶上的O，导致高活性氧中间体（ROI）的积累。ROI的过度生产很容易导致各种生物大分子的氧化损伤，导致DNA损伤、关键氨基酸侧链的氧化、蛋白质-蛋白质交联的形成、多肽骨架的氧化导致蛋白质断裂和脂质过氧化。本研究还报告称，A549细胞暴露于低氧环境下会导致活性氧水平显著增加，而活性氧水平又可能是导致细胞蛋白质和脂质氧化增加的原因。对于低氧相关自由基，抗氧化剂可以安全地与自由基相互作用，并在重要的生物大分子受损之前终止连锁反应。细胞抗氧化剂防御网络包括众所周知的内源性酶超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx），以及非酶抗氧化剂还原谷胱甘苷（GSH）。这些参与维持健康细胞中自由基和抗氧化剂的适当平衡。暴露于低氧的细胞GSH水平下降，为了应对低氧诱导的应激，观察到细胞抗氧化酶（如SOD、GPx和GR）活性显著增加。然而，冬虫夏草补充抗氧化剂后，抗氧化酶水平保持在与对照值相似的水平，并恢复谷胱甘肽水平。研究结果表明冬虫夏草通过激活内源性抗氧化酶，抑制蛋白质和脂质过氧化，发挥其强大的抗氧化防御能力，因为酚类、黄酮类、核苷（腺苷）、碱基（腺嘌呤和尿嘧啶）和多糖的含量较高；这些化合物吸收和中和自由基，淬灭单线态和三线态氧，或分解过氧化物[31]. 这一结果与其他报道一致，即天然和培养的水提取物虫草属物种在清除自由基方面比在疏水系统中更有效[32]. 姚明的团队[33]据报道冬虫夏草菌丝体具有直接和温和的抗氧化活性，包括清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和抑制脂质过氧化。他们还提出，水提取物的抗氧化活性可能是由蛋白质、多糖、甘露醇或其他一些化合物在冬虫夏草菌丝体。然而，Li等人[34]观察到冬虫夏草菌丝体具有较强的抗氧化活性，部分纯化的水提取物多糖的抗氧化活性比纯化前提高了10倍至30倍。因此，多糖可被视为其抗氧化活性的关键成分冬虫夏草菌丝体。
越来越多的证据表明，细胞氧化还原不仅在细胞生存中起着重要作用，而且在细胞信号通路中，如NFκB.一些实验室已经证明用H处理细胞2O（运行）2（ROI）可以激活NFκBauerle和Henkel审查的B途径[35]. Shih等人[36]证明羟基自由基主要负责NF的活化κB在Jurkat细胞和巨噬细胞中。在缺氧期间，ROIs水平的升高促使人们推测ROIs可能作为NF的共同介质发挥作用κB也激活。自NF以来κB与炎症有关，因此我们分析了NF的表达κB及其促炎介质TNFα在暴露于缺氧的细胞中。NF显著增加κB和TNFα低氧时出现水平；然而，冬虫夏草治疗+缺氧显著抑制NFκB和TNFα表达可能是由于低氧诱导的氧化应激减少，表明细胞对低氧应激的防御作用。这一假设与早先的一份报告相一致，该报告中的证据表明，几乎所有导致NF的途径κB的活化可被多种抗氧化剂阻断，包括吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）、N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）、谷胱甘肽（GSH）或硫氧还蛋白（Txn），或通过过表达抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶或硫氧还原酶过氧化物酶。如上所述，冬虫夏草具有强大的抗氧化性能。
根据上述结果和报告的事实，我们假设冬虫夏草治疗抑制缺氧暴露细胞的氧化应激和炎症反应。因此，我们探讨了内源性抗氧化系统的主要调节因子Nrf2转录因子表达变化的可能性[36–38]参与细胞存活。我们发现了冬虫夏草+低氧处理导致Nrf2水平显著升高。在证实了Nrf2的表达后，我们研究了已知具有抗氧化和抗炎活性并受Nrf2调节的HO1的水平[39]. 我们的结果表明冬虫夏草+缺氧导致HO1水平升高。我们还测量了其他抗炎介质，如TGFβA549细胞中的MT水平。研究显示TGF显著上调β和MT之后冬虫夏草+低氧治疗，所有这些基因都可能与低氧暴露后观察到的促炎性细胞因子下降有关。我们的结果与之前的报告一致[40]说明激活Nrf2可有效降低大鼠的氧化应激和炎症。TGF的类似过度表达βHO1和MT促进适应并维持细胞内的氧化还原平衡[41,42]. 的容量冬虫夏草在限制氧化应激中，Nrf2途径部分介导。
缺氧已被证明能激活HIF1，因此，我们试图研究HIF1的表达变化，并确定HIF1的功能参与，以应对冬虫夏草治疗。我们发现了冬虫夏草缺氧暴露前1h处理导致HIF1水平显著升高；这表明HIF1介导的基因表达可能与低氧诱导耐受有关。因此，我们通过免疫印迹法测定了对照组和对照组HIF1调节基因、EPO、GLUT1和VEGF的相对水平冬虫夏草处理过的细胞。冬虫夏草缺氧处理导致EPO水平升高，EPO水平增加，O增加2承载能力。此外，GLUT1介导葡萄糖转运的蛋白质水平在缺氧和冬虫夏草+低氧细胞与对照细胞相比，表明在低氧环境中葡萄糖摄取增加，以持续产生能量。我们的结果与之前的研究一致，表明CordyMax CS-4补充剂通过提高胰岛素敏感性有效降低血糖和血浆胰岛素，并改善葡萄糖代谢[43]. 据推测，当组织中的细胞缺氧时，它们会释放血管生成因子，诱导新的毛细血管生长，从而改善氧的运输[6]. 在已知的血管生成因子中，FGF和VEGF最常见表达[8]. 在我们的研究中，我们也发现缺氧细胞和冬虫夏草+缺氧暴露细胞相对于对照细胞。这些结果表明，特异性HIF1及其调控基因的诱导冬虫夏草缺氧后处理的细胞是细胞尝试启动适应过程以逃避死亡。不同转录因子之间的推测相关性和水提取物的耐受机制冬虫夏草缺氧的示意图表示为.
低氧作用和水提取物的示意图冬虫夏草在A549细胞中。各种转录因子与耐缺氧、缺氧后上调/下调（实心箭头）和缺氧后上调/下调机制之间的假定相关性冬虫夏草处理方式（虚线箭头）。
得出的结论是，细胞暴露于缺氧导致氧化应激显著增加；此外，NF显著增加κB活性和炎症介质TNFα.细胞治疗冬虫夏草(250 μg/mL）显著减轻缺氧时的氧化应激。这归因于Nrf2-ARE途径激活，NF减少κB活性，并通过HIF1信号机制增加氧气可用性。此外，更高水平的抗氧化、抗炎介质，即TGFβ、HO1和MT水平冬虫夏草处理过的细胞也可能负责细胞对缺氧的耐受。这项研究的发现将有助于开发新的治疗策略来使用冬虫夏草作为一种提高对高海拔地区耐受性的营养品。
致谢
作者感谢德里DIPAS主任的不断支持和建设性建议，感谢印度哈尔德瓦尼DIBER主任提供的研究材料。我们感谢德里贾米亚·哈姆达德大学的赛义德·艾哈迈德博士对提取物进行HPLC分析。
工具书类
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