图5。谷氨酰胺缺乏抑制细胞增殖并降低细胞内ATP水平。(A类)谷氨酰胺缺乏降低了ATP水平。WT和第5天^−/−MEF在完整培养基中播种，以在处理当天达到50%的融合，然后在收获前的指定时间段内，在添加或不添加谷氨酰胺（4 mM）、2-DG（10 mM）或甲基丙酮酸（10 mM）的情况下，在添加了血清的DMEM（不含谷氨酰胺）中生长。按照材料和方法中的描述进行ATP分析。谷氨酰胺缺乏和2-DG处理抑制细胞增殖。WT和第5天^−/−MEF接种在完整培养基中，在处理当天达到10%的融合，然后在添加和不添加谷氨酰胺（4 mM）的血清DMEM中生长，或在含有2-DG（10 mM）全培养基中生长指定的时间段。通过与0h时的相对细胞增殖（通过方法中所述的细胞增殖试验确定）进行比较，计算每个处理的相对细胞增生，设为1。三个独立实验的结果显示为平均值±SD。进行Student t检验以确定（a）对照组（24/48 h）和-Gln（24/48h）之间的差异；（b） 对照组（24/48小时）和2-DG组（24-48小时）。(B类)DM-2-KG和NAC均能挽救细胞增殖。WT和第5天^−/−将MEF接种在完全培养基中，在处理当天达到10%的融合，然后在含有DM-2-KG（7 mM）、NAC（2 mM）或两者的谷氨酰胺缺失DMEM中生长。通过细胞增殖测定来评估细胞增殖。使用Student t检验计算Gln（-）中的WT MEFs（24/48/72小时）和DM-2-KG/NAC/DM-2-KG和NAC的组合中的WT MEFs（24/48/72小时）之间的显著性；第5天^−/−Gln中的MEF（-）（24/48/72小时）和第5天^−/−DM-2-KG/NAC中的MEFs/DM-2-KG和NAC的组合（24/48/72小时）；NAC中的WT MEF（24小时）和第5天^−/−NAC中的MEF（24小时）。(C类)补充NAC可以拯救谷氨酰胺分泌细胞的增殖。使用RTCA DP分析仪实时监测细胞增殖。m5-7细胞维持在没有或有Dox关闭的培养基中附件5表达式（右侧面板）。在有无NAC补充剂的情况下提取谷氨酰胺，每30分钟测定并记录细胞生长(D类)支持WT增殖所需的最低谷氨酰胺浓度第5天^−/−MEF公司。如材料和方法中所述测定细胞增殖。简单地说，将5000个细胞接种到96-well培养皿中过夜，并在切换到具有指示谷氨酰胺浓度（0、0.5和4 mM）的培养基之前培养过夜，而4 mM代表完整的培养基。在24、48和72小时后测定细胞存活率，并将相对细胞增殖百分比计算为72小时的100%。Gln（-），在不含谷氨酰胺的DMEM中生长；Gln（+），在含有谷氨酰胺的DMEM中生长；DM-2-KG，二甲基-2-酮戊二酸；2-DG，2-脱氧葡萄糖；NAC，N-乙酰半胱氨酸；强力霉素。(A和B)结果显示为三个独立实验的平均值±SD*p<0.05。