美国国家科学院院刊。2013年1月2日；110(1): 348–353.
激活5-HT2A受体上调神经元K-Cl协同转运蛋白KCC2的功能
Timone神经科学研究所，UnitéMixte de Recherche 7289，法国马赛Aix-Marseille Universityé，F-13385 cx5
由瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡学院Sten Grillner编辑，2012年11月15日批准（2012年8月8日收到审查）
作者贡献：R.B.和L.V.设计的研究；R.B.、K.S.、P.B.、D.B.、S.L.、C.B.、G.H.、H.B.和L.V.进行研究；G.H.提供了新的试剂/分析工具；R.B.、K.S.、P.B.、D.B.、S.L.、C.B.、H.B.和L.V.分析数据；R.B.和L.V.写了这篇论文。
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摘要
在健康成年人中，γ-氨基丁酸（GABA）的激活一甘氨酸受体抑制神经元是由于细胞内氯离子浓度低（[Cl–]我)由氯化钾共同转运器KCC2维持。KCC2表达或功能的降低与一些神经疾病的发病机制有关，包括脊髓损伤后的痉挛和慢性疼痛。鉴于KCC2在调节抑制强度和鲁棒性方面的关键作用，确定可能增加KCC2功能的工具，从而在病理条件下恢复内源性抑制尤为重要。我们发现，5-羟色胺（5-HT）2A型受体对血清素的激活可使抑制性突触后电位（IPSP）、EIPSP公司在大鼠脊髓运动神经元中，增加KCC2的细胞膜表达，恢复内源性抑制并减少脊髓损伤后的痉挛。靶向5-HT上调KCC2功能2安培因此，受体在治疗涉及氯化物稳态改变的神经系统疾病方面具有治疗潜力。然而，这些受体与一些精神疾病有关，它们对疼痛处理的影响存在争议，这突出表明需要进一步研究特定5-HT的潜在系统影响2安培R激动剂，例如（4-溴-3,6-二甲氧基苯并环丁烯-1-基）氢溴酸甲胺（TCB-2）。
神经元特异性K+-氯离子–共转运蛋白KCC2（由溶质载体家族12成员5编码，Slc12a5系列)挤出Cl–并负责低[Cl–]我在成熟神经元中(1–三)GABA介导的超极化抑制的先决条件一受体（GABA一Rs）和甘氨酸受体（GlyRs）。KCC2在几种神经系统疾病中的表达或功能降低(2,4)以及由此产生的[Cl的轻微增加–]我（氯化物平衡电位的去极化位移，E氯)极大地削弱了对放电率和兴奋性输入的抑制控制(5–7). 鉴于KCC2在调节抑制性突触传递强度方面的作用，确定可能增加KCC2功能的工具，从而在病理条件下恢复内源性抑制具有特别重要的意义。
痉挛是一种影响脊髓损伤（SCI）患者的致残性并发症，其特征是由于过度兴奋性伸展反射、痉挛和对正常无害的感觉刺激过敏而导致肌肉张力的速度依赖性增加(8,9). 大鼠脊髓损伤后KCC2的下调与痉挛的发生有关(10)和慢性疼痛(11,12). 值得注意的是，运动神经元膜中KCC2的表达减少，同时细胞质簇的密度更高，这表明在这些病理条件下，转运体的表面稳定性降低(10).
越来越多的证据表明，细胞内C末端结构域中KCC2的磷酸化动态调节其活性和表面表达(1). 特别是，蛋白激酶（PK）C的磷酸化增强KCC2活性并减少内吞作用(13). 有趣的是，5-羟色胺2型受体（5-HT）的激活2Rs）对血清素刺激PKC并加强运动期间观察到的运动爆发的左右交替(14–16)依赖于相互抑制(17,18). 我们假设5-HT2R活性调节KCC2功能和/或表达。我们的结果表明，5-HT的激活2安培R亚型超极化EIPSP公司通过PKC依赖机制，增加运动神经元质膜中KCC2的表达，并减少SCI诱导的痉挛。
结果
E的负位移IPSP公司和KCC2上调。
我们首先检查了5-HT的作用2A/2B/2C型R激动剂（±）-2,5-二甲氧基-4-碘安非他明盐酸盐（DOI）（10µM；表S1)在E上国际公共服务提供商对照新生大鼠[出生后第5-P7]天。DOI-超极化EIPSP公司10-20分钟内(). 这种效果是持久的（至少2小时；). E类IPSP公司与对照组相比，在DOI存在下记录运动神经元时，其超极化显著增加（8 mV；,左侧). 静息膜电位有去极化的伴随趋势（V休息)DOI（+2 mV；P（P）> 0.05). 因此，在V休息显著增加(,赖特).
