美国化学学会杂志。作者手稿；PMC 2013年5月23日提供。
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顺磁性Cu（II）探测膜蛋白结构和功能：流感M2质子通道的抑制机制
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摘要
顺磁性Cu（II）离子以距离依赖的方式增强核自旋弛豫，可以用作蛋白质的结构探针。Cu（II）也可以作为蛋白质中的重要功能配体。在这里，我们研究了Cu（II）通过Cu（II）诱导的顺磁弛豫增强（PRE）抑制流感M2质子通道的结构基础。13C T公司1Cu（II）显著提高M2跨膜（TM）结构域中心残基的弛豫速率，并观察到质子选择性残基His37的显著光谱展宽。这些数据得出的定量距离为13C旋转到Cu（II）中心，并确定Cu（Ⅱ）结合位点为His37的Nε2。该结合位点由Trp41顶部的四个咪唑环和底部的四个吲哚环包围，从而解释了Cu（II）结合的高亲和力。Cu（II）在这个位置结合，可以通过干扰组氨酸-水质子交换、阻止组氨酸构象动力学以及干扰His-Trp阳离子-π相互作用来抑制质子流。Cu（II）结合位点与疏水性药物金刚烷胺的结合位点不同，该结合位点约为His37的10μN末端。一致地，Cu（II）和金刚烷胺在几个关键残基上诱导不同的构象变化，这表明有可能设计靶向His37位点的新药来抑制金刚烷胺抗性突变M2蛋白。除了高亲和力的His37结合位点外，我们还检测了Cu（II）与膜表面脂质磷酸盐的较弱和非特异性结合，以及由此产生的PRE与表面近端蛋白残基的程度。这项研究证明了顺磁性离子络合膜蛋白核磁共振研究的可行性，其中离子既是功能配体又是距离探针。
介绍
用魔角自旋（MAS）固体核磁共振测定膜蛋白的结构不仅需要局部结构约束，如扭转角和短程距离1–三，但也需要长距离（5°以上）来限制蛋白质的三维折叠。这些长距离比短距离更难测量，因为核间偶极耦合对于13C和15N核与测量的复杂性1H（H）-1有机固体中的H偶极耦合。在13C和15N 2D相关光谱，距离超过5º的交叉峰需要较长的混合时间才能观察到4因此受到核自旋弛豫的限制。即使存在长程交叉峰，它们也通常由氨基酸残基中来自细胞核的高强度交叉峰控制5.尽管测量技术1H距离13C或15N个6和19F类-19F距离7,8已经开发用于增加NMR的距离上限，这些技术需要位点特异性标记，因此不容易同时产生许多距离。
顺磁弛豫增强（PRE）是测量远距离的有效方法。顺磁性金属离子中的未配对电子增强了纵向（T1)和横向（T2)根据电子-核距离的反六次幂弛豫核自旋9。由于PRE的标度是电子旋磁比，比核自旋的旋磁比大两到三个数量级，因此可以使用此效应测量高达20º的距离10对于具有大量未成对电子和长（纳秒到微秒）电子自旋弛豫时间的顺磁离子，横向PRE占主导地位，它拓宽了NMR谱中的线型并猝灭了信号。相比之下，具有少量未成对电子和较短电子自旋弛豫时间的顺磁离子会导致较小的横向PRE，这使得可以在未加厚的光谱中检测到纵向PRE，从而量化电子-核距离。除PRE外，顺磁性离子还会引起与距离相关的偶极超精细位移，也称为伪接触位移（PCS）11,12这种效应在小分子中得到了利用13,14以及金属蛋白15,16在快速MAS下。
铜（II）是一种特别适合于用PRE测定结构的顺磁离子，因为它具有相对较短的电子自旋弛豫时间和较小的克-张量各向异性，从而分别导致适度的线加宽和较小的各向同性PCS。结果，Cu（II）诱导T1和T2PRE可以很容易地测量，并已用于确定微晶蛋白质的全球折叠10,17淀粉样纤维中的Cu（II）结合位点18.
