SK2-长等值线指导突触定位和含SK2-通道的功能

SK2在SK2-Sonly CA1神经元的PSD中缺失

为了研究SK2-L亚型的生理作用，产生了选择性缺乏SK2-L表达的转基因小鼠。我们之前报道过两种不同的SK2转基因等位基因。一个是Cre-lox条件等位基因(图2a)用来制造库存2^−/−老鼠²⁰另一个等位基因包含四环素调节基因开关²¹插入SK2-S的翻译起始密码子的5'位置，但位于SK2-L的扩展N末端编码序列内(吨等位基因；图2b)¹⁵为了获得选择性缺乏SK2-L表达的小鼠，库存2^+/T型小鼠与SK2型^−/+小鼠和库存2^−/吨(SK2-索尼)对小鼠进行了鉴定。在SK2-索尼小鼠，SK2亚型均不表达于空等位基因，SK2-L不表达于吨等位基因，SK2-S在吨等位基因¹⁵.脑蛋白的Western blot分析证实SK2-索尼小鼠缺乏SK2-L表达，而SK2-S过度表达约4倍(图2c;补充图S2).

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图2

库存2基因座和蛋白质印迹

(一)鼠标的5'区域库存2基因。方框代表外显子。SK2-L和SK2-S的翻译起始剂蛋氨酸（Met）密码子的位置如虚线所示。最长SK2-L cDNA的5'端位于外显子A内，而SK2-S mRNA的CAP位点位于外显字1内。阴影区域表示驱动SK2-L和SK2-S表达的启动子的位置。外显子-内显子镶嵌图上方的线表示SK2-L和SK2-S的转录本。三角形表示LoxP公司中的站点絮状SK2等位基因。(b条)老鼠SK2吨等位基因。的位置tet基因开关在SK2-S启动器Met的SK2-S 5'未翻译区域5'中指示。SK2-L转录本在插入的tet磁带，取消SK2-L表达。SK2-S启动子驱动四环素反式激活因子（tTA）mRNA的表达。tTA蛋白与Tet操作员序列位于tet磁带并启用来自最小巨细胞病毒启动子. (c（c）)野生型海马蛋白的Western blot检测SK2，SK2-索尼、和库存2^−/−使用SK2-L抗体（顶部印迹）和pan-SK2抗体（底部印迹）的小鼠。

为了确定SK2在有无SK2-L的情况下在脊椎中的分布，用指向细胞内C末端结构域的pan-SK2抗体进行包埋后iEM¹¹在野生型脊髓中，SK2在突触外和突触膜中表达。在71个共有278个金颗粒的棘中，47%（130）是突触外的，53%（140）位于PSD(图3a). 相反，在SK2-索尼小鼠树突状棘突触外质膜中表达SK2-S，而PSD中几乎没有SK2-S。SK2-S共含有167个金颗粒的82个棘中，98%（164）位于突触外棘膜，而2%（3）的金颗粒位于PSD(图3b).

这些结果通过SDS-FRL iEM得到了证实和扩展。与PSD-95和SK2-L的混合金颗粒相比(图1c)或PSD-95和盘SK2-S(图3c)在野生型脊椎中，来自SK2-索尼PSD-95和SK2双重标记的小鼠显示出两种免疫颗粒的分离(图3d). 通过测量每个SK2金颗粒到最近的PSD-95金颗粒的距离，对SDS-FRL结果进行量化(图3e). 因此，在没有SK2-L表达的情况下，含有SK2-S的通道被排除在PSD之外。