激活5-HT2Rs超极化EIPSP公司增加KCC2的膜表达。(一)在添加DOI（10µM）前后，P6完整大鼠运动神经元中不同保持电位下刺激脊髓腹侧索（箭头）诱发的IPSPs。(B类)E变化的时间过程IPSP公司和V休息. (C类)E类IPSP公司和驱动力（EIPSP公司-V（V）休息)在控制条件下测量(n个=21）和添加DOI后(n个= 8). ***P（P）<0.001（Mann–Whitney检验）。在DOI前后测试了6个运动神经元*P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）。在酮糖醇（10µM；n个= 4) (居中). (D类)DOI（1–1.5µM）对E的影响IPSP公司在新生儿脊髓损伤后4-6天记录到运动神经元的驱动力（在无DOI和有DOI的情况下分别记录到17和6个细胞）**P（P）< 0.01, *P（P）<0.05（Mann-Whitney检验）*P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）。(E类)E类国际公共服务提供商DOI慢性治疗后明显超极化(n个=9）与SCI动物相比(n个=22）但与对照动物无差异(n个= 21). ns，不显著(P（P）> 0.05); ***P（P）<0.001（单向方差分析，Tukey后验）。(F类,上部)用KCC2特异性抗体标记的腰椎脊髓膜和细胞质部分的蛋白质印迹。130-140-kDa和>200-kDa带分别对应于单体和低聚物蛋白质(53). (F类,下部)新生SCI后DOI治疗大鼠KCC2表达的定量（未治疗大鼠的百分比）*P（P）<0.05（Mann-Whitney检验；n个=每组6人）。(G公司)在FB标记的踝伸肌运动神经元上双重标记GlyRα1和KCC2，在三种情况下（P7）：完整、新生儿SCI和慢性DOI治疗。（比例尺：10µm）(H（H）)完整大鼠膜KCC2标记密度的量化（标记像素表面与体周的比值）(n个=34个运动神经元）且未经治疗(n个=41）或DOI处理(n个=44）新生SCI大鼠（每组3只）***P（P）<0.001（Kruskal–Wallis检验，Dunn的后验）。(我)腰椎脊髓腹侧部分显示KCC2-免疫阳性树突延伸至白质。（比例尺：100µm）(J型)完整大鼠白质KCC2标记的定量研究(n个=34）和未经处理(n个=41）或DOI处理(n个=44）新生SCI大鼠***P（P）<0.001（Kruskal–Wallis检验，Dunn的后验）。
接下来的一系列实验是在患有新生儿脊髓损伤的动物身上进行的。E类IPSP公司如前所示，与同龄对照组相比，在P5–P7测试的动物中去极化程度明显更高(19)（比较). 因为这些动物的神经元对5-HT的敏感性增加(15)DOI的测试浓度（1–1.5µM）低于对照组。DOI诱导E的～8-mV超极化IPSP公司(,左侧). 因此，EIPSP公司从高于V切换到低于V休息(,赖特). 另一组动物在P4至P6–P7期间接受DOI慢性治疗[0.15 mg/kg，腹腔注射(15,20)每天两次]。E类IPSP公司DOI治疗组动物的超极化程度高于未治疗的横断动物(). 数值与对照动物的测量值相似。
我们对腰骶部脊髓的蛋白质进行亚细胞分离，然后用一种针对KCC2的特异性抗体进行免疫印迹。与NaCl处理的幼鼠相比，慢性DOI处理后，膜组分（KCC2Mb）中KCC2的数量显著增加(). 细胞溶质部分KCC2含量有增加的趋势。因此，KCC2Mb/KCC2细胞质的比率没有显著增加。然后通过免疫组织化学分析KCC2的表达。所有分析都是在逆行标记的腰椎运动神经元[腓肠三头肌（TS）肌肉（踝伸肌）；]. GlyRs与锚定蛋白凝胶蛋白共定位，因此可用于标记质膜；此外，他们不受新生儿脊髓横断的影响(20). 