对于膜结合蛋白，顺磁离子目前主要用于测量金属离子结合的膜表面蛋白质残基的深度1为此，使用了诸如Gd（III）、Dy（III）和Pr（III）之类的镧系元素和诸如Mn（II）之类的非镧系化合物，以及伪接触位移19和T2之前20–22观察到。此外，Cu相关脂质被用于提高膜蛋白NMR的灵敏度23,24然而，Cu（II）尚未用于研究膜蛋白的结构，无论是通过其与膜表面的非特异性结合还是通过与蛋白质侧链的位点特异性结合。与球状和纤维蛋白相比，水合脂质膜对Cu（II）PRE表现出额外的复杂性，因为Cu（II）除了特定的蛋白质位点外，还可以结合水中的脂质磷酸盐、缓冲离子和氢氧根离子。因此，使用Cu（II）PRE测定膜蛋白的距离需要仔细考虑多重结合平衡。
流感M2蛋白在病毒包膜中形成四聚体质子通道，酸化病毒离子以启动病毒脱外壳25–28质子选择性是通过跨膜（TM）域中的一个组氨酸实现的，组氨酸为His3729而通道选通是由Trp41完成的30距His37有一个螺旋形转弯。该通道被金刚烷类抗病毒药物抑制31,32和Cu（II）33全细胞电生理实验表明，Cu（II）抑制是双相的：TM电场外存在一个低亲和力结合位点，其平衡解离常数（KD类)约100μM，而与K的高亲和力结合位点D类TM电场中存在约2μM。高亲性Cu（II）结合对pH值和外加电压敏感，Cu（Ⅱ）抑制内向和外向电流。之前使用疏水性药物BL-1743阻止了Cu（II）抑制，表明存在竞争性结合33这些生化数据表明His37是高亲和力Cu（II）结合位点；然而，还没有报道任何结构数据来确定Cu（II）的确切位置。与疏水性药物的抑制机制相比，对Cu（II）与M2TM结合的原子级结构研究将有助于理解Cu（Ⅱ）的抑制机制。
在本研究中，我们使用13C预处理。我们表明，在适当的pH值和溶液条件下，可以实现与M2TM的高亲和力Cu（II）结合，其中竞争结合平衡被最小化。基于谱线展宽，13C T公司1PRE和由此产生的距离，我们确定了高亲和力结合位点，并提出了电生理实验中检测到的低亲和力位点。我们的结果表明，Cu（II）的抑制机制与金刚烷胺的抑制机制不同，并证明Cu（Ⅱ）PRE是一种有用的、通用的膜蛋白结构和功能探针。
材料和方法
膜样品制备
所有脂质，包括1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1-棕榈酰基-2-油酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺（POPE）、卵磷脂（SM）和胆固醇（Chol），均来自Avanti Polar lipids（Alabaster，AL）。PrimmBiotech（马萨诸塞州剑桥）使用Fmoc化学合成了甲型流感病毒Udorn株M2蛋白的跨膜结构域（残基22–46），并纯化至>95%纯度。氨基酸序列为SSDPLVVAASIIILHLILWILDRL。本研究中使用了三种位点特异性标记肽13C、，15Val28、Ser31、Ile32和Leu36（VSIL-M2TM）、Gly34、His37和Ile39（GHI-M2TM）以及Leu40和Trp41（LW-M2TM）的N标记残基。
M2TM以5:5:5:4.5的摩尔比被重组为一种由POPC:POPE:SM:Chol组成的类病毒膜（称为VM+）34,35将脂质在氯仿和甲醇中共溶，在氮气下干燥并冻干过夜。将均匀的脂质粉末悬浮在1mL pH 4.5的水中，涡旋，并经历八个循环的冻融以产生均匀的囊泡。制备这些膜样品时没有使用缓冲液，因为许多常见的缓冲离子（如磷酸盐和Tris）与Cu（II）形成不溶性络合物36,37，耗尽溶液中的游离Cu（II）离子。将M2TM溶解在1 mL pH 4.5水中的辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（OG）中，然后与1 mL脂质囊泡溶液混合，使OG浓度达到12 mg/mL。溶液涡流2小时，并在4°C下与1 L pH 4.5水透析3天，每12小时换一次水，以去除洗涤剂。蛋白质脂质体溶液在150000 g和~4°C下离心4小时，得到约45%水合的膜颗粒。将颗粒转移到4mm MAS转子中进行固态核磁共振实验。肽与脂质（不包括胆固醇）的摩尔比为1:15。在不进行透析的情况下制备无肽POPC膜，作为PRE实验的对照。跨膜M2肽在脂质双层中的四聚体组装和通道活性已通过各种生物物理实验和功能测定得到证实7,38,39.
含铜（II）的膜样品
通过直接滴定MAS转子中的氯化铜溶液，将Cu（II）离子并入膜样品中。我们样品中的M2TM单体浓度在约45%wt%的水合水平下约为0.1 M，因此需要最少0.025 M Cu（II）才能占据所有四聚体通道。Cu（II）还与水中的氢氧化物离子强烈络合，形成不溶性氢氧化铜，溶解度积恒定K（K）服务提供商≡ [铜2+]·[哦−]2第4.8·10页−20