Synaptic SK2-包含通道功能需要SK2-L

这些结果表明，SK2突触功能在SK2-L表达缺失的情况下会丧失。为了首先确定SK2-S通道在SK2-L缺失的情况下是否在功能上表达，我们在全细胞电压钳中使用了体细胞阶跃去极化，激活了野生型CA1锥体神经元中apamin敏感的SK电流^14,20,22.在去极化至20 mV后，产生未捕获的Ca²⁺电流，使膜复极为−55 mV诱发的尾电流，apamin（100 nM）可部分降低尾电流。减去施用磷脂酶前后记录的痕迹，得到磷脂酶敏感电流，I_斯克(图4a). 在复极100 ms后测量的apamin敏感性尾电流SK2-索尼（357±127 pA，n=7）大于野生型窝友记录的磷脂酶敏感电流（95±15 pA，n=21；P<0.05吨等位基因SK2索尼老鼠。为了确定SK2-L的表达是否进一步促进SK尾电流，SK2-L在SK2-索尼通过经颅输送重组腺相关病毒（rAAV）指导SK2-L和GFP的分离表达的小鼠(图4b). 根据SK2-索尼非荧光的(SK2-索尼英寸。控制）电池或荧光灯(SK2-索尼注射。绿色）细胞和CA1锥体神经元。对于SK2-索尼注射细胞，或者是crtl。或绿色，与野生型相比（P<0.05），反映SK2-S过度表达。然而，与SK2-索尼非注射细胞，与SK2-索尼英寸。控制。单元格和SK2-索尼注射。绿色单元格(SK2-索尼注射。控制：293±106 pA，n=10；SK2-索尼注射。绿色：300±68 pA，n=11；图4c). 因此，SK2-L在SK2-索尼小鼠没有增加SK尾电流振幅。这些数据扩展了我们先前的发现，即SK2的表达对于CA1锥体神经元的apamin敏感性尾电流是必要的²⁰并且表明含有SK2-S的通道对于其表达是足够的。

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图4

含有SK2的通道表达于SK2-索尼CA1锥体神经元

（a） top：用于触发尾电流的电压协议。将细胞电压钳制在−55 mV，在200 ms去极化至20 mV后引出尾电流；底部：野生型CA1神经元在施用磷蛋白之前（黑色痕迹）和之后（灰色痕迹）的代表性尾电流。插图显示了减去的apamin敏感电流。(b条)海马体切片SK2-索尼注射rAAV的小鼠分别表达GFP和SK2-L(c（c）)上图：野生型的代表性磷脂酶敏感电流（左），SK2-索尼注射。控制。（中间），和SK2-索尼注射。绿色（左）CA1锥体神经元；底部：总结图显示，磷脂酶敏感电流（I_斯克)用于三组神经元。误差条表示s.e.m.*野生型与SK2-索尼注射。控制。或SK2-索尼注射。绿色。

为了确定SK2突触功能是否在SK2-L表达缺失的情况下丧失，在注射rAAV的脑切片中应用阿帕明前后，从CA1锥体神经元记录突触诱发的EPSPSK2-索尼老鼠或野生型室友。每30秒通过刺激Schaffer侧支轴突诱发一次EPSP。在稳定的基线记录10分钟后，添加apamin（100 nM），并在18–20分钟后测量EPSP振幅。如前所述，apamin使野生型小鼠CA1锥体神经元的EPSP增加了58±12%（n=8）¹²相反，阿帕明不影响从SK2-索尼注射。控制。CA1锥体神经元（5±6%，n=10；图5a、b). 然而，阿帕明增加了EPSPSK2-索尼注射。绿色CA1锥体神经元的数量与野生型CA1锥面神经元的数量相同（44±14%；n=10；图5a、b). 这些结果表明，SK2-L是CA1锥体神经元SK通道突触功能所必需的。

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图5

SK2-L的再表达重新表达apamin对突触诱发的谷氨酸能EPSP的敏感性

(一)野生型应用阿帕明前后归一化EPSP振幅的时间进程（平均值±s.e.m.）（左），SK2-索尼注射。控制。（中间），和SK2-索尼注射。绿色（右）CA1锥体神经元。插图显示了20个EPSP的代表性平均值，平均值±s.e.m.（阴影区），取自施用阿帕明之前（黑线；左侧）和之后（红线；右侧）的对照条件下指示的阴影时间点。(b条)阿帕明应用后EPSP增加的条形图。误差线表示标准误差*P<0.05SK2-索尼英寸。控制。和SK2-索尼注射。绿色与野生型相比。

