树突状细胞限制NASH的纤维炎症损伤

摘要

介绍

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是代谢综合征的肝脏后果，包括胰岛素抵抗、高血压、高脂血症和内脏肥胖。肥胖本身是NAFLD的一个独立风险因素，NAFLD目前被认为是美国最常见的肝功能障碍原因，占所有慢性肝病病例的75%。¹此外，未来的预测估计，到2030年，50%的美国人将具有NAFLD的特征。¹在大多数NAFLD病例中，肝脏脂肪变性是轻微且可逆的；然而，10-20%的病例进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其特征是肝内炎症加剧、脂肪变性加重、肝细胞损伤和早期纤维化。²此外，NASH可发展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌。2000年至2010年间，美国NASH原位肝移植的比例从1.2%上升到7.4%。^三

NASH的确切细胞和生化病因尚不完全清楚。然而，一个“双重打击”的假设正在获得实验性的支持。一般来说，“第一次打击”的肝脏脂质积聚被认为会导致氧化应激和肝细胞损伤，从而使肝脏受到炎症细胞浸润——“第二次打击”——导致进一步炎症损伤和最终纤维化的周期性发展。许多炎症介质也受到牵连。枯否细胞（KC）位于肝窦内，通过Toll-like receptor（TLR）9介导的IL-1β的产生导致肝细胞死亡。⁴活化KC产生TNF-α对NASH的纤维化发展至关重要。⁵此外，在缺乏KC的情况下，喂食蛋氨酸-胆碱缺乏饮食（MCD）的小鼠可以减轻NASH。⁶中性粒细胞也是NASH肝细胞损伤的重要介质。中性粒细胞被坏死的肝细胞激活，通过释放促炎细胞因子和分泌髓过氧化物酶（MPO）使肝炎永久化，髓过氧化物是一种丰富的自由基来源，通过增加肝细胞氧化损伤导致疾病进展。⁷研究表明，肝中性粒细胞与淋巴细胞比率的增加增加了NASH患者脂肪变性进展为脂肪性肝炎并最终纤维化的可能性。⁸

树突状细胞（DC）是启动有效的适应性免疫反应的专业抗原呈递细胞（APC）。DC最近也成为非感染性慢性纤维炎的重要介质。例如，DC在哮喘加重期间调节炎症的严重程度，对于博莱霉素介导的肺纤维化是必要的。⁹在炎症性肠病中，小肠和大肠中的粘膜DC被认为是触发对内源性微生物群落的有害T细胞反应的原因。¹⁰我们最近发现，尽管DC具有激活的表型，但它可以通过限制无菌炎症在急性胰腺炎中发挥保护作用。¹¹DC在慢性肝病中的作用尚不完全明确。我们报道，在硫代乙酰胺诱导的慢性肝纤维化中，DC变得高度促炎。¹²然而，最近发现DC的补充加速了小鼠肝纤维化的解决。¹³在NASH肝脏中，我们的初步研究揭示了疾病早期表型激活DC的大量募集。基于这些数据，我们假设DC增加了NASH的炎症循环。然而，我们的调查利用了体内树突状细胞（DC）数量的减少揭示了一种更复杂的关系，因为DC通过减少KC和中性粒细胞的破坏作用来限制NASH中的纤维炎症。此外，在疾病恢复期，DC耗竭延迟了肝内炎症和纤维增生的解决。这项工作为NASH的发病机制和解决提供了新的见解，并对实验治疗中靶向DC具有潜在意义。

