凋亡诱导的线粒体功能障碍导致细胞质脂质滴形成

脂滴形成增加与脂肪生成增加相关

为了研究诱导EL4细胞凋亡后脂滴积聚的来源，我们分析了从头开始通过测定[1,2的掺入量进行脂质合成-¹⁴C类₂]乙酸盐转化为细胞脂质。在细胞收获前1小时将标记的醋酸盐添加到细胞悬浮液中，并将¹⁴C标记为中性和极性脂质(图3a和b)已确定。药物治疗后2小时，与未经处理的对照细胞相比，三酰甘油（TAG）中的醋酸盐掺入量增加了三倍(P（P）<0.03），直到治疗后8小时，该值持续上升，随后下降(图3c). 这种下降与细胞活力的显著丧失相一致，这与裂解半胱天冬酶3水平的增加有关(图3g和h). 药物治疗后14和16小时，乙酸盐掺入TAG的量少于未经处理的对照细胞(图3c). 接下来，我们通过将细胞与¹⁴C-棕榈酸酯(图3d和e). 药物治疗后4小时，与未经治疗的对照细胞相比，掺入量没有显著增加，而这种增加的掺入量继续增加，直到12小时达到峰值，并且在14和16小时仍高于未经治疗对照细胞(图3f). 两者[1,2-¹⁴C类₂]醋酸盐和¹⁴药物治疗后，C-棕榈酸酯与极性脂质的结合普遍减少(图3b和e)如前所述。²⁵MEF也显示，用足叶乙甙治疗24小时后脂质合成增加(补充图S2B).

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图3

足叶乙甙诱导的细胞凋亡促进脂肪生成。(一)细胞与¹⁴在足叶乙甙处理后的指定时间收获前，C-醋酸盐作用1小时。在薄层色谱（TLC）板上分离脂类之前，提取脂类，并根据细胞数量对提取物体积进行标准化。具有代表性的自动射线照片¹⁴显示了不同中性脂类中的C-醋酸盐掺入。(b条)TLC板上极性脂质部分的代表性放射自显影图显示¹⁴C-醋酸盐掺入。(c（c）)¹⁴通过放射自显影的密度分析测定醋酸C-掺入TAG。这些值表示相对于对照组的合并百分比（平均值±S.D。，n个=9). (d日)代表性放射自显影¹⁴C-棕榈酸酯并入TLC板上的中性脂质部分。细胞与¹⁴在依托泊苷处理后的指定时间收获前1小时的C-棕榈酸盐。将脂质提取缓冲液的体积标准化为细胞数。(e（电子）)培养细胞TLC板上极性脂质部分的代表性放射自显影¹⁴C-棕榈酸酯。(（f）)¹⁴通过密度计测定C-棕榈酸酯并入TAG。这些值表示相对于对照组的合并百分比（平均值±S.D。，n个=9). (克)用台盼蓝染料排斥试验测定足叶乙甙处理后的细胞存活率。结果表示为平均值±S。D(n个=9). (小时)典型的western blot显示足叶乙甙处理对caspase 3裂解的影响(n个=3).^*P（P）<0.05,^**P（P）<0.01,^***P（P）<0.001. CE，胆固醇酯；胆固醇；DAG，二酰基甘油酯；Etop，依托泊苷；游离脂肪酸；N、 中性脂质；P、 极性脂质；磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺；PS，磷脂酰丝氨酸；标签，三酰甘油酯

受凋亡诱导影响的细胞信号通路可以抑制脂肪生成

足叶乙甙诱导EL4细胞凋亡导致p53蛋白预期增加(图4a)p53应答基因的表达，第21页和塞斯特林 2(图1和​和4b）。4b个). AMPK磷酸化增加，这与Sestrin 2表达增加和磷酸化p70-S6K减少相一致(图4a)与mTORC1复合物活性的抑制相一致。Akt丝氨酸473磷酸化似乎没有显著变化，尽管在以后的时间点总蛋白水平有所下降(图4a). AMPK磷酸化和活性的增加以及mTORC1的磷酸化和随后的抑制预计会降低脂肪生成酶的表达，¹⁰并通过磷酸化和抑制ACC1更强烈地抑制脂肪生成⁷(图1).

