人脑时空转录组

总结

介绍

人类的神经发育是一个复杂而精确的调控过程，它会持续很长一段时间^1-三这一过程的人类特有特征可能是人类专业化发展的重要因素^2,三,5,6然而，除了赋予我们非凡的认知和运动能力外，分子上独特而复杂的神经回路的形成也可能增加了我们对某些精神和神经疾病的敏感性^4,7-10此外，性别差异在大脑发育和功能方面发挥着重要作用，也是导致自闭症谱系障碍（ASD）等疾病的风险因素^10-14因此，全面了解脑转录组的时空动力学对于更好地理解神经发育、性二型性和进化以及我们对某些脑疾病的易感性增加至关重要。

以前对发育中人脑的转录组研究包括相对较小的样本量，主要集中在少数区域或发育时间点^15-19在这项研究中，我们探索了来自不同种族的男性和女性的临床上不起眼的捐赠者的发育中和成人死后大脑中16个区域的转录组。

研究设计、数据生成和质量控制

为了研究人脑转录组的时空动力学，我们创建了一个从胚胎发育到成年晚期的15个时期的系统(表1;补充信息2.1). 我们从每个周期的多个样本中采集了16个大脑区域的短暂产前结构和未成熟和成熟形式，包括11个NCX区域(表2;补充信息2.2;补充图1-3;补充表1). 11个NCX地区以下统称为NCX地区。我们还使用Illumina 250万SNP芯片对捐赠者的DNA进行了基因分型(补充图4;补充表2). 本研究仅包括临床上无显著异常的供体大脑，没有大规模基因组异常的迹象（N=57，包括39个大脑半球；年龄5.7周至82岁；性别，31名男性和26名女性；死亡间隔（PMI），12.11±8.63小时[平均±SD]；pH，6.45±0.34[平均±SD]）。

使用从1340个解剖组织样本中提取的总RNA进行转录组分析（RNA完整性编号[RIN]，8.83±0.93[平均值±SD]；补充表3和4). 我们使用了Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST Array平台，该平台全面覆盖了人类基因组，拥有140万个探针集，用于分析整个转录物或单个外显子的表达，从而提供冗余，提高了基因级差异表达（DEX）估计值的可信度和差异外显子用法（DEU）。转录组数据生成步骤中实施的组织采样和质量控制措施的描述见补充信息2-5和补充图5-8.

全球转录组动力学

时空基因表达

在评估了质量控制指标后，我们进行了分位数归一化，并将代表17565个蛋白编码基因的核心和唯一探针集总结为基因级信息。采用严格标准（日志₂-至少一个样本和平均DABG中的变换信号强度≥6P（P）<0.01（至少一个区域和时期）定义一个“表达的”基因，我们发现在所调查的17565个基因中，15132（86.1%）在至少一个时期内至少在一个脑区表达，14375（81.8%）在至少1个NCX区域表达(图1a;补充信息6.1;补充图9). 为了研究不同因素对全球转录组动力学的贡献，我们应用多维标度（MDS）和主成分分析（PCA），发现区域和年龄（即时空动力学）比其他测试变量（性别、种族、，或诱导间变化(图1b;补充信息6.2和6.3;补充图10和11).

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图1

基因表达的全球时空动态

a、，文氏图表示考虑表达的基因总数以及大脑区域（顶部）和NCX区域（底部）的时空DEX基因数量。b条MDS图显示了转录相似性，用句点（顶部）和区域（底部）着色。对数的欧氏距离₂-转换信号强度（非度量，应力=18.9%）用于测量成对相似性。c（c），胎儿发育（第3-7期）、产后发育（第8-12期）和成年期（第13-15期）大脑区域（顶部）或NCX区域（底部）之间成对Spearman相关性的热图矩阵。