材料和方法

结果

NASH中肝DC人群增加

CD45的数量⁺NASH患者肝白细胞增加约3倍(图1a、b). 此外，NASH中肝脏NPC的组成与对照肝脏显著不同(图1c;S1a型). 80层/四层⁺Kupffer细胞在对照肝中从基线的20-25%扩展到NASH的40-50%。第1组⁺中性粒细胞和炎性单核细胞从对照组的约10%增加到NASH的约25%，而NKT细胞和B细胞在总NPC中均减少(图1c). 肝脏CD3的分数⁺T细胞在NASH中保持相当稳定；然而，我们观察到CD8显著向上倾斜⁺：CD4⁺比率(图1d). 此外，CD11c⁺MHCII公司⁺DC从对照肝中约5%的肝白细胞基线增加到NASH中的15-18%(图1c、e). CD11c的扩增⁺MHCII公司⁺DC在开始MCD饮食的几天内开始，稳定了2周，并且在疾病期间保持稳定升高(图1f). 相比之下，NASH患者的脾细胞组成、脾肿大或脾DC明显扩张均无变化，这意味着NASH对DC的影响是肝脏特有的(图S1b、c).

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图1

NASH肝脏DC扩张

（a）分数和（b）CD45总数⁺对照组和NASH肝脏中的白细胞（c）在C57BL/6小鼠开始MCD饮食6周后，通过流式细胞仪测定特定肝白细胞亚群的分数。（d）CD4的分数⁺和CD8⁺用流式细胞术检测对照组和NASH组肝脏中的T细胞。（e）DC标志物CD11c和MHCII在对照组和NASH肝中的共表达，在6周和（f）用流式细胞术测定喂食MCD饮食的小鼠肝脏DC募集的时间进程。每个数据点使用3-5只小鼠重复实验5次以上，结果相似（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

NASH DC产生升高的免疫调节细胞因子

由于分泌的细胞因子在NASH发病机制中至关重要，DC可以通过产生可溶性炎症介质来调节炎症，我们测试了从NASH肝脏分离的DC产生的细胞因子。与正常肝DC相比，NASH DC产生的TNFα、IL-6、MCP-1和IL-10水平升高(图2a、b). NASH DC对TLR9连接也表现出增加的细胞因子反应(图2c). 与这些观察结果一致，肝DC增加了NASH中TLR的表达(图2d).

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图2

NASH DC具有促炎性

在开始MCD饮食6周后，对C57BL/6小鼠从对照组和NASH肝脏中提取的DC进行了生产（a）TNF-α、IL-6、MCP-1和（b）细胞培养上清液中的IL-10。（c）用TLR9配体CpG ODN1826刺激后，分析细胞培养上清中IL-6和IFN-γ的DC生成。（d）对NASH和对照肝脏的DC进行TLR2和TLR4的表面表达以及TLR7和TLR9的细胞内表达分析。显示每个TLR的MFI。实验重复至少3次，结果相似（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

DC调节NASH中的肝炎和纤维化

由于树突状细胞在NASH中扩张、成熟并增强了产生炎症介质的能力，我们推测树突状病毒可能导致疾病恶化。为了验证这一点，我们采用了骨髓嵌合CD11c。可实现持续DC耗竭的DTR小鼠(图3a,S4系列). 对照小鼠使用WT小鼠的骨髓制成嵌合体。令人惊讶的是，DC人群的消融——而不是减轻肝脏损伤——恶化了疾病。特别是，与DC种群完整的NASH小鼠相比，NASH（-DC）小鼠经历了更急剧的体重减轻(图S5a). 此外，与对照组相比，NASH中的DC耗竭导致更大的肝内炎症细胞浸润(图3b). 此外，对肝脏NPC产生的细胞因子的分析表明，DC缺失导致NPC产生与NASH肝损伤相关的多种细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β(图3c)，以及对肝脏白细胞募集至关重要的趋化因子，包括MIP-1α和G-CSF(图3d). 相反，IL-10是一种调节性细胞因子，在DC缺失的情况下，其在NASH肝脏中的表达降低(图3e). NASH和NASH（-DC）肝脏中的ALT水平同样升高(图S5b). DC耗竭不会改变肝脏NPC组成(图S6a–e)或产生炎症介质(图S6f)在控制饮食的小鼠中。在正常饮食的LPS治疗小鼠中，DC耗竭同样对NPC成分没有影响(图S7).