M（M）三为了最大限度地减少氢氧化物结合并保持0.025 M的游离Cu（II）浓度，必须将体积pH值降低到5.1(图S1). 此外，Cu（II）还与脂质磷酸盐结合。我们的滴定测试表明，在单体：脂质摩尔比为1:15的情况下，每M2TM四聚体适度过量4当量的Cu（II）会饱和脂磷结合位点，同时产生足够的通道结合，如13C预处理。在Cu（II）：四聚体：脂质摩尔比为4:1:60的条件下，样品的pH值控制在4.8，以避免Cu（Ⅱ）被氢氧化物离子沉淀。将适量的氯化铜溶液滴定到膜中，以达到所需的pH值和浓度。滴定后，再次对样品进行冻融，然后在37°C的封闭转子中培养过夜，以使Cu（II）在膜内平衡。His37确认了最终样品的低pH值15N光谱如下所示。
固体核磁共振实验
使用4 mm三共振MAS探针在Bruker DSX-400 MHz（9.4特斯拉）光谱仪上进行固体核磁共振实验。典型的射频脉冲长度为3.5–5.0μs13C、 6.0μs用于15N、 3.0–4.0μs1H和5.0μs31第页。13C、，15N、 和31P化学位移分别参考α-Gly13TMS刻度上176.465 ppm处的CO信号15液氨标度上N-乙酰-缬氨酸的N信号为122.0 ppm，磷酸标度上羟基磷灰石信号为+2.73。使用MAS探针中的内置加热器和动力学热力系统XR空气喷射样品冷却器调节样品温度。
13C T公司1使用托尔奇亚z滤波器序列测量弛豫时间40在8kHz MAS下。31在298 K下，通过5–6 kHz MAS下的直接极化测量P光谱。1D双量子（DQ）滤波13测量C光谱以检测13标记肽的C信号没有脂质背景信号。SPC5重耦序列41用于激发和逆转13C类-135–7 kHz MAS下的C DQ相干性。第2天13C类-13C和15N个-13在243 K下测量C相关光谱，用于肽信号的共振分配。第2天13C类-13在6–9 kHz MAS下，使用40 ms的自旋扩散混合时间测量C相关光谱。第2天15N个-13使用基于REDOR的脉冲序列在7 kHz MAS下测量C相关谱42混合时间为0.8ms，主要生成单键15N个-13Cα交叉峰。
结果
使用Cu（II）PRE进行距离提取
我们首先总结了从Cu（II）诱导的PRE中提取距离的定量方面。纵向弛豫增强，Γ1，是无顺磁离子和有顺磁离子时弛豫速率之间的差值，
横向PRE，Γ2，可以进行类似的定义。如果我们假设是反磁性的13C类1.0 s，这是中等MAS频率下膜结合蛋白的骨架碳的典型特征，然后我们获得了对13CΓ1在如中所示.获得Γ1大于10秒−1，对应于Cu（II）-13C距离小于8Å(等式4),必须短于0.1秒。
从Cu（II）诱导的距离提取13C T公司1之前。（a） Γ的依赖性1在，假设为反磁性T11.0秒（b）13C-Cu（II）距离作为T的函数第1页对于不同的Γ1.距离对T不敏感第1页对于T第1页>1纳秒。（c） 距离作为Γ的函数1对于T第1页=2.5纳秒。
在金属中心近似下，未配对电子的核自旋顺磁弛豫增强取决于电子-核距离第页根据Solomon-Bloembergen方程9,12,43:
这里，μ0= 4π × 10−7Tm/A为真空渗透率，γn个是核自旋旋磁比，等于2π×10.705 MHz/T13C、，克e（电子）是电子自旋克-因素，μB类= 9.274 × 10−24J/T是玻尔磁子，S是顺磁离子的电子自旋量子数ωn个和ωe（电子）是感兴趣磁场中原子核和电子的拉莫尔频率。纵向和横向相关时间τc1级和τ二氧化碳，取决于电子弛豫时间T第1页和T第二版，旋转相关时间（τ第页)以及交换相关时间（τM（M）):
近似值T第1页=T第二版.对于无化学交换的固体，τ第页和τM（M）是长的，因此τc1级和τ二氧化碳近似等于电子弛豫时间。T型钢第1页铜（II）的含量估计在1–5 ns范围内44.自Γ1与T大致呈线性关系第1页但对于距离的六次幂倒数，它对距离比T更敏感第1页.显示了第页T上第1页对于Γ1值为0.35–200 s−1.对于给定的Γ1，距离基本上与T不变第1页对于T第1页>1纳秒。例如，对于Γ1=4秒−1，T的距离为9.4±0.4°第1页1-5毫微秒。对于Γ1=0.35秒−1，获得了更长的距离15º，不确定度为±0.70º。因此，我们使用一个中间T第1页在接下来的距离分析中，值为2.5ns。
输入各种常数并使用9.4特斯拉的磁场，我们得到了距离依赖性13C T公司1之前：
绘制r作为Γ的函数1，这使我们能够估计可测量的极限13C-Cu（II）距离。假设最小值在严重谱线加宽开始前50 ms，aΓ1约20秒−1得到，对应于最小值13C-Cu（II）距离约为7.5°。在另一个极端，如果可以通过1.0秒为0.9秒，则Γ10.11 s–1对应于最大值13C-Cu（II）距离为18°。这是一个保守的上限，因为在较高的MAS频率下13C T公司1由于自旋扩散的抑制，将延长，从而允许较小的Γ1要解析的值以检测更长的距离。对于小于7.5º的距离，预计横向PRE将占主导地位，以拓宽光谱。各向同性PCS也可能变得可见；然而，对于铜（II）来说，由于其较小，这种影响通常较弱克-张量各向异性，因此对结构测定用处不大。