为了鉴定在空间或时间上受到调控的基因，我们采用了保守阈值（FDRq个-值<0.01且≥2倍对数₂-转换信号强度差异），包括PMI和RIN作为差异表达的ANOVA模型中的技术协变量，考虑了解剖变异的影响，并应用了5倍折刀操作(补充信息6.4;补充图12和13). 我们发现，在至少一个时期内，70.9%的表达基因在任何两个区域之间是空间DEX，24.1%的表达基因是任何两个NCX区域之间的空间DEX(图1a). 相反，90.0%的表达基因在跨区域的任何两个时期之间是暂时DEX，85.3%的表达基因是跨NCX区域的任何一个时期之间的暂时DEX。此外，70.0%和23.9%的表达基因分别在脑区和NCX区的空间和时间上是DEX。大部分时空调控发生在胎儿发育期间。例如，57.7%的NCX表达基因在胎儿发育过程中（3-7期）是暂时性DEX，而在出生后发育过程中为9.1%（8-12期），在成年期（13-15期）仅为0.7%。总之，这些数据表明，大多数脑表达的蛋白编码基因是受时间和空间调控的，这种调控主要发生在发育过程中。

转录组中的性别差异

性别偏见基因表达

先前的研究已经确定发育中和成年人脑中的性二型基因表达^12-14使用滑动窗口算法和t检验模型分析我们的数据集（FDR<0.01，对数差异大于2倍₂-变换信号强度；补充信息6.6)鉴定出159个基因，包括一些先前报道和新发现的基因，这些基因在Y（13）、X（9）和常染色体（137）上表达男性或女性畸形。大部分（76.7%）显示男性偏倚表达(图2a;补充表7). 观察到显著的空间差异，与出生后相比，在产前发育期间有更多的基因具有性别偏见的表达，成人大脑的特征是数量最少。

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图2

性别偏见基因表达

a、，胎儿发育（第3-7期）、产后发育（第8-12期）和成年期（第13-15期）大脑区域/NCX区域中的性别偏见DEX基因数量。b、， pcdh11年外显子阵列信号强度（左）和qRT-PCR验证（右）（N=5个男性大脑/周期）。c、， IGF2型NCX外显子阵列信号强度（左）和qRT-PCR（右）验证（N=4/性别和周期）。P（P）-数值通过非配对t检验计算。晶须表示5^第个和95^第个百分位数。

与之前的调查结果一致^13,14，我们发现最大的差异归因于Y染色体基因，尤其是PCDH11Y、RPS4Y1、USP9Y、DDX3Y、NLGN4Y、UTY、EIF1AY、和采埃孚（ZFY），它跨区域和时段显示常量表达式，但PCDH11Y型出生后CBC的下调(图2b). 有趣的是，X染色体上这些基因的功能同源物(PCDH11X、RPS4X、USP9X、DDX3X、NLGN4X、UTX、和EIF1AX公司)，除ZFX公司在胎儿发育期间，女性大脑中没有以代偿方式上调(补充图17).

我们还发现了其他具有性别偏见表达和独特时空模式的X连锁和常染色体基因，包括功能性非特征化转录物(位置554203，c3或f62，FLJ35409、和DKFZP586型),S100A10型（这与抑郁症有关²²)、和IGF2型（一种印迹常染色体基因，以前与大脑生长和认知功能有关^23,24)表现出人群水平的男性偏爱的发育表现(图2c).

性别偏见外显子使用

接下来，我们使用滑动窗口算法和剪接t检验模型（FDR<0.01，剪接指数>2；补充信息6.6). 我们鉴定了155个基因（145个常染色体），这些基因显示编码一个或一个子集外显子的探针集的性别偏见表达(补充表8)在一个或多个地区/NCX地区。这些包括胶原蛋白基因家族的几个成员(COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A2、和COL6A3系列),C3、KCNH2（一个与精神分裂症相关的基因²⁵),槽口3（一种常见的遗传性中风病基因突变²⁶),ELN公司（位于威廉姆斯综合征临界区的基因²⁷)、和荷兰GN4X（一种与突触功能有关的X染色体基因，与自闭症谱系障碍和中度X连锁智力残疾有关^11,28). 尽管在人口和基因水平上男性和女性的表达具有可比性(补充图17),荷兰GN4X在外显子7和外显子1、5和6的表达上表现出明显的男性畸形，在较小程度上表现为发育调控(图3). 总之，这些发现表明，男性和女性大脑在基因和外显子表达方面存在发育和空间调节差异。