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图3

DC耗竭加剧NASH肝脏炎症

（a）在开始MCD饮食6周后，对NASH和NASH（-DC）小鼠的脾细胞进行CD11c表达测试。（b）用抗CD45单克隆抗体对石蜡包埋的肝脏切片进行染色。CD45的数量⁺计算每个HPF的细胞数。NPC生产（c）TNF-α、IL-6、IL-1β、，（d）MIP-1α、G-CSF和（e）在对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏中测定细胞培养上清液中的IL-10。每组使用3-5只小鼠重复实验至少3次（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

肝内炎症与NASH肝细胞凋亡有相互的致病关系。¹⁶NASH（-DC）肝脏显示凋亡小体增加，这与肝内炎症加剧一致(图4a). 因此，在DC缺失的情况下，NASH肝脏中PAR4（凋亡标记）的表达增加(图4b). 与对照组相比，半胱天冬酶-3在NASH（-DC）肝脏中也更普遍(图4c). 此外，p53、Fas配体和Bcl-2是NASH中众所周知的凋亡介质，^17–18NASH（-DC）肝中的表达显著升高(图4d).

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图4

DC耗竭加剧NASH肝细胞凋亡和纤维化

（a）对开始MCD饮食6周后处死的小鼠的对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏进行TUNEL染色。每个HPF的凋亡小体数量被量化。（b）检测对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏的裂解液中PAR4的表达。（c）在对照、NASH、NASH（-DC）肝脏的石蜡切片上进行裂解的胱天蛋白酶-3染色，并对结果进行定量。（d）用PCR检测各组mRNA中的p53、Fas配体和Bcl-2。（e）对对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏进行苦味酸天狼星红（PASR）染色。通过检测每个肝脏10个HPF来量化纤维化。（f）通过PCR检测TGF-β、胶原Iα1和MMP9的表达。实验重复至少3次，结果相似（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

NASH（-DC）小鼠除了肝内炎症加剧和凋亡率增加外，还表现出加速的肝纤维化(图4e). 因此，TGF-β和胶原蛋白Iα1(图4f)与对照组相比，TIMP-1（未显示）在NASH（-DC）肝脏中的表达更高。与细胞外基质重塑相关的MMP9在NASH（-DC）肝脏中也同样增加(图4f). 综上所述，这些数据表明NASH中DC的缺失会导致肝内纤维炎症加剧。

消融树突状细胞群可增加NASH中效应细胞的扩增和激活

为了更好地了解NASH（-DC）肝脏中肝炎加重的机制，我们研究了DC人群的消融是否与与疾病发病相关的特定效应细胞亚群的代偿性扩张或激活相关。我们发现NASH中DC缺失后中性粒细胞、炎性单核细胞和KC显著增加(图5a). 免疫组织化学染色证实中性粒细胞总数增加(图5b)和KC(图5c)NASH（-DC）肝脏。相反，NK1.1的分数下降⁺NASH中的细胞在DC耗尽后保持不变(图5a). CD8（CD8）⁺T细胞也与肝内炎症有关，而FoxP3的扩张⁺Tregs与减轻肝损伤有关。^19–20我们发现，DC缺失导致肝内CD8:CD4比率显著偏斜，NASH中Tregs积聚减少(图5a). 在检测NASH（-DC）与NASH肝脏白细胞亚群总数时，也进行了类似的观察(图S8). 综上所述，这些数据表明DC可能通过调节先天性和适应性免疫细胞亚群的扩张来限制NASH的肝损伤。与这些观察结果一致，我们进一步发现Annexin V减少⁺NASH（-DC）肝脏中凋亡的KC、中性粒细胞和单核细胞(图5d–f)提示DC可能通过诱导先天效应细胞凋亡来限制NASH中效应细胞的扩张，正如我们之前在急性肝损伤中所描述的那样。²¹CD11c中的DC损耗。DTR嵌合体小鼠在NASH或LPS诱导的炎症中没有明显改变脾细胞成分，表明这种作用是DC在NASH肝脏中的作用所特有的(图S9a，b).