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图4

细胞凋亡调节改变基因表达、蛋白质水平和脂肪酶磷酸化状态的信号通路。EL4细胞用15μM etoposide持续16小时，每2小时获取一次蛋白质样品(一)典型的western blot显示凋亡诱导对p53、Akt、p-Akt（Ser473）、pS6K（Ser371）、pS6K（Thr389）、AMPK和p-AMPK（Thr172）水平的影响。肌动蛋白被用作蛋白质负荷的内部控制。(b条)的表达式级别塞斯特林2()和第21页()通过定量聚合酶链反应（PCR）获得。结果与它们的初始水平（未经处理的对照）有关。肌动蛋白表达水平用于使结果正常化（平均值±S.E.M。；^*P（P）<0.01,^**P（P）<0.001,n个=3). (c（c）)的表达水平ACLY公司(),ACC1公司()和FASN公司()通过定量PCR获得。将结果归一化为每个样品中的肌动蛋白水平，并与未经处理的对照组进行比较（平均值±S.E.M。；^*P（P）<0.01,^**P（P）<0.001,n个=3). (d）免疫印迹分析ACLY、p-ACLY（Ser454）、ACC1、p-ACC1（Ser79）、FASN和ACS水平。肌动蛋白被用作内部蛋白质负荷控制。每个蛋白质都有一个代表性样品

诱导细胞凋亡影响脂肪生成酶的表达和活性

ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）从头开始脂质合成途径(图1)，催化柠檬酸盐转化为乙酰辅酶A，基因表达没有显著变化(图4c)也不在活性磷酸化蛋白（p-ACLY）水平(图4d)依托泊苷治疗后。途径中的下一个酶ACC1在药物治疗后2小时显示磷酸化（p-ACC1）增加(图4d)与观察到的AMPK磷酸化和活化相一致(图4a). 这种依赖于磷酸化的酶抑制作用是由ACC1公司基因(图4c)后期酶蛋白降低(图4d). FASN也显示药物治疗后4小时基因表达显著降低，这也反映在后期酶蛋白的降低。FASN水平的降低可以解释药物治疗后14至16小时内醋酸盐掺入量的减少(图3c). 酰基辅酶A合成酶（ACS）的水平，该酶催化ATP依赖的游离脂肪酸（FFA）活化为脂肪酰基辅酸(图1)，在药物治疗后持续增加，反映了FASN水平的下降(图4d). 的表达式ACS公司通过增加FFA水平和脂滴激活。²⁶因此，观察到ACS蛋白的增加(图4d)与脂滴数量增加平行(图2c)并可以解释¹⁴药物治疗后稍后时间点C-棕榈酸酯进入TAG(图3f). 此外，ACS的活性通过sirtuin 1（Sirt1）的脱乙酰化来增强，以响应NAD的减少⁺浓度。²⁷在用足叶乙甙处理的EL4细胞中观察到的NAD（H）耗竭，这已被证明是由于聚ADP-核糖聚合酶的激活，²⁸与Sirt1蛋白水平增加相关(补充图S3A)表明ACS酶的活性在药物治疗后的稍后时间点也可以增强。

确认ACS和从头开始TAG合成用于脂滴形成，用Triacsin C（TrC）处理细胞，TrC是该酶的特异性抑制剂。尽管依托泊苷增强了细胞凋亡的诱导(补充图S3B)，该药物抑制了脂滴的形成(补充图S3C)，减少了¹⁴C-醋酸盐进入TAG并增加¹⁴C并入FFA(补充图S3D和S3E). 然而，直到足叶乙甙治疗6小时后才观察到ACS含量的增加，因此不能解释早期脂滴含量的增加(图2c)和TAG合成¹⁴C-乙酸盐(图3c)，在药物治疗后2小时已经明显，并且TAG合成增加¹⁴C-棕榈酸酯，药物治疗后4小时已观察到(图3f).