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图3

性别偏见差异外显子用法

a、，基因结构和探针组组成荷兰GN4X用黄色和绿色箭头表示的是用于qRT-PCR验证的引物。b、，原木热图₂胎儿发育（第3-7期）、产后发育（第8-12期）和成年期（第13-15期）每个外显子的男性/女性信号强度比。强调了成人NCX外显子7（黄色框）和3′UTR（绿色框）的表达差异。请注意，外显子2和3A不符合我们的表达标准，因此没有被代表。c、，成人NCX外显子7和3′UTR表达的qRT-PCR验证（每种性别4个）。P（P）-数值通过非配对t检验计算。晶须表示5^第个和95^第个百分位数。

共调节转录网络

为了提取嵌入多维转录组数据集中的额外生物信息，我们进行了加权基因共表达网络分析²⁹鉴定共同调控基因的模块。我们确定了29个与不同时空表达模式和生物过程相关的模块(图4a;补充信息6.7;补充表9-11;补充图18-20). 在与特定时空模式相对应的模块中，M8由24个具有共同发展趋势的基因组成，在早期胎儿NCX和HIP（第3期）中表现出最高水平，然后随着年龄的增长逐渐下降，直至婴儿期（第9期）(图4b). 相反，M15包含310个基因，在NCX、HIP、AMY和STR中表现出相反方向的变化(图4c). 基因本体（GO）富集分析表明，M8基因富集于与神经元分化相关的GO类别（Bonferroni-adjustedP（P）=7.7×10^-3)和转录因子(P（P）=5.2×10^-3) (补充信息6.8;补充表9).

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图4

全球共表达网络和基因模块

一，第3至15期样本基因共表达网络分析的树状图。共表达基因的模块被分配颜色和编号（M1至M29）。b条，M8中的基因热图（左）显示了分层聚类后的时空表达模式。每个基因的表达值在热图中排列，首先按大脑区域排序，然后按年龄排序，最后按NCX区域排序。M8（中间）的时空模式由第一主成分（PC1）总结，用于跨年龄的模块中的基因表达。前50个M8基因（右），由最高的模块内连接性定义，前10个枢纽基因为红色。c、，对M15进行了相同的分析。其他模块的结果见补充信息.

模块内连接程度最高的基因称为中心基因，预计在模块内具有重要功能。M8 hub基因包括转录因子TBR1、FEZF2、FOXG1、SATB2、神经元6、和电磁X1(图4b)在功能上与NCX和HIP开发有关^4,30-38此外，福克斯G1变异与Rett综合征和智力残疾有关³⁴相反，M15 GO类别包括离子通道(P（P）=8.0×10^-8)和神经活性配体-受体相互作用(P（P）=4.0×10^-14). hub基因的序列变异(图4c)与严重抑郁症有关(GDA公司)³⁹精神分裂症和情感障碍(NRGN公司和RGS4系列)^7,40.

我们还发现了两个大规模的时间调控模块（M20和M2），它们具有跨区域共表达基因的相反发展轨迹，随着年龄的增长，其表达要么逐渐下降（M20），要么增加（M2）(补充图21和22). M20富含与锌指蛋白相关的GO类别(P（P）=7.3×10^-48)和转录因子(P（P）=4.8×10^-50)包括许多ZNF和SOX家族成员，而M2富含与膜蛋白相关的类别(P（P）=1.8×10^-21)以及与钙信号有关的基因(P（P）=8.1×10^-10)，突触传递(P（P）=1.6×10^-6)和神经活性配体-受体相互作用(P（P）=4.1×10^-4)反映了出生后大脑成熟的重要过程。它们的中枢基因编码转录因子、染色质状态调节剂和信号转导蛋白，所有这些都可能在网络的驱动中发挥重要作用。出生前M20和M2的表达朝相反方向急剧变化表明，这一时期与转录变化有关，可能反映了环境对大脑发育的影响以及细胞组成和功能过程的内在变化。

神经发育的表达轨迹

生成的数据集的一个重要应用是通过分析与特定神经生物学类别或疾病相关的单个基因或基因组的轨迹，深入了解正常和异常的人类神经发育。为了测试这一策略，我们比较了DCX公司（一种在神经元前体细胞和迁移的未成熟神经元中表达的基因），以及与树突相关的基因(MAP1A、MAPT、CAMK2A)和突触(SYP、SYPL1、SYPL2、SYN1)开发，使用独立生成的非转录人类数据集。这个DCX公司表达轨迹与出生后人类海马DCX免疫阳性细胞密度的变化非常相似(图5a)^36,40。在我们的转录组数据集中，DCX公司表达逐渐增加，直到胎儿中期发育早期（第5期），然后随着年龄的增长逐渐下降，直到儿童早期（第10期）。同样，树突和突触发育基因组的表达轨迹与DFC锥体神经元基底树突的生长密切相关⁴¹（斯皮尔曼相关，第页=0.810，第3层和第页=0.700（第5层）；图5b)和DFC突触发生⁴²(第页=0.946;图5c)分别是。这两个过程在胎儿中期晚期和婴儿期晚期之间急剧增加，表明这两个进程中有相当大一部分发生在出生前，并在婴儿期晚期达到稳定状态。