SK通道活性不影响SK2-Sonly小鼠的LTP

在野生型小鼠脑片上应用Apamin有助于在对Schaffer侧支轴突的条件刺激下诱导CA1区的突触可塑性¹⁴为了确定在缺乏突触SK2通道的情况下，apamin是否改变LTP，将θ突发刺激（TBS）传递给Schaffer侧支轴突，在野生型和非野生型海马脑片上分别施加或不施加apamin（100 nM）SK2-索尼老鼠。

对于对照浴溶液中的野生型切片，TBS诱导LTP，使场EPSP（fEPSP）斜率增加34±4%（n=12；P<0.05）。对于apamin的野生型切片，TBS诱导的LTP增强，fEPSP斜率增加59±4%（n=7；P<0.05；图6a). 在SK2-索尼切片TBS诱导LTP的程度与野生型切片相同，fEPSP增加40±3%（n=8），但与阿帕明诱导的LTP无差异（47±3%，n=7；图6b、c). 因此，阿帕明对野生型LTP的影响在SK2-索尼老鼠。

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图6

SK通道活性影响野生型LTP，但不影响SK2-索尼老鼠

记录海马脑片CA1区的场电位。(一)在Schaffer侧支轴突的野生型刺激中，阿帕明（填充圆圈）的存在比对照浴溶液（开放圆圈）诱导的LTP更多；(b条)：LTP与使用（填充圆圈）或不使用（开放圆圈）阿帕明在SK2-索尼片。刺激后50–60分钟测量LTP（黑色条）。(c（c）)所示组的LTP汇总图。误差线表示标准误差*P<0.05。

抗体

分别在家兔和豚鼠中培养了两种亲和纯化的抗SK2多克隆抗体。豚鼠pan-SK2抗体的特异性已在其他地方进行过描述¹¹从Abcam中获得抗PSD-95的小鼠单克隆抗体。

免疫电子显微镜

如前所述，对EM包埋前后进行免疫组织化学反应²⁷在Jeol-1010电子显微镜下进行超微结构分析。

预包埋免疫金

简单地说，在室温下，将自由漂浮的切片放入稀释在Tris缓冲盐水（TBS）中的10%NGS（正常山羊血清）中培养1小时。然后，将切片在稀释于1%NGS（正常山羊血清）/TBS中的抗泛SK2或抗SK2-L抗体（1-2µg/ml）中孵育48小时。在TBS中洗涤后，将切片在与胶体金颗粒（Nanoporobes Inc.）偶联的山羊抗兔IgG或山羊抗豚鼠IgG中孵育3小时，胶体金颗粒在稀释于1%NGS/TBS中的比例为1:100。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗后，将切片后固定在同一缓冲液中稀释的1%戊二醛中10分钟，在双蒸馏水中清洗，然后使用HQ银试剂盒（Nanoprobes Inc.）对金颗粒进行银增强。然后用四氧化锇（0.1 M PB中的1%）处理切片，用乙酸铀酰块染色，用分级系列乙醇脱水，并用Durcupan（Fluka）树脂平埋在玻片上。在超切片机（Reichert Ultracut E）上在70-90 nm处切割感兴趣区域，并在200米镍网格上收集。对1%醋酸铀酰水溶液滴加雷诺兹柠檬酸铅进行染色。

包埋后免疫金

从Lowicryl嵌段海马体中提取80nm厚的超薄切片，放置在镀镍网格上，并在含有2%人血清白蛋白（HSA）的封闭溶液滴于0.05 M TBS和0.03%Triton X-100（TBST）中培养45分钟。将格栅与pan-SK2或SK2-L抗体（10µg/ml）在28°C、含2%HSA的TBST中培养过夜。清洗后，将网格放置在与胶体金颗粒（Nanoprobes Inc.）结合的山羊抗豚鼠IgG或山羊抗豚鼠-IgG滴液上培养3小时，胶体金颗粒在2%HSA和0.5%聚乙二醇中以1:80稀释。然后在TBS中清洗格栅30分钟，并用饱和水乙酸铀酰水溶液和柠檬酸铅进行EM复染。