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图5

DC耗竭增加NASH肝脏Kupffer细胞和粒细胞增殖

（a）Gr1、F4/80和NK1.1在大体积肝NPC中的表达，CD3上CD4和CD8的共同表达⁺T细胞和CD4上FoxP3的表达⁺CD25型⁺对开始MCD饮食6周后处死的小鼠的对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏中的T细胞进行分析。（b）MPO和（c）在石蜡包埋的肝脏切片上进行CD68 IHC。每个HPF的阳性细胞数被量化。（d–f）Annexin V的分数⁺凋亡的（d）库普弗细胞，（e）中性粒细胞和（f）通过流式细胞术测定对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏中的炎性单核细胞。实验重复3次，结果相似（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

为了研究树突状细胞是否调节NASH中效应细胞的激活（除了扩增外），我们从NASH（-DC）小鼠和对照组中采集KC、中性粒细胞和炎性单核细胞，并测量其与疾病发病相关的细胞内细胞因子的表达。^4–5我们发现，缺乏DC导致NASH肝脏中KC、中性粒细胞和炎性单核细胞显著增加TNF-α和IL-1β的生成(图6a–c). NASH（-DC）肝脏中的这些细胞亚群也上调了IL-6（未显示）。此外，由于NASH的发病机制和严重程度与KC的TLR4和TLR9激活有关，^23–24我们测试了DC人群的消融是否导致TLRs的KC表达上调。我们发现NASH（-DC）肝脏KC的TLR9表达显著升高(图6d). 免疫组织化学染色证实NASH（-DC）肝脏TLR9表达增加(图6e). NASH（-DC）小鼠KC和肝组织TLR4同样上调(图6f). 综上所述，这些数据表明，DC耗竭导致NASH中固有免疫细胞的激活。

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图6

DC耗竭增加了NASH肝脏中Kupffer细胞、中性粒细胞和炎性单核细胞的激活

（a–c）TNF-α和IL-1β原在新鲜分离细胞中的细胞内表达（a）80层/四层⁺库普弗细胞，（b）第1组^您好!CD11b型⁺中性粒细胞，以及（c）第1组^国际CD11b型⁺显示来自对照组、NASH和NASH（-DC）肝脏的炎性单核细胞。（d）流式细胞术检测TLR9在Kupffer细胞中的表达。显示MFI，分数TLR9⁺对各组的Kupffer细胞进行量化。（e）使用针对TLR9的单克隆抗体对石蜡包埋的肝脏切片进行染色。每个HPF的阳性细胞数被量化。（f）80层/四层⁺用流式细胞术测定TLR4在Kupffer细胞上的表达，用PCR测定对照组、NASH组和NASH（-DC）组TLR4的全肝组织表达水平。在所有实验中，在开始MCD饮食6周后处死小鼠。实验重复至少三次，结果相似（**p<0.01，**p<0.001）。

直流电耗尽延迟了NASH的恢复

NASH在其早期阶段是可逆的。然而，DC在疾病恢复阶段的作用尚不清楚。为了研究这一点，喂食MCD饮食6周的WT嵌合体或CD11c-DTR嵌合体小鼠突然转变为正常的食物。在选定的队列中，DC在停止MCD饮食时开始耗尽。与我们的数据一致，DC在NASH中具有保护作用，DC耗竭延迟了NASH的解决(图7a). 特别是，在正常饮食恢复的第3天，DC的缺失显著延迟了肝内CD45的清除⁺白细胞浸润(图7b)，中性粒细胞浸润(图7c)，和凋亡小体(图7d). 在恢复期缺乏DC的小鼠中，残留纤维增生也更加明显(图7e). 此外，DC耗竭延迟了NASH NPC对升高的细胞因子和趋化因子分泌的解决(图7f). 在NASH恢复的第7天，对照组和缺乏DC的小鼠之间也存在类似的差异。然而，到14天时，即使在缺乏DC的小鼠中，NASH也完全消失（未显示）。综上所述，这些数据表明DC促进了NASH的复苏。