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图5

神经发育过程相关基因的轨迹

一，比较DCX公司人类齿状回HIP表达及DCX免疫阳性细胞密度³⁶.b条，DFC中基于转录组的树突发育轨迹与人类DFC中基于高尔基方法的第3层（L3）和第5层（L5）锥体神经元基底树突生长的比较⁴¹.c（c）、DFC中基于转录组的突触发育轨迹与电子显微镜计算的DFC突触密度的比较⁴²对于（b）和（c），根据年龄绘制基因表达PC1，以表示与树突或突触发育相关的基因的发育轨迹。对独立数据集进行居中、缩放，并在对数刻度上绘制。日期：，根据年龄绘制的给定基因组最大PC1值的PC1值百分比，代表NCX、HIP和CBC中几个神经发育过程的总体趋势和区域差异。

在证明了使用数据集描述人类神经发育的准确性和可行性之后，我们手动整理了与80多种类别相关的基因列表，包括各种神经发育过程、神经细胞类型和神经递质系统(补充信息6.9;补充表12). 在这些类别的脑区内和脑区之间观察到有趣的轨迹和它们的开始、倾斜和下降速度以及形状的显著差异，包括主要的神经发育过程（神经细胞增殖和迁移、树突和突触发育以及髓鞘形成；图5d)，皮层GABA能抑制中间神经元(CALB1、CALB2、NOS1、PVALB、和贵宾)和谷氨酸受体(补充图23和24). 正如所料，在神经发育轨迹中观察到两个主要趋势：细胞增殖基因表达的变化先于DCX公司在围生期发育过程中，两者均下降，而突触发育、树突发育和髓鞘化轨迹增加。有趣的是，突触发育的NCX表达轨迹(图5c，d)在儿童晚期或青春期，突触密度没有像之前报道的那样急剧下降⁴²。我们还确定了与类别高度相关的网络模块和其他基因(补充表13和14). 例如，M20和M2与神经元迁移密切相关(第页=0.894）和髓鞘形成(第页=0.972）。

此外，我们的数据集允许我们生成通常与ASD和精神分裂症相关的基因的表达轨迹。我们调查了一些以前与这些疾病相关的基因(补充信息6.10)观察到不同的动态表达模式，尤其是在NCX区域，包括CNTNAP2、MET、NLGN4X、和NRGN公司如所示补充图25为了深入了解自闭症和精神分裂症相关基因在人类神经发育中的潜在生物学功能，我们鉴定了时空表达谱显著相关的其他基因，并进行了GO富集分析(补充表15和16). 这些发现揭示了这些表达轨迹中相关的时空差异，并提供了额外的共表达基因，可以对其在各自过程或疾病中的作用进行研究。

数量性状基因座的表达

以前的报告已经证明了成人死后大脑（主要是大脑皮层）中基于SNP的遗传变异与表达数量性状位点（eQTL）之间的联系^43-47我们的多区域发育数据集使我们能够搜索SNP基因型和时空基因表达之间的关联。我们只测试了顺式-eQTL，将搜索限制在转录起始位点（TSS）或终止位点（TES）10 kb内的SNP，而不是反式-eQTL，这将需要更大的样本量。

实施保守策略（全基因Bonferroni校正，然后全基因组FDR<0.1；补充信息9)我们鉴定了39个NCX、8个HIP、4个AMY、2个STR、6个MD和5个CBC基因(补充表17)有证据表明顺式-eQTL，包括两个先前报道的基因(ITGB3BP公司和澳元27)^45,47与以往研究一致⁴⁸，相关SNP在TSS或TES附近富集(图6a).