因此，我们对该受体的α1亚单位进行免疫标记，以可视化对照组（完整）、未治疗组（SCI）和DOI治疗的脐带转基因动物（SCI+DOI；,插图). SCI后，体细胞膜KCC2染色强度降低(). DOI处理增加了KCC2染色，因此与同龄对照组相比没有观察到差异。我们还量化了从灰质延伸到侧索和腹索的运动神经元树突水平的KCC2染色(). 与体细胞膜观察到的情况类似，DOI处理使染色强度恢复到对照组的值(). 总之，这些结果表明5-HT的激活2R能够恢复氯化物的稳态（E的超极化位移IPSP公司)新生儿SCI后。KCC2在质膜中的表达增加，至少部分地提供了这种恢复的分子基础。
5-HT的贡献2安培卢比。
DOI对E的影响IPSP公司在5-HT存在的情况下被阻止2R拮抗剂酮肝素（10µM；n个= 4;,居中). 因为DOI和酮菊酯也与5-HT结合2B型Rs和5-HT2厘米卢比(表S1)，以进一步确定5-HT的亚型2我们使用（4-溴-3,6-二甲氧基苯并环丁烯-1-基）甲基胺氢溴酸盐（TCB-2），一种高亲和力的5-HT2安培R激动剂(21,22) (表S1). 低浓度（0.1µM；n个=6）超极化E国际公共服务提供商在对照组大鼠中为～4 mV(，灰色）。注意，即使是高度负值（-78 mV），在TCB-2的存在下也会进一步超极化。在较高浓度（10µM；n个= 4;，黑色）。TCB-2对V无影响休息以及研究的其他电气特性(图S1). 因此，驱动力（EIPSP公司-V（V）休息)显著增加(; −5.3毫伏）。接下来，我们在新生儿脊髓损伤动物的运动神经元上测试了这种化合物。TCB-2（0.1µM）诱导的超极化偏移（−4.2 mV）与对照动物中的类似(). 平均而言，EIPSP公司从高于V切换到低于V休息(;P（P）< 0.05; Wilcoxon配对试验）。
5-HT的参与2安培Rs通过PKC依赖的信号通路。(一)TCB-2（0.1µM；30分钟）诱导E的超极化偏移IPSP公司对V无伴随影响休息（第6页）。(B类,左侧)TCB-2（0.1μM，灰色；10μM，黑色）对从对照大鼠（P5–P6）记录的10个运动神经元的影响***P（P）<0.001（Mann-Whitney检验；n个=12和n个TCB-2前和TCB-2下分别为14）**P（P）<0.01（Wilcoxon配对检验）。仅考虑最低浓度[0.1µM；n个= 6; *P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）]。(B类,赖特)TCB-2（0.1–10µM）对驱动力的影响（控制，n个= 12; TCB-2，n个= 14). *P（P）<0.05（Mann-Whitney检验）**P（P）<0.01（Wilcoxon配对检验）。(C类)TCB-2（0.1µM）对E的影响IPSP公司以及出生时脊髓损伤动物运动神经元的驱动力（TCB-2缺乏时为6个，TCB-2存在时为9个）***P（P）< 0.001, *P（P）<0.05（Mann-Whitney检验）*P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）(n个= 6). (D类)E类IPSP公司通过应用KCC2阻断剂VU0240551（25µM）显著去极化，这阻止了TCB-2（0.1µM；n个= 11). 平均值取自控制情况下的3个运动神经元、VU0240551下的9个运动神经元和VU0240 551和TCB-2同时存在时的11个运动神经元。纳秒，P（P）> 0.05; **P（P）<0.01（Mann–Whitney试验）。(E类)TCB-2（0.1µM；30 min）显著增加培养中Hb9:：eGFP转基因运动神经元质膜上KCC2的表达（14 DIV）。(E类,左侧和居中)合并图像(插图)在表达GFP的胞浆外围显示KCC2免疫标记。