SDS-FRL公司

根据Fujimoto进行SDS-FRL²⁸进行了一些修改。用戊巴比妥钠麻醉动物，并在0.1 M磷酸钠缓冲液中用甲醛（0.5%；刚从多聚甲醛中解聚）经心灌注。灌注后，取下大脑。使用Microslicer（Dosaka）将海马切成120µm厚的切片，并用PBS中的32%甘油冷冻保护12-16小时。然后用高压冷冻机（HPM 010；Bal-Tec）冷冻切片，并在冷冻蚀刻系统（BAF 060；Bal-Tec）中用双复制法进行断裂。用碳（5 nm）和电子束枪从头顶上复制断裂面，用铂/碳以25°角（2.5 nm）或45°角（2 nm）单向定位，然后从头顶上施加碳（20 nm）。我们在铂之前使用5 nm的碳来提高检测效率。将复制品块转移到含有62.5 mM Tris和10%甘油（pH 6.8）的2.5%SDS中。SDS处理在105°C高压灭菌15分钟，80°C摇晃16小时，或30°C剧烈搅拌16小时。用SDS处理后，在TBS中用0.1%BSA的三种变化清洗复制品，并封闭1小时，其中两种变化为5%BSA/TBS。然后将复制品与抗泛SK2或抗SK2-L与PSD-95单克隆抗体的混合物在室温下反应1小时，然后在4°C下反应36–48小时。在TBS中0.1%BSA中洗涤三次，并在5%BSA/TBS中封闭，复制品在二级抗体（山羊抗豚鼠IgG和山羊抗小鼠IgG与金颗粒偶联的抗体（英国生物细胞国际）的混合物中在室温下培养1小时，然后在4°C下培养12–16小时。当省略一个一级抗体时，没有观察到省略的一级抗体的免疫反应。免疫金标记后，立即用0.1%BSA/TBS冲洗复制品三次，用蒸馏水冲洗两次，然后将复制品收集到涂有吡氯仿的网格上（琼脂科学）。

蛋白质斑点

海马膜由成年野生型、，SK2-索尼、和库存2^−/−之前报道的小鼠¹⁹.用SDS-PAGE分离40微克蛋白质并转移到硝化纤维素膜上。用pan anti-SK2（3µg/ml）或anti-SK2-L（1µg/ml）对膜进行探测。使用Supersignal West Pico化学发光ECL（Thermo Scientific）在1:20000下应用抗兔HRP第二抗体（Promega）后，观察蛋白带。

病毒注射

用异氟醚麻醉3至4周大的动物，将其固定在Kopf立体定向对准系统中，并注射0.2µl病毒溶液（2×10¹⁰vg/ml），用五味立体定向注射器（Stoelting）靶向海马2-6个部位。手术后14天以上进行记录。

切片准备

如前所述，从6-10周龄C57BL/6J小鼠制备海马切片^11,12将切片转移到含有人工脑脊液（aCSF）（单位：mM）的保存室中：125 NaCl，2.5 KCl，21.5 NaHCO_三，1.25 NaH₂人事军官₄，2.0氯化钙₂，1.0氯化镁₂，15葡萄糖，与碳平衡。在进行记录之前，将切片在34°C下培养30分钟，然后在室温下培养≥1小时。

电生理学

如前所述，从CA1锥体细胞获得全细胞斑贴灯记录^11,12将贴片吸管（开放式吸管电阻，2–4 MΩ）充满含有（mM）：130 K-葡萄糖酸盐、8 NaCl、1 MgCl的溶液₂、10个HEPES、4个ATP、0.3 GTP和10个磷酸肌酸，pH 7.26。在电压钳中，串联电阻被补偿到>80%。对于电流钳，串联电阻没有进行电子补偿，实验期间串联电阻变化超过20%的记录被丢弃。所有记录均来自静息膜电位介于−70和−50 mV之间且输入电阻稳定的细胞。施加偏置电流以保持电流钳中的膜电位为−60 mV。所有全细胞记录均在室温下进行。