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图7

在NASH恢复过程中，DC耗竭延迟了纤维炎症的消退

（a）在停止MCD饮食三天后处死的小鼠肝脏中显示出典型的H&E染色（恢复期），在DC耗尽的小鼠中显示出MCD饮食停止（恢复期（-DC））。（b）CD45，（c）MPO，以及（d）用IHC检测恢复和恢复（-DC）肝脏中裂解Caspase-3的表达。（e）对恢复期和恢复期（-DC）肝脏进行苦味酸天狼星红（PASR）染色。通过检测每只小鼠10个HPF来量化数据。（f）测量各组细胞培养上清液中NPC产生的IL-6、TNF-α和MCP-1（n=3-5只小鼠/组；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

讨论

这是首次报道肝树突状细胞在NASH中的重要作用。我们证明，在MCD饮食开始后，DC很快被吸收到肝脏中，两周后稳定在正常水平的3-4倍，并且除非疾病得到解决，否则会保持在较高水平。NASH DC表现出活化的表面表型，并增加了两种促炎细胞因子的产生。与他们的成熟表型一致，我们的在体外实验表明，NASH DC能有效诱导异基因T细胞和抗原限制性CD4的增殖⁺T细胞同时减少CD4⁺CD25的T细胞表达⁺福克斯P3⁺Treg表型。肝损伤后肝内DC激活的发现与我们之前的报告一致，这些报告显示，在硫代乙酰胺诱导的肝纤维化和过量对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤中，肝DC发生免疫原性转化。^12,21然而，尽管其表型和功能激活，但NASH中DC的消融导致肝脏炎症增加，Treg数量减少，CD8扩增⁺T细胞，通过免疫效应细胞增强生存能力和产生促炎细胞因子，增加肝细胞凋亡，最终加速肝纤维化。这些看似矛盾的发现并非完全是史无前例的。最近的研究表明，尽管采用了促炎症表型，但肝树突状细胞可以加速肝纤维化的消退，改善肝脏缺血再灌注损伤。^13,28例如，通过Flt3配体给药对肝DC的外源性扩张加速CCl的消退₄-尽管DC的表型激活，但仍诱导肝纤维化。¹³

我们的研究结果表明，DC的作用与KC的作用形成鲜明对比，KC的扩张与NASH肝内纤维炎恶化密切相关。⁵我们的研究表明DC可能通过多种平行机制调节肝炎。重要的是，我们发现NASH肝脏中的DC具有不同的激活CD4的能力⁺T细胞与CD8的比较⁺T细胞。此外，DC耗竭后，CD8:CD4 T细胞比率明显向上倾斜，Tregs减少。Tregs在慢性肝病中的保护作用已经明确。^29–30此外，CD8的相对抑制⁺T细胞膨胀可能具有保护作用，如CD8⁺最近研究表明，T细胞可驱动脂肪组织炎症，并在NASH发病机制中发挥新的作用。^31–32

此外，与DC消融相关的肝脏损伤加剧可能与DC通过清除凋亡小体和坏死碎片限制无菌炎症的作用有关。肝脏中的无菌炎症增加了固有免疫细胞的募集、存活和激活。³³我们发现肝DC表达高水平的CLEC9A，其识别并结合坏死细胞上的死亡信号，是DC清除坏死产物的主要能力。^26,27因此，我们发现，与其他肝APC亚群和对照肝DC相比，NASH肝DC具有捕获坏死细胞碎片和凋亡靶点的显著能力。此外，我们发现DC耗竭导致肝脏无菌性炎症加重，因为NASH（-DC）肝脏中HMGB1适度升高，包括p53在内的凋亡标记物升高，这已被证明在实验性NASH中作为凋亡介体发挥关键作用。¹⁷这也导致促炎细胞因子（包括IL-1β、TNF-α和IL-6）的产生增加，并增强先天效应细胞中TLR4和TLR9的活性和表达。Miura等人证明，通过TLR9的信号传导通过KC产生IL-1β导致NASH进展。⁴KC中TLR4信号也与脂肪性肝炎的严重程度有关。⁶