细胞凋亡和脂滴含量的评估

电池（5×10⁶)离心并重悬于含有100 nM MTO CMTMRos的1 ml预热培养基（Invitrogen，Paisley，UK）中，在37°C下孵育30分钟，离心，然后重悬于冰冷的3%BSA的HBS中（HEPES缓冲盐水：20 mM HEPES，150 mM NaCl，2 mM CaCl₂pH 7.4），在4°C下保持30分钟。用HBS清洗后，细胞在100μl含5的HBSμl AV-Alexa Fluor 647（Invitrogen）在室温下保持30分钟。然后用HBS清洗所得混合物三次，并在室温下用1 ml HBS（含10 ng/ml Body493/503（Invitrogen））培养20分钟。最后，用HBS清洗细胞两次，并在100次后重新悬浮μl冰镇HBS，含20μg/ml的7AAD（Invitrogen）。样品在冰上短暂保存，然后装入ImageStream流式细胞仪系统（Amnis Corporation，西雅图，华盛顿州，美国）。对于每个样本，在标准模式下收集了10000个事件。使用IDEAS软件（Amnis Corporation）对数据文件进行分析，根据不同人群的荧光染色对其进行筛选，获取单个细胞的荧光图像，并测量不同染料的中值强度。通过应用软件中的“斑点计数”功能，可以获得脂滴数量（Bodypy（500–560 nm）通道中的斑点数量），该功能比较图像中像素强度的分布，提供连续连接区域的数量。

脂质合成的测量

细胞收获前1小时，2μCi/ml[1,2-¹⁴C类₂]乙酸盐，0.5μCi/ml[1-¹⁴C] 油酸盐（Perkin Elmer，Waltham，MA，USA）或1μCi/ml[1-¹⁴C] 向培养基中添加PBS中含有10%BSA的棕榈酸酯（GE Healthcare，Chalfont St Giles，UK）。通过改进布莱和戴尔法从细胞颗粒中提取脂质⁴⁰并溶解在与细胞总数成比例的氯仿中。中性脂质使用含有己烷：乙醚：乙酸（70:30:1）的溶剂系统在硅胶60板（英国麦德斯通沃特曼）上通过薄层色谱法进行拆分，而极性脂质的溶剂系统包含氯仿：甲醇：乙酸：水（50:37.5:3.5） : 2).¹⁸使用Typhoon Trio System（GE Healthcare）获得荧光图像，并使用ImageQuant TL软件（GE Hearthcare，GE Healthcare）对不同脂质带进行密度分析。

脂肪酸的测定β-氧化

用100预处理细胞μ实验前，油酸甲酯或棕榈酸酯在PBS中的10%BSA中溶解24小时；0.5 μCi/ml[1-¹⁴C] 油酸盐（Perkin Elmer）或1μCi/ml[1-¹⁴C] 在细胞收获前1 h将棕榈酸盐（GE Healthcare）添加到培养基中。的陷阱¹⁴一氧化碳₂按照傅的描述表演等。⁹和使用液体闪烁计数器（Perkin Elmer）测定的计数。测量的放射性被归一化为细胞数。为了测量葡萄糖氧化，2μCi/ml（每毫升）D类-[美]-¹⁴C] 在细胞收获前1小时将葡萄糖（GE Healthcare）添加到培养基中，并使用相同的程序测量¹⁴一氧化碳₂生产。

显微镜

在显微镜实验中，将10000个细胞接种到μ-滑动8孔板（Ibidi，Martinsried，德国），300μl中等。细胞用3%多聚甲醛固定在PBS中，然后用冰镇PBS彻底清洗。细胞用0.3μM DAPI（Invitrogen）在室温下培养5分钟，用冰镇PBS洗涤，并在室温下用1×HCS LipidTOX深红色中性脂质染色（Invit罗gen）培养30分钟。使用尼康C1Si共焦显微镜（尼康，金斯顿，英国）获取荧光图像。