Cu（II）与脂质膜的结合
突变和电生理实验表明，高亲和力Cu（II）结合位点为His37，可能存在平衡反应铜2++ 4伊斯Ä [铜(伊斯)4]2+然而，在水合脂质膜中，还存在另外两种Cu（II）结合平衡。Cu（II）可以以2:1或1:1的化学计量比与磷酸脂基团结合45,46没有结合常数的报道，但一些其他二价阳离子（如Mn）的离解常数2+和Co2+被发现在1–4 M范围内45Cu（II）也能与溶液中的氢氧化物离子结合，但这种结合可通过对样品使用酸性pH值来最小化。下面我们首先评估Cu（II）与膜表面的结合程度及其对脂质信号的影响。我们测量了31P和13无蛋白POPC双层和脂质的C光谱13C T公司1在不存在和存在Cu（II）的情况下。使用的低Cu（II）：脂质摩尔比为1:15，与大多数含蛋白质样品的摩尔比相同。表明31加入Cu（II）后，P MAS信号被完全抑制，证实离子与磷酸盐结合。相比之下，与磷酸盐最接近的头部组Cα和甘油G3碳保留了13C信号，但表现出0.3–0.4 ppm的线宽和小频率变化。这些频率变化不是由于费米接触位移引起的，因为Cu（II）的未配对电子和脂碳之间没有共价键或轨道重叠。它们也不太可能是由脂质构象变化引起的。首先，即使在比此处使用的离子浓度更高的情况下，多价金属离子也只影响极性头部组α和β片段，如通过2H四极联轴器47,48.没有2与此处检测到的G3化学位移变化相比，甘油主链组观察到H四极耦合变化。其次，我们之前使用二价阳离子Mn（II）进行的PRE研究显示，二价阳离子与脂质磷酸盐的电荷-电荷相互作用与Cu（II）相似，但没有发现13C化学位移变化20,22因此，Cu（II）结合膜中的G3和Cα化学位移变化很可能是由假接触位移引起的。显示了一对具有代表性的13C T公司1松弛曲线：T1甘油G3在Cu（II）结合后从206 ms降至37 ms。绘制13CΓ1对于所有脂类基团，作为其与膜表面深度的函数，我们得到了预期的Γ单调下降趋势1随着与膜表面距离的增加(). Γ1数值范围为22至0.3 s−1(表S1)，对应有效Cu（II）-13C距离7.4–15º。这些数值与脂碳到膜表面的深度有很好的定性关系，这是从衍射数据中得知的49定量地说，甘油G3和头部基团Cα碳的PRE距离（~7.5º）比它们到磷酸盐的深度或距离更长。这种差异可以通过Cu（II）离子在中性脂质膜表面横向扩散的事实来理解45,46，在单个脂质头部组的停留时间远短于10−6秒47,48从而通过〈降低PRE效应第页〉−6和更短的相关时间50对于酰基链碳，这种距离平均效应减弱，因为这些碳的显著深度使到表面Cu（II）离子的瞬时距离更具可比性。总的来说，表S1表明，对于酰基链碳的下半部分，由于表面结合的Cu（II）导致的弛豫增强为0.1–1s−1因此，如果蛋白质残基很好地嵌入到膜的中间13C T公司1PRE比这个范围大得多，那么蛋白质中的Cu（II）结合位点必须比表面结合的Cu（II）更接近。
Cu（II）结合对POPC双层核磁共振谱的影响。（a）31P和13在1:15 Cu（II）：脂质摩尔比下，无（顶部）和有（底部）Cu（Ⅱ）的C光谱。这个31P信号被T猝灭2PRE、甘油和头部组13C信号显示G3和Cα的线宽和小的伪接触位移。（b）13C T公司1G3的松弛曲线。（c）13C T公司1从双层表面到双层中心的脂质官能团的PRE显示出单调下降的Γ1.
Cu（II）诱导13C膜结合M2TM的预处理
为了确定M2中Cu（II）的特定结合位点，我们测量了13C T公司1九个跨膜残基的PRE，包括Val28、Ser31、Ile32、Gly34、Leu36、His37、Ile39、Leu40和Trp41。显示了13在没有和存在Cu（II）的情况下，Val28、Ser31、Ile32、Leu36标记的M2TM的C光谱。在四个标记残基中，Leu36 Cα和Cβ表现出最强的谱线展宽，如1D和2D所示13C光谱(图S2)表明Leu36是四个标记残基中最接近Cu（II）的。显示了13C T公司1无Cu（II）和铜（II）结合样品的弛豫曲线。除了4:1 Cu（II）：四聚体样品外，我们还检查了1:1 Cu（III）：四聚体样品的光谱，以观察PRE效应的进展。大小合适的T1所有残留物均检测到松弛增强。以4:1的比例，13CΓ1范围从1.5到2.6秒−1()对应于距Cu（II）中心11.6–10.6Ω的距离。