(E类,赖特)质膜和胞质溶胶之间KCC2表达的比率***P（P）< 0.001 (t吨测试；n个=每种条件下分析的两个实验中的34个细胞）。(F类)PKC抑制剂白屈菜红碱的预培养（20µM；30 min；n个=6）防止了DOI的影响（10µM；n个= 3; 灰色）或TCB-2（0.1µM；n个= 3). PDBu显著超极化EIPSP公司.ns，P（P）> 0.05; *P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）。加利福尼亚州2+-依赖性PKC抑制剂Gö6976（2µM；n个=8）诱导E轻微但显著的超极化IPSP公司在添加TCB-2（0.1µM；n个= 16). **P（P）<0.001（Mann-Whitney检验）*P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）。钙的活化剂2+-独立PKCɛ（FR236924；2–8µM；n个=7）超极化EIPSP。*P（P）<0.05（Wilcoxon配对检验）。
5-HT的使用2安培拮抗剂（1µM下的酮肝素和2µM上的MDL11939）和5-HT2B/2C型激动剂和拮抗剂证实了5-HT的参与2安培E负位移中的RIPSP公司并建议5-HT2B/2C型可能有相反的效果(图S2). 为了确定这些作用的潜在机制，我们使用了VU0240551（25µM），一种高度特异性的KCC2阻断剂(23). 这种化合物使E去极化IPSP公司大于10毫伏(). KCC2阻断阻断TCB-2的作用(,赖特)，符合KCC2对E的要求IPSP公司5-HT激活引起的移位2安培R.TCB-2对IPSPs的动力学没有影响(图S3)这表明它主要通过调节KCC2功能来调节抑制强度。
我们用免疫标记法定量TCB-2对Hb9:：eGFP转基因小鼠分离的培养运动神经元质膜KCC2表达的影响(,左侧). 5-HT激活后2安培TCB-2（0.1µM；30 min）的R，eGFP荧光显示质膜和细胞液之间KCC2表达的比率(,插图)，大幅增加(,赖特).
涉及PKC-依赖路径。
接下来我们研究了TCB-2/DOI激活的第二信使通路。5-羟色胺2安培Rs刺激磷脂酶C，导致PKC活化。与PKC的参与一致，TCB-2的作用(，黑色）和DOI(（灰色）通过预培养PKC抑制剂白屈菜红碱（20µM）来阻止。此外，用佛波醇12,13-二丁酸酯（PDBu）（1µM）激活PKC可诱导E的～9-mV负位移IPSP公司()，平均从高于（5.5±3.7 mV）切换到低于（−3.3±2.1 mV）V休息.PKC根据其第二信使需求分为子家族。吲哚咔唑Gö6976能够区分钙2+-PKC的依赖和非依赖亚型。该化合物的纳米摩尔浓度抑制钙2+-依赖性同工酶，而即使是微摩尔浓度也对Ca没有影响2+-独立PKC亚型(24). Gö6976（2µM）诱导了E的小（～1.5 mV）但显著的超极化IPSP公司(). 重要的是，添加TCB-2后观察到进一步的～4-mV负偏移(). 钙的强效选择性激活剂2+-独立PKCɛ，FR236924诱导E的～2-mV负位移IPSP公司(). 总之，这些结果表明5-HT的激活2安培R通过Ca增加KCC2功能，至少部分增加2+-独立的PKC。
激活5-HT2安培R增加抑制强度。
体外刺激腰椎背根顶上可引起同侧腹根的反应(). 代表运动神经元单突触兴奋的最早成分(25,26)不受TCB-2的影响（0.1–0.15µM；). 重复刺激背根时，单突触反应的振幅降低()，随着刺激频率的增加，这种效应变得更强[速率依赖性抑郁（RDD）]；]. 因为KCC2在抑制反应中起着关键作用(图S4)，我们假设超极化EIPSP公司TCB-2将影响RDD。正如预期的那样，TCB-2降低了重复刺激引起的单突触反应的振幅(、蓝色轨迹和，虚线）。因此，RDD显著增加(). VU0240551阻止了这种影响(图S5).