实时定量逆转录PCR

RNA通过使用RNeasy Plus Mini试剂盒（英国克劳利市齐根）提取，并使用SuperScript III RT-PCR第一链合成系统（Invitrogen）进行反转录。用于扩增的正向（fw）和反向（rev）引物序列如下：ACLY，5′-GGGTGACTCCCGACACACACAT-3′（fw，5′-TGATTAACTGGTCTGTGACA-3′（rev，rev）；ACC1，5′-CAGTCTACATCCGCTTGGCTG-3′（fw）和5′-CACCTCCTTCCGCTCAGTG-3’（rev）；FASN，5′-TCCTGGAACGAACGATCT-3′（fw）和5′-GAGACGTGCACTCCCTGGACTTG-3′（rev）；p21，5′-GACAAGAGGCCCAGTACTCCT-3′（fw）和5′-CAATCTGCGCTTGGAGTGATA-3′（rev）；Sestrin2，5′-CTCAAGCTGGTCTGTGTG-3′（fw）和5′-CCCCCGTGTGGCAATACC-3′（rev）；肌动蛋白，5′-CTTCAACCCACACCATGA-3′（fw）和5′-CATCACAATGCCTGTGTACG-3′（rev）；L32，5′-AAGCGAAAACTGGCGAAAC-3′（fw）和5′-GATCTGGCCTTGAACCTTCT-3′（rev）。

肌动蛋白基因被用作内部控制，以使实时逆转录PCR的结果正常化。Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）用于设置反应。在7900 HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）上使用以下循环条件进行扩增和检测：50°C 2 min，95°C 10 min，然后是40个95°C循环15 s和60°C 1 min。分离阶段95°C 15 s，60°C 15添加s以检查反应特异性。通过比较Ct法将获得的Ct值转换为相对表达值，用肌动蛋白获得的值进行校正，并将其归一化为未经处理的对照水平。

蛋白质印迹

细胞沉淀用冰冷的PBS洗涤，并在−80°C下储存，直至使用。将颗粒溶解在补充了PhosSTOP磷酸酶抑制剂鸡尾酒（英国伯吉斯山罗氏应用科学公司）和COMPLETE-mini-Protease Inhibitor鸡尾酒的M-PER哺乳动物蛋白提取试剂（英国克拉姆林顿Thermo Scientific公司）中，并通过离心法去除细胞碎片。使用QuickStart-Bradford Assay（英国Hemel Hempstead的Bio-Rad）测定蛋白质浓度。总共20人μ将g蛋白质装入4–20%凝胶上的每个通道中，并转移到聚偏氟乙烯膜（Invitrogen）上。用以下抗体探测膜：p53、Akt、磷酸-Akt（Ser473）、磷酸-p70 S6激酶（Ser371）、磷酸-p70 S6酶（Thr389）、AMPK、磷酸-MPK（Thr172）、ATP-柠檬酸裂解酶、磷酸-ATP-柠檬酸裂解酶类（Ser454）、乙酰-CoA羧化酶、磷酸-乙酰-CoA-羧化酶类（Ser79）、FASN、乙酰-Co A合成酶、SirT1、caspase 3、，裂解半胱天冬酶3（全部来自美国马萨诸塞州丹弗斯的细胞信号技术）、FSP27（英国剑桥的Abcam）和肌动蛋白（西格玛-奥尔德里奇）。使用ImageQuant TL软件（GE Healthcare）进行密度分析。

北美⁺/NADH测量

NAD水平⁺使用NAD测定NADH⁺/NADH定量试剂盒（BioVision，美国加利福尼亚州山景城），根据制造商的说明。

ROS测量

细胞采集前1小时，100μM羧基-H₂将DCFDA（Invitrogen）添加到每个细胞样品中，细胞保存在培养箱中（37°C，5%CO）₂). 培养后，用冰镇HBS清洗细胞，并将其重新悬浮在1ml HBS中。在LSRII流式细胞仪（英国牛津BD Biosciences）中对每个样品的20000个细胞进行分析，并测量染料的中等强度。

JB得到了第七届欧洲共同体框架计划内玛丽·居里欧洲内部研究金的支持。这项工作得到了英国癌症研究计划对KMB的资助（C197/A3514）。我们感谢剑桥研究所设备园、显微镜和流式细胞仪设施的协助；Mike P.Murphy博士负责提供MitoQ试剂，Pedro Perez-Mancera博士负责提供MEF。