Cu（II）结合对化学位移和13C T公司1VSIL-M2TM在VM+膜中的松弛。（a）13在1:1（绿色）和4:1（红色）Cu（II）：四聚体比率下，无（黑色）和有Cu（Ⅱ）时的C光谱。Leu36表现出最强的谱线展宽（另请参见图S2). （b–e）代表13C T公司1apo、1:1和4:1样品的弛豫曲线。（b） Val28 Cα。（c） Ile32 cα。（d） 血清31 Cα。（e） 亮氨酸36 Cα。（f） 二维15N个-13载脂蛋白和4:1 Cu（II）结合的VSIL-M2TM样品的C相关光谱。Ser31表现出明显的15N化学换档。
表1
13C T公司1和T2膜结合M2TM的PRE。结合样品使用的Cu（II）：四聚体比率为4:1。
| 残留 | 现场 | 我对位/我迪亚 |
（s） |
（s） | Γ1（个）−1) | r（奥数） |
|---|
| 第28版 | Cα | 0.92 | 1.4 ± 0.2 | 0.40 ± 0.01 | 1.80±0.12 | 11.2±0.1 |
| 第31期 | Cα | 0.70 | 1.4 ± 0.2 | 0.45 ± 0.02 | 1.51±0.14 | 11.6±0.2 |
| I32号机组 | Cα | 1 | 1.4 ± 0.2 | 0.38 ± 0.03 | 1.92±0.23 | 11.1±0.2 |
| Cγ2 | 0.77 | 2.4 ± 0.2 | 0.53 ± 0.01 | 1.47±0.05 | 11.6±0.1 |
| Cδ1 | 0.74 | 2.4 ± 0.3 | 0.46 ± 0.02 | 1.76±0.11 | 11.3±0.1 |
| G34（G34） | Cα | 0.22 | 2.6 ± 0.2 | 0.25 ± 0.01 | 3.62±0.16 | 10.0±0.1 |
| L36层 | Cα | 0.52 | 1.0 ± 0.1 | 0.28 ± 0.02 | 2.57±0.27 | 10.6±0.2 |
| Cβ | 0.61 | 0.7 ± 0.1 | 0.30 ± 0.02 | 1.90±0.30 | 11.1±0.3 |
| 第37页 | Cα | 0.18 | 1.9 ± 0.3 | - | - | < 7.5 |
| Cγ | 0.13 | - | - | - | < 7.5 |
| Cδ2 | 0.16 | - | - | - | < 7.5 |
| Nδ1 | 0.11 | - | - | - | < 7.5 |
| I39号 | Cα | 0.58 | 0.77 ± 0.09 | 0.20 ± 0.03 | 3.70±0.77 | 10.0±0.3 |
| Cγ2 | 0.60 | 1.2 ± 0.1 | 0.36 ± 0.04 | 1.94±0.32 | 11.1±0.3 |
| Cδ1 | 0.73 | 1.2 ± 0.1 | 0.34 ± 0.03 | 2.11±0.27 | 11.0±0.2 |
| L40层 | Cα | 0.23 | 2.4 ± 0.1 | 0.11 ± 0.02 | 8.67±1.65 | 8.7±0.3 |
| Cβ | 0.45 | 1.5 ± 0.3 | 0.28 ± 0.01 | 2.90±0.19 | 10.4±0.1 |
| 第41周 | Cα | 0.33 | 2.5 ± 0.3 | 0.19 ± 0.03 | 4.86±0.83 | 9.5±0.3 |
| Cδ1 | 0.40 | 3.3 ± 0.1 | 0.23 ± 0.02 | 4.04±0.38 | 9.8±0.2 |
| Cη2 | 0.70 | 2.4 ± 0.2 | 0.25 ± 0.03 | 3.58±0.48 | 10.0±0.2 |
| Cε3 | 0.63 | 2.4 ± 0.1 | 0.23 ± 0.02 | 3.93±0.38 | 9.9±0.2 |
| Cζ3，Cγ | 0.50 | 3.4 ± 0.3 | 0.26 ± 0.01 | 3.55±0.15 | 10.0±0.1 |
除了增强13C纵向和横向弛豫，Cu（II）结合也扰动了15Ser31从载脂状态的117.9 ppm化学位移到Cu（II）结合状态的114.1 ppm(). 这种大的位移不能归因于PCS，而必须归因于Cu（II）诱导的该残基的构象变化。我们之前表明，Ser31是金刚烷胺最大化学位移扰动的位置，其中15N化学位移增加DLPC双层中从载脂蛋白状态的115 ppm到药物结合状态的121 ppm51.类似15当M2TM与类病毒膜结合时，也观察到N化学位移增加34Cu（II）结合改变了Ser3115相反方向上的N化学位移表明Cu（II）对M2TM构象的影响与金刚烷胺不同。