TCB-2对体外完整脊髓背根刺激后腹根反应的影响。(一)在P6离体大鼠脊髓中，通过对同侧同名背根的超最大刺激在L5腹根诱发的反应。最早的成分代表运动神经元的单突触反应。当反复刺激背根时，这种反应的振幅降低（1 Hz时对第15次脉冲的反应以蓝色显示，与第一次脉冲的控制反应重叠）。潜伏期的轻微增加可归因于运动神经元随着脉冲数的增加而延迟放电。添加TCB-2（0.1–0.15µM）后，对第15次脉冲的响应幅度要小得多。(B类)添加TCB-2前每30 s和添加后20–30 min传递的单突触反应的相对振幅【TCB-2之前的对照百分比；P（P）>0.05（Wilcoxon配对检验）；n个= 12]. (C类)在添加TCB-2（虚线）之前和之后，在不同频率（0.1 Hz，黑色；1 Hz，红色；5 Hz，蓝色）下对15次连续刺激的单突触反应的相对振幅。这是与中相同的实验一. (D类)7只动物在P5–P6的不同刺激频率下，在[人工脑脊液（aCSF）中的对照组]和TCB-2应用后（0.1–0.15μM）的单突触反射的平均相对振幅（±SEM）。对每只动物的十二个值（前三个丢弃的值）进行平均。TCB-2显著增加RDD***P（P）<0.001（单相指数衰减回归）。注意，对于每个刺激频率，除0.1 Hz外，TCB-2治疗前后的差异显著[P（P）<0.05（Wilcoxon配对试验）]。(E类)加入TCB-2（0.15µM）前后刺激同侧同名背根（DR）诱发的腹根（VR）平均包络破裂*P（P）<0.05（Wilcoxon配对检验；n个= 7).
接下来，我们考虑了运动神经元中兴奋和抑制的混合引起的多突触反应(27,28). VU0240551在15-20分钟内增强了多突触反应，这是抑制强度降低的结果(图S6). 这种影响是可逆的。TCB-2在15-20分钟内减少了多突触反应，且这种作用持续至少1小时()之前应用苦毒毒素和士的宁（用于阻断GABA）可以阻断这种作用一Rs和GlyRs）或VU0240551(图S6). 因此，TCB-2可能通过调节氯离子稳态来增强体外完整脊髓中突触后抑制的强度。此外，TCB-2的这种抑制增强使新生儿脊髓损伤后紊乱的交替运动模式得以恢复(15) (图S7).
脊髓损伤后痉挛的减少。
H（或Hoffmann）反射通常用于评估痉挛患者单突触反射回路的兴奋性。H波()由于Ia型传入神经对运动神经元的单突触激活，当使用高于0.1 Hz的刺激频率时，会发生RDD(29) (). 减少RDD是SCI后痉挛的可靠相关性(10,29,30). KCC2账户的下调，至少在一定程度上是为了减少(10). 我们研究了TCB-2（0.3 mg/kg，i.p.）对截瘫痉挛成年大鼠（脊髓损伤后14-21天）RDD的影响。静脉注射溶媒（NaCl；). 注射TCB-2不会影响阈值、最大振幅或刺激强度，在这些条件下，M波和H波在0.1 Hz时都能获得最大振幅(表S2). 然而，当使用高于0.5 Hz的刺激频率时，效果明显(). 事实上，H波的振幅比注射前小，在注射TCB-2后7–25分钟达到最大且非常显著的效果().