现场记录

如前所述，记录细胞外场电位（fEPSP）^14,15LTP由θ突发刺激（TBS）方案诱导，该方案由5Hz下的10个θ突发组成；每个θ脉冲包含4到5个100 Hz的脉冲。测量fEPSP的初始斜率以监测突触传递的强度，最大限度地减少电压依赖性事件的污染。根据10分钟基线上所有点的平均值，对每个实验进行归一化处理，得到总结图。在30–32°C下进行现场记录。

突触刺激

装有aCSF的毛细管玻璃移液管，针尖直径为1-2µm，连接至2200型刺激隔离装置（全细胞记录；a–m系统）和Digitimer DS3刺激分离装置（现场记录；Automate Scientific）。存在SR95531（2µM）和CGP55845（1µM_一和GABA_B类捐款。为了防止在GABA能阻滞剂存在的情况下发生癫痫放电，在记录之前对CA3区进行了显微解剖。

数据分析

使用IGOR（WaveMetrics）分析数据。非参数Wilcoxon-Mann-Whitney双样本秩检验或配对双样本t吨-测试用于确定数据的显著性；P<0.05为显著性。

化学制品

CGP55845和SR95531来自Tocris Cookson。Apamin来自Calbiochem。

行为测试

在开始行为测试之前，所有小鼠均已适应实验室环境。

自发的新目标识别

如前所述¹⁴，在取样过程中，每只老鼠在熟悉的白色ABS竞技场（37.5 cm×37.5 cm x 50.8 cm高）探索两个新玩具。在累计19秒的样本物体探索后，将小鼠移出竞技场；任何未能在10分钟内达到编码标准的小鼠都将被从研究中剔除。在24小时后的测试过程中，每只老鼠被送回竞技场进行5分钟的训练，竞技场中包含了一个来自样本训练的物体和一个新的物体。在样本会话中使用数字秒表记录对象探索，在测试会话中使用Ethovision XT（弗吉尼亚州Leesburg）手动事件编码器记录对象探索。探索被定义为头部朝向物体并在2–3 cm范围内花费的时间积累样本对象探索的延迟，定义为每个鼠标在采样会话期间达到编码标准所用的时间（秒）；和新对象偏好比，定义为探索新对象的时间除以探索两个测试会话对象的总时间。

莫里斯水迷宫

用EthoVision XT视频跟踪系统记录小鼠行为。如前所述¹⁴，小鼠接受6天的隐蔽平台训练（4次试验/天），了解一个透明Plexiglas平台（直径8厘米）的位置，该平台位于水池表面以下1厘米处（高60厘米，直径109厘米）。游泳池周围有大量可见的线索。小鼠在平台上停留30秒，然后被放置在一个保持笼中，间隔45秒进行试验。为了检测空间记忆保留，小鼠在4分钟后接受了30秒探针测试^第个, 12^第个和20^第个训练试验期间，平台被从游泳池中移除。每个泳池象限的停留百分比为每只小鼠确定搜索比率根据探针测试行为计算出平台位置周围直径为23.8cm的圆形区域的穿越次数，除以四个等效区域的穿越总数（在四个水池象限中的每个象限中）。期间可视化平台培训（6次试验/天），每只小鼠游到一个黑色Plexiglas平台（直径13厘米），该平台位于水面上方，每次试验都是随机设置的位置。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款NS038880（JPA）和MH081860-01（JM）、F32MH080480（MTL）、MH0876591-01和国家科学基金拨款IBN 0630522（RWS）的支持，以及西班牙教育和科学部的拨款（CONSOLIDER CSD2008-00005），以及西班牙皇家科学院（PAI08-0174-6967）对R.L.的拨款。特别感谢Kyle Vick、Christina Christakis和Kristine Smith（均来自FSU）在行为测试方面的专家协助。