显示了13C和15在没有和存在Cu（II）的情况下，GHI-M2TM的N光谱。这个13C光谱用13C双量子滤波器抑制脂质天然丰度13C信号。在三个残基中，His37信号几乎完全被Cu（II）猝灭（<18%残留强度），而Ile39保留了最大强度。如1D和2D所示，His37的芳香信号基本上无法检测到13C相关谱(). 这些结果强烈表明Cu（II）与His37结合。对于可检测的Gly34和Ile39残基，大多数位点显示出清晰的T1弛豫增强(图S3a、b). 此外，分解的脂质13C信号如甘油骨架G2显示出相当的T1PRE作为无蛋白膜(图S3c)表明无论是否存在蛋白质，Cu（II）与膜表面的结合都类似。除了引起PRE外，Cu（II）还干扰了Gly34的构象：载脂蛋白肽在175.6和173.2 ppm处出现两个Gly34 CO峰，而Cu（Ⅱ）结合肽在172.2 ppm处显示CO峰。以前的化学位移分析52和方向测量53表明175ppm处的下行CO峰值对应于Gly34处扭结的M2TM，而直线TM螺旋显示出更高的上行Gly34 CO化学位移。
13C和15无Cu（II）（黑色）和Cu（Ⅱ）的VM+膜中GHI-M2TM在4:1 Cu（III）：四聚体比（红色）下的N MAS光谱。（a） 一维13C双量子滤波光谱仅检测肽信号。Cu（II）主要抑制His37脂肪族和羰基信号。（b） 一维芳香区13C含和不含Cu（II）的MAS光谱。除130 ppm时的脂质信号（用星号表示）外，所有咪唑信号均被Cu（II）抑制。（c） 2D区域13C类-13GHI-M2TM的C相关谱。Cu（II）结合抑制了His37信号并干扰了Gly34-CO化学位移。（d） 一维15N MAS光谱。移除His37 Nε2信号，同时保留一小部分（约10%）Nδ1强度。对这两个光谱进行缩放，使Nδ1强度匹配，以显示Nε2峰的优先抑制。否250-ppm15观察到N信号，从而验证样品的酸性pH。方框中显示了Cu（II）-Nε2螯合咪唑结构。
原则上，Cu（II）可以与His37的Nε2或Nδ1结合，其分别面向通道的C端和N端，这是因为转译His37侧链的旋转器54,55为了确定哪种氮与Cu（II）配位，我们测量了15His37标记M2TM的N MAS光谱。上一个2D15N个-13C相关光谱表明，咪唑环的两个氮在各向同性化学位移方面相差4.1 ppm：Nε2在176.3 ppm共振，Nδ1在180.4 ppm共振54由于Nε2在较大pH范围内具有较高的质子亲和力。结果表明，Cu（II）结合完全抑制了上场Nε2峰值，同时保留了约10%的Nδ1信号，表明Cu（Ⅱ）优先结合Nε2。
如果Nε2结合正确，那么C末端到His37的残基的PRE应大于N末端到His27的残基。为了验证这个假设，我们测量了13C LW-M2TM的PRE。事实上，主干链和侧链13Leu40和Trp41的C信号表现出明显的线宽()Cα峰降低至载脂蛋白强度的20–30%。13C T公司1松弛速率也大幅增加。Leu40 Cα产生γ18.67秒−1对应于~8.7 Au到Cu（II）的距离(). 这个Γ1比Gly34 CαΓ大得多13.46秒−1由于Leu40和Gly34都是His37的三个残基，它们不同的PRE进一步支持了这样的结论，即Cu（II）从His37和Trp41之间的C末端侧结合咪唑环。
13C T公司1M2TM中Leu40和Trp41的PRE。（a） 一维13在4:1 Cu（II）：四聚体比率（红色）下，无Cu（Ⅱ）（黑色）和有Cu（II）的LW-M2TM的C光谱。指定关键肽信号。脂质13C信号由星星表示。（b–c）13C T公司1Leu40 Cα（b）和Trp41 Cδ1（C）的弛豫曲线。强T1观察到弛豫增强，支持Cu（II）在His37和Trp41之间与Nε2结合。由于与脂质Cγ峰部分重叠，使用双指数函数拟合Leu40 Cα衰变数据。
列出了13C T公司1PRE和所有标记残留物的距离。这个13C强度降低，测量为比率我对位/我迪亚在Cu（II）结合样品和反磁性样品之间，也列出了反映定性T2放松增强。对于强度抑制的His37，使用了保守的距离上限7.5º，尽管Cu（II）到咪唑侧链原子的实际距离几乎肯定要短得多。TM螺旋的中段，从Gly34到Leu40，表现出3-9s的纵向PRE−1()，比膜表面可比深度处脂链碳的PRE大一个数量级(表S1). 这证实了该片段中存在高亲和力Cu（II）结合位点，该位点主要负责这些残基的PRE效应。绘制了Cu（II）结合后的剩余Cα强度。最小强度出现在His37处，表明Cu（II）结合位点。Gly34 Cα也表现出低强度。然而，该值不能准确反映到Cu（II）中心的很短距离，因为CH2甘氨酸Cα组经历更严重1与其他氨基酸的CH Cα基团相比，Cu（II）对H信号的猝灭，从而通过1H（H）-13C交叉极化。比较13C吨1Cα位点的PRE及其强度折减因子。非Gly残基在Γ1和强度降低，与一般情况一致第页−6Γ的依赖性1和Γ2虽然His37 CαΓ1根据强度折减系数aΓ无法测量1约10秒−1应为。
之间的相关性13C T公司1和T2之前。（a） Cu（II）诱导M2TM的Cα强度降低，反映T2之前。（b） 13C吨1PRE和13C强度折减系数，是（a）中绘制的剩余强度的倒数。显示大T的残留物1PRE也有很大的强度降低。Gly34 Cα的强度异常低（强T2PRE）因为CH2Cα组对1H被Cu（II）淬灭比所有其他氨基酸残基的CH Cα基团。His37 Cα强度降低表明13CΓ1约10秒−1（开圆圈）。