激活5-HT2安培Rs增加H反射的RDD。(一)H（H）最大值成年大鼠脊髓损伤后诱发的反应(左侧)静脉注射TCB-2（0.3 mg/kg）后7分钟(赖特). 每条记录道是在0.1、0.5、1、2或5 Hz下对17次连续刺激（前三次被丢弃）的平均响应。(B类)静脉注射溶媒（NaCl；n个=6只大鼠）或TCB-2(n个= 4). (C类)注入车辆之前（黑色）和之后（蓝色，7分钟；红色，22分钟）H反射的平均相对振幅(左侧)或TCB-2(赖特). 所有实验的数据都被表示出来（为了清晰起见，在每个刺激频率上稍微偏移的点），以及这些数据的单相指数衰减拟合***P（P）<0.001，比较TCB-2前后的配合（7分钟或22分钟）。车辆前后的配合没有显著差异。
讨论
这项研究表明，神经递质受体的激活通过上调KCC2功能，在病理条件下恢复内源性抑制。激活5-HT2安培TCB-2体外R导致E超极化偏移IPSP公司并且在几分钟内KCC2的细胞表面表达增加。阻断KCC2阻断了这种转变，表明TCB-2的作用可能是由KCC2的翻译后修饰介导的，而不是基因转录或蛋白质合成的变化。5-HT的慢性激活2安培R还诱导了E的超极化位移IPSP公司同时KCC2表达增加。正如细胞质KCC2增加的趋势所表明的那样，在这种情况下可能会发生基因转录或蛋白质合成的变化。
此前有报道称，5-羟色胺（5-HT）在斑马鱼的脊髓中调节氯化物的体内平衡(31)]以及其他几个系统（例如，参考文献。32和33). 这里，我们显示了5-HT的作用2安培R对氯化物稳态的激活严重依赖于PKC。与这些发现一致，许多蛋白激酶的活性，包括PKC和磷酸酶，已被报道影响KCC2功能。进一步证明KCC2通过PKC活性直接磷酸化，并且该蛋白C末端胞内结构域内磷酸化的主要位点是丝氨酸940（Ser940）。Ser940依赖PKC的磷酸化通过减少质膜内吞作用增加KCC2细胞表面的稳定性和活性(13). 在HEK-293细胞中，KCC2的整个细胞表面群体在10分钟的时间过程中被内化，这一过程因PKC的激活而显著减慢(13). 同样，在培养的海马神经元中，PKC激活增加了KCC2的细胞表面表达。
激活5-HT2安培R仍然诱导E的超极化位移IPSP公司阻断Ca后2+-Gö6976的依赖性PKC。此外，该化合物诱导了E的小超极化位移IPSP公司这些结果表明钙的相反作用2+-依赖性和钙2+-独立于KCC2功能的xPKC。为了支持这一假设，重复的突触后刺激诱导E的正位移氯通过Ca2+-KCC2依赖性下调(34-36). 钙的抑制2+-依赖性PKC消除E的峰值诱导位移氯(34). 与细胞内钙的负面影响一致2+在KCC2功能上，NMDA受体激活导致钙2+最终导致蛋白磷酸酶1介导的KCC2残基Ser940去磷酸化和E去极化移位的内流氯(37).
