图3

(A类)胰岛素和雷帕霉素对CAD磷酸化位点的影响。在用胰岛素刺激（3 h，50 nM）之前，用二甲基亚砜或雷帕霉素（20 nM）处理1h，从缺血清（16 h）的HEK-293E细胞中免疫纯化FLAG-HA-CAD。绘制了不同条件下CAD上指示位点的磷酸化与总肽水平的比值，通过LC/MS/MS测量为总离子电流（TIC）。ND=未检测到磷酸肽。

(B类)将表达空载体（EV）或野生型（WT）、S1859A或S1900A版本的FLAG-HA-CAD的HEK-293E细胞血清饥饿（16小时）并用胰岛素刺激（1小时，100nM）。用磷酸-14-3-3结合基序抗体（P-Ser基序）对FLAG免疫沉淀物进行免疫印迹。

(C类)细胞按（B）处理，但在胰岛素刺激前用雷帕霉素（20 nM）或S6K1抑制剂PF-4708671（10μM，S6K1i）预处理1 h。

(D类)细胞按（C）处理，但也转染靶向S6K1、S6K2或两者的siRNA，或非靶向对照（siCtl）。

(电子)体外用血清饥饿、雷帕霉素处理的HEK-293E细胞免疫沉淀的FLAG-HA-CAD底物（WT或S1859A）和胰岛素刺激的HEK-29.3E细胞的HA-S6K1（WT or kinase dead，KD）免疫沉淀进行激酶分析。

(F类)在用胰岛素（100 nM）或EGF（20 ng/mL）刺激1小时之前，对Hela细胞进行血清饥饿（16小时），并用雷帕霉素、S6K1i或MEK抑制剂U0126（10μM）预处理1小时。