显示了M2TM中Cu（II）与His37结合的结构模型。我们使用1.65Å的晶体结构（PDB:3LBW）来模拟Cu（II）与各种残基的距离，但当使用M2TM最近的固态NMR结构（PDB:2KQT）时，得出了相同的结论56我们将Cu（II）放置在四个等效的His37 Nε2原子形成的正方形的中心。这样定位，Cu（II）离子与四个角的氮素的距离约为3.0º，这在Cu（Ⅱ）与组氨酸氮素距离的文献范围内57该Nε2结合位点产生的距离与TM螺旋中心段的PRE测量值一致(表S2). 与替代的Nδ1结合模型相比，Nε2结合模型与N末端残基的距离更长，与C末端残基之间的距离更短。两种模型之间的最大距离差发生在Gly34 Cα，距离Nε2-结合Cu（II）8.7 Au，但距离Nδ1结合位点仅6.3 Au。后者对应于Γ1约60秒−1，未检测到。此外，如此短的距离将意味着Gly34信号完全熄灭，这与实验数据不一致(). 两个结合位点之间的另一个关键区别是Leu36和Leu40之间的相对距离。上Nδ1位点的Cu（II）结合预测到Leu36的距离比到Leu40的距离短，这与光谱强度（Leu40剩余强度较小）和T的趋势相反1PRE（较高Γ1对于Leu40）。总的来说，数量13CΓ1谱线展宽始终支持His37 Nε2作为Cu（II）结合位点。
M2TM中Cu（II）结合位点的建议模型。Cu（II）（橙色）结合在由His37四分体的Nε2原子形成的方形中心，被困在由顶部的四个His37咪唑环和底部的四个Trp41吲哚环组成的芳香笼中，从而解释了结合的高亲和力和抑制质子传导的机制。
对于接近TM肽末端的残基，测得的PRE距离小于到His37 Nε2结合位点的预测距离。Val28的差异尤其明显，对于Nε2或Nδ1结合位点，其预测距离分别为18和16º，而测量距离为11º(表S2). 这种差异是由于Val28比His37更接近膜表面（10–11 Au）(表S2)因此，表面结合Cu（II）会产生显著的PRE效应。
讨论
His37Nε2上Cu（II）的高亲和力结合位点：His-Trp“笼”结合模型
观察到的13C和15N光谱展宽（T2PRE）和13C T公司1PRE表明Cu（II）与His37 Nε2结合，距离选通残基Trp41不远(). 蛋白质中经常观察到金属螯合咪唑Nε2有利于Nδ118,57,58在M2的情况下，Cu（II）包埋在由四个咪唑啉环和四个吲哚环组成的芳香笼中，与N端与Nδ1结合相比，Cu。通过His37和Trp41四分体之间的结合，Cu（II）可以通过多种方式抑制质子电流，包括干扰His37水质子交换59阻止His37构象动力学54，并干扰His-Trp阳离子-π相互作用60,61Cu（II）的Nε2配位隐含地与一个结构模型不一致，其中带电咪唑氢键的Nε）2与中性咪唑的Nδ162在用于NMR样品的低pH值下，Nε2和Nδ1最初都被质子化，因此与Nε2中结合的Cu（II）首先必须置换一个质子，这与低pH值比高pH值下Cu（Ⅱ）抑制开始较慢相一致。
当将Cu（II）溶液注入在外部低pH溶液中浸泡的内部高H卵母细胞时，它没有抑制野生型M2通道，而是抑制W41A突变通道。这被解释为Cu（II）无法从C-末端侧通过庞大的Trp-吲哚环，这种影响通过突变较小的Ala而消除。在SSNMR样品中使用的对称低pH条件下，Cu（Ⅱ）进入His37结合位点更可能是双向的，因为Trp41门应该在酸性pH下打开，如NMR距离测量所示8和晶体结构55,63原则上，在Trp41门关闭且Cu（II）对His37的亲和力较高的较高pH值下测量Cu（Ⅱ）结合是很有趣的。然而，为了避免Cu（II）与较高pH值下更丰富的氢氧化离子结合，必须使用低得多的Cu（III）浓度，这反过来会要求在没有增敏技术的情况下，蛋白质浓度比固态NMR低得多。
Cu（II）的低亲和力结合位点
当前13C PRE数据强烈表明电生理数据中的低亲和力Cu（II）结合位点33是膜表面的磷酸脂。即使在低Cu（II）浓度下，表面结合的Cu（Ⅱ）也会使Val28产生可检测的PRE，该PRE距离His37相对较远，但更接近膜表面。检查31脂质的P光谱和2D15N个-13VSIL-M2TM的C谱(图S4)当Cu（II）从0，1:1滴定到4:1时，Cu（Ⅱ）：四聚体比率为Cu（II）结合过程提供了有用的见解。这个31P光谱在1:1的比例下显示出较小的残余强度，但在4:1的比例下没有强度。Val28峰值已经在1:1的比率下变宽，在4:1的比率下进一步变宽。相比之下，Ser31峰在1:1的比率下没有从载脂蛋白位置偏移，但在15N尺寸为4:1。这些结果表明，第一个Cu（II）离子与膜表面结合，导致大多数表面近端残基的PRE较弱。当Cu（II）浓度增加时，膜表面结合位点饱和，完全抑制31P强度。然后，额外的Cu（II）离子进入通道结合His37，从而导致Ser31和Gly34的构象发生显著变化。由于膜表面能立即接触到水，并且离子必须扩散到通道孔中才能到达His37结合位点，因此Cu（II）与膜表面的结合速度比His37快，这解释了质子电导率测量中的快速初始动力学。然而，动力学较慢的通道结合位点具有较高的亲和力，这是因为Cu（II）与咪唑Nε2的螯合作用以及His-Trp笼的包封作用。