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图6

SNP与基因表达的相关性

a、 b条基于几个Wald检验的相关基因TSS（a）和TES（b）周围的SNP分布P（P）-全基因Bonferroni校正后的值截断。c（c）,GLIPR1L2型与rs10785190基因型（位于外显子1的SNP）的表达相关。水平实线和虚线LOWESS曲线分别是基因和外显子1和2表达的发展趋势。d日，qRT-PCR验证每个基因型（N=14 GG，14 AG，8 AA）在NCX中的外显子1和2表达，绘制局部回归平滑曲线，以便于跨发育期进行比较。P（P）-通过非配对t检验计算值。晶须表示5^第个和95^第个百分位数。

NCX、MD和CBC中的一个重要关联示例是rs10785190和GLIPR1L2型，胶质瘤发病相关1基因家族成员⁴⁹在整个转录物和外显子1和2的水平上观察到了表达差异，我们观察到的唯一外显子在NCX中有可观的表达水平(图6b). NCX可能有更多顺式-eQTL比其他区域小，因为它的基因表达变异较小，这是由11个区域的平均表达引起的。许多在NCX中显著的eQTL在其他区域也有类似的关联，尽管在保守的全基因组校正后，它们在统计上并不显著(补充表17). 因此，我们已经确定了发育过程中不同区域转录的多态性调节因子，有可能为脑转录组的诱导间差异和遗传控制提供见解。

讨论

我们描述了转录组和相应的基因分型数据集的生成和分析，这些数据集涵盖了发育中和成人大脑的多个区域。此数据集（位于www.humanbraintranscriptome.org)以及相关研究⁵⁰提供了进一步研究的机会，并与健康和疾病状态的其他转录组相关数据集进行了比较。

我们的分析揭示了人脑转录组的几个重要方面，扩展了人类神经发育转录事件的现有知识。与其他物种的许多先前研究一致，我们发现基因表达和外显子的使用在时间和空间上具有复杂的动态调节模式，尽管存在潜在的基因组差异，但比性别、种族或个人之间的差异更为显著。

我们确认并扩展了之前在基因表达和外显子使用方面的性别二型性发现，包括一些疾病相关基因。这些发现为许多疾病的发病率、患病率和严重程度的性别差异提供了可能的转录机制。我们还演示了如何使用数据集来描绘与特定神经生物学类别或疾病相关的基因轨迹，其中许多可能在通常研究的模型系统的转录组中不明显。再加上对数据集中共表达基因的分析，这些数据提供了这些基因在大脑中何时何地表达的信息，这有助于推断其功能。我们的数据可以通过将重点缩小到发育过程中特定表达的候选基因或限制在已知优先受影响的特定区域来加强全基因组关联和连锁研究。

我们显示了特定SNP和发育中人脑不同区域的表达水平之间的关联，表明遗传变异有助于跨区域和发育的诱导间转录组变异。虽然我们数据集中当前的样本数量限制了我们检测许多可能的eQTL的能力，但我们已经确定了一组顺式-eQTL，包括许多以前未报道过的eQTLs，可能为研究大脑中的表达调控元件提供见解。

尽管这些发现突显了人脑中基因表达和外显子使用的复杂性，但我们的数据中有几个潜在的局限性值得讨论。最重要的是，我们使用严格的标准，以忠实地描述一般转录模式并最小化假阳性，而不是捕获可能发生的所有变化。此外，我们分析了含有多种细胞类型的解剖组织样本，从而稀释了以更具细胞类型特异性的方式表达的基因的遗传贡献和动态范围。目前的局限性使我们无法使用细胞类型特异性方法系统分析时空转录组。此外，迄今为止所分析的大脑和区域的数量不足以全面研究转录变化的整体幅度或eQTL的全范围。测序技术的应用将允许对转录组进行更深入的分析，发现新的低表达转录物及其相关时空模式。最后，虽然特定的表达模式通常与同样特殊的生物过程有关，但重要的是要记住，mRNA和蛋白质水平之间的关系并不总是线性的，也不一定转化为明显的表型差异。随着这些担忧在未来通过向我们的数据集添加样本以及在整个发展过程中从人类和非人类大脑生成新的数据集而得到解决，将有可能进一步揭示人类大脑发展和进化的转录基础。

方法总结

这个补充信息3-9提供了组织采集和处理、数据生成、验证和分析的完整描述。

补充材料

致谢

脚注

工具书类