我们展示了阻断5-HT2B型Rs和5-HT2厘米Rs超极化EIPSP公司相反，激活这些受体会导致E的去极化位移IPSP公司虽然我们没有确定这些作用是由这些受体中的一个还是两个介导的，但这些结果表明5-HT2安培Rs和5-HT2B/2C型Rs对KCC2功能有相反的影响。尽管5-HT的药理特征2安培Rs和5-HT2厘米Rs非常相似，部分原因是它们之间的氨基酸序列同源性很高(38)，据报道，这些受体调节的信号级联之间存在显著差异(39,40). 与这些观察结果一致，5-HT2安培Rs和5-HT2厘米Rs对小鼠的两种运动活动都有相反的影响(41)和大鼠脊髓反射的长期放大(42). 有趣的是，5-HT2B型Rs和5-HT2厘米SCI后，Rs开始构成性激活（无5-HT的自发激活）(43,44). 这种本构活动可能是E去极化位移的部分原因氯SCI后(10). 5-HT的调节作用2B/2C型氯稳态的反应需要进一步研究。
5-HT的激活2安培如H反射的RDD增加所示，R减少了SCI后的痉挛。这种效应很可能是由于内源性抑制的恢复，因为E氯被证明对抑制强度有重要影响(5–7,10). 5-羟色胺2安培Rs在腹角强烈表达(45)主要定位于神经元的质膜，覆盖细胞体和树突的大表面(46). 脊髓损伤后，这些受体在运动神经元体细胞和树突中显著上调(47)，这种影响最早在横切后1天开始(48). 5-HT2安培R显示出比5-HT低10倍的本构活性2厘米R（右）(38).
在完整的脊髓中，下行通路释放的神经调节剂使运动神经元表现出持续的去极化（平台电位），这归因于缓慢激活电压依赖性持续内向电流（PIC）。受伤后不久，脊髓的兴奋性降低，因为脑干对运动神经元的这种兴奋性影响消失了。然而，运动神经元慢慢恢复产生PIC的能力，PIC在很大程度上是导致长时间反射和痉挛的原因(49,50). 两种5-HT2B型Rs和5-HT2厘米Rs，但不是5-HT2安培Rs参与了PIC的上调(44). 总之，通过上调KCC2功能恢复内源性抑制，而不去极化运动神经元和激活PIC，5-HT的激活2安培Rs可能代表一种创新的治疗策略，以减少SCI后的痉挛。然而，这些受体与一些精神疾病有关（例如。，51)，其对疼痛处理的影响存在争议(52)，强调需要进一步研究特定5-HT的潜在全身影响2安培R激动剂，如TCB-2。
材料和方法
体外电生理记录。
在低温麻醉后，我们解剖了新生大鼠的脊髓（骶段至T8–T9）和L3–L5背根和腹根。在连续灌注含氧人工脑脊液的情况下进行解剖和电生理检查。
体内电生理记录。
我们在氯胺酮麻醉（100 mg/kg，i.p.）下，使用一对不锈钢针电极经皮插入胫神经附近进行刺激，测量成年大鼠的H反射。我们将记录电极放入踝关节下方的趾屈肌，并将参比电极插入足部。
西部印记。
如前所述，通过Western blots测定脊髓腰膨大中KCC2的含量(10). 分离膜和细胞质组分的程序详见SI材料和方法.
免疫组织化学。
将固蓝（FB）[3µL；0.5%溶于0.9%NaCl；F-5756（Sigma）]在P5麻醉的TS肌肉（踝伸肌）中双侧注射，以进行逆行识别。2天后，动物被杀死。固定后，横切脊髓（20µm厚的切片）。用亲和纯化的兔KCC2-特异性多克隆抗体和GlyR单克隆抗体的混合物进行免疫组织化学。然后，我们用驴Cy3-偶联兔特异性抗体和驴AlexaFluor 488偶联鼠特异性抗体的混合物进行标记。
运动神经元培养和免疫细胞化学。
分离培养运动神经元。在体外13–14天（DIV），新鲜制备TCB-2，在完整培养基（0.1µM）中稀释，并添加30分钟。
更多实验细节见SI材料和方法.
致谢
我们感谢Mouloud Bouhadfane在整个实验过程中进行的有益讨论，感谢Florian Gackière和Frédéric Brocard对手稿的评论。这项工作得到了克里斯托弗·里夫和达纳·里夫基金会赠款VB1-0502-2和VB2-0801-2、国际脊柱研究信托赠款STR110、法国国家税务局赠款ANR-2010-BLAN-1407-01和法国莫埃莱皮涅尔研究所（l.V.）的支持。P.B.、G.H.和H.B.得到了国立圣特医学研究所的支持，K.S.得到了法国防治近视协会13912拨款的支持。
工具书类
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