脂磷结合模型与生物化学证据一致，即低亲和力位点是非特异性的，具有快速的动力学，并且不依赖蛋白质中能够结合金属离子的各种侧链，包括Cys17、Cys19、Asp24和Ser3133膜表面结合的Cu（II）可能通过影响全长蛋白质细胞质结构域的构象阻碍质子传导，进而可能微妙地干扰TM螺旋的构象和堆积。
Cu（II）与金刚烷胺诱导的M2TM构象变化
电生理数据表明铜（II）抑制和金刚烷胺抑制M2质子通道之间既有相同之处，也有不同之处。虽然这两种化合物都能双向抑制通道，并且在高pH下效果更好，但Cu（II）结合亲和力比金刚烷胺弱10倍左右33Cu（II）结合也与疏水性药物竞争：之前将BL-1743应用于M2可以阻止Cu（Ⅱ）抑制。由于BL-1743被认为与金刚烷胺的作用相似，我们可以通过金刚烷胺和BL-1743与N端孔结合的事实来理解这种竞争性抑制56,63在Ser31，阻断了通道，从而阻止Cu（II）进入His37。另一个影响可能是金刚烷胺引起的通道脱水64以及由此产生的His37质子化平衡的扰动53,59可能会干扰Cu（II）结合。
与功能数据一致，观察到13C和15N化学位移表明Cu（II）结合和amantadine结合M2TM构象之间存在一些差异。Ser31和Gly34表现出Cu（II）结合的化学位移，这与金刚烷胺结合的化学偏移不同51,65这些位置的Cu（II）结合化学位移与低pH下更直的TM螺旋线更为一致52这些差异明显与His37和Ser31的不同结合位点有关。因此，这里获得的结构和机制信息表明，设计新药应该是可能的66以His37结合位点为靶点，抑制天然存在的金刚烷胺耐药M2突变体，如S31N和V27A。
研究膜蛋白的Cu（II）PRE
从中提取的距离13C T公司1预处理()从测量T中的随机不确定度传播而来，不确定度相对较小，为0.1–0.3Ω1值。然而，评估系统不确定性的程度是有用的，例如蛋白质的动力学、His37结合位点占用的不确定性、13C自旋扩散，以及多个Cu（II）离子对13C预处理。一般来说，蛋白质的各向异性运动和结合位点的不完全Cu（II）占据会减弱PRE，而多个Cu（Ⅱ）离子引起的多旋效应会增加PRE。因此，这些错误源应该部分消除。更仔细的考虑表明，在我们的实验条件下，这些潜在的不确定性来源实际上都是最小的。由于使用富含胆固醇和SM-的VM+膜进行M2TM重建，四聚体骨架不存在大幅度运动35与DMPC和POPC膜的情况相反67His37结合位点的占有率接近100%，否则将检测到显著的残留咪唑强度。While期间13对于T，在MAS频率为8 kHz时存在C自旋扩散1实验中，使用特定位置标记的样品应该会对残留间自旋扩散形成显著障碍，从而使13C T公司1测量值验证的相对现场特定值(). 最后，当Cu（II）：四聚体：脂质的摩尔比为4:1:60时，Cu（Ⅱ）的表面密度较低，约为每60脂质3 Cu（II）。典型的脂质头部组面积为60º2，两个Cu（II）离子在膜表面的平均距离约为35º。该距离远大于双层的一片小叶的厚度，因此，除了His37结合的Cu（II）外，膜包埋残留物最多只能经历一个表面结合的铜（II）。表面结合的Cu（II）相对于蛋白质也是动态的，这进一步削弱了其PRE效应。最后，表面结合Cu（II）的PRE原则上可以使用脂质进行内部校准13C表示残留物的近似深度已知(表S2). 因此，如有必要，可以更定量地考虑表面Cu（II）PRE效应，以分析蛋白质结合Cu（Ⅱ）导致的PRE。
这项研究表明，膜蛋白中功能重要的顺磁性离子可以用作结构探针，以确定金属结合位点并提供长距离约束。对于M2，Cu（II）与组氨酸的结合足够紧密，因为结合位点的几何形状没有检测到离解，并且可以使用适当的pH值和Cu（Ⅱ）浓度最小化或控制与氢氧化物离子和磷酸脂的额外结合平衡。对于蛋白质中的这种功能结合位点，不能使用金属螯合剂，因此可以使用其他顺磁核磁共振方法，其中金属螯合物共价连接到蛋白质侧链10或并入脂类或溶液中68不适用。这项研究表明，含有高亲和力顺磁性金属离子的膜蛋白通常适合结构研究。
致谢
作者要感谢石井义隆教授、克劳斯·施密特·罗尔教授和克劳迪奥·卢奇纳教授进行了富有见地的讨论。这项工作得到了NIH向M.H.拨款GM088204的支持。
工具书类
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