DC产生IL-10也可能在限制NASH肝损伤中起重要作用。Bamboat等人最近发现，凋亡肝细胞释放的DNA刺激肝DC以TLR9依赖的方式分泌IL-10。²⁸此外，来源于肝树突状细胞的IL-10可以通过抑制炎性单核细胞功能来改善肝损伤。²⁸在变应原诱导的哮喘和顺铂诱导的肾毒性等背景下的其他研究表明，DC通过释放IL-10减轻无菌性炎症。^34–35我们发现，NASH DC与正常肝DC相比，IL-10生成显著升高。此外，在没有DC的情况下，NASH NPC产生的IL-10减少了40-60%，这表明DC产生的IL10可能在NASH中具有重要的调节作用。

有趣的是，尽管有各种证据表明DC耗竭后炎症、纤维化、肝细胞凋亡增加，NASH恢复延迟，但与DC种群完整的NASH小鼠相比，NASH（-DC）小鼠的血清ALT没有显著升高。然而，这与之前的报告一致，这些报告表明NASH的严重程度可能与血清ALT水平无关。^36–37此外，临床严重NASH患者血清ALT水平无明显升高。³⁸这些研究表明，单用ALT不能作为NASH的“硬终点”。

许多研究使用了CD11c。DTR模型用于研究DC在肝脏内各种炎症状态（包括缺血再灌注损伤和急性对乙酰氨基酚肝毒性）中的作用。^21,28类似地，CD11c。DTR模型有助于确定DC在许多肝外疾病中的作用，包括过敏性哮喘、急性肺损伤、胰腺炎和肾缺血再灌注损伤。^{11,28,39–41}然而，Tittel等人最近的一份发人深省的报告显示，CD11c中的DC耗竭。DTR小鼠与多个器官中的早期非特异性中性粒细胞增多有关，包括肝脏中的中度中性粒细胞，这意味着使用CD11c得出的结论。DTR模型可能被非特异性效应所混淆。⁴²CD11c中性粒细胞增多的机制。缺乏DC的DTR小鼠仍不确定。然而，我们没有观察到骨髓嵌合CD11c中白细胞成分的意外变化。DC耗竭后的DTR小鼠独立于NASH。对我们不同结果的可能解释是骨髓嵌合CD11c。DTR模型不受与内源性模型相关的中性粒细胞的影响。内源性CD11c。DTR小鼠与嵌合模型的不同之处在于，反复给予白喉毒素是致命的。此外，NASH中的慢性DC耗竭可能不会导致与急性单剂量耗竭相关的中性粒细胞增多。然而，CD11c。虽然DTR模型是研究小鼠体内DC作用的最佳可用工具，但并不是理想的模型，因为DC耗竭的影响可能不一定忠实地模拟原位DC的作用。因此，在出现额外的实验工具来研究DC在体内的作用之前，DC在NASH和其他炎症性疾病中的作用可能会有更多的见解。

总之，我们的数据表明，树突状细胞对脂肪性肝炎的发病机制和消退具有复杂的影响，这可能与人类疾病有关。然而，我们研究的一个局限性是，没有一个完美的模拟人类疾病的NASH小鼠模型。此外，直接将当前数据与采用MCD饮食的其他NASH小鼠研究进行比较可能会因研究之间交替的治疗持续时间而混淆。也就是说，由于NASH的发展及其消退是一个动态过程，因此在喂食MCD饮食的小鼠不同时间后，检查肝内表型和免疫环境可能会产生不一致的结果。此外，鉴于体内调节人类DC功能的技术限制，在实验治疗中通过靶向DC来中断NASH的发病机制可能具有挑战性。因此，需要进行额外的研究，以评估这些发现在治疗NASH患者或预防疾病发作方面的临床效用。

补充材料

致谢

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