分子生物学代表。作者手稿；PMC 2012年10月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理3402037
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院389958
肌氨酸诱导雄激素依赖性前列腺癌细胞HER2/neu表达增加
,1,* ,1 ,2 ,2 ,三和1,4
马林·达尔
1丹麦科赫市科赫医院哥本哈根大学临床生物化学研究部癌症和分子成像室
皮埃尔·布切洛切
1丹麦科赫市科赫医院哥本哈根大学临床生物化学研究部癌症和分子成像室
加布里埃拉·克拉默·马雷克
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国立癌症研究所癌症研究中心放射肿瘤学分院分子靶向科
杰克·卡帕拉
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心放射肿瘤科分子靶向科
Kirsten Bouchelouche先生
1丹麦科赫市科赫医院哥本哈根大学临床生物化学研究部癌症和分子成像室
4PET和回旋加速器装置，Rigshospitalet，哥本哈根大学，丹麦哥本哈根
1丹麦科赫市科赫医院哥本哈根大学临床生物化学研究部癌症和分子成像室
2美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心放射肿瘤科分子靶向科
三丹麦赫列夫哥本哈根大学赫列夫医院泌尿外科
4丹麦哥本哈根大学Rigshospitalet PET和回旋加速器单元
*通讯作者：Malin Dahl，博士，哥本哈根临床生物化学大学研究部化学工程与分子成像硕士，丹麦科赫医院，DK-4600科赫；电话：+45 4732 5546；传真：+45 5663 3850，kd.dnalleajsnoiger@adjm 摘要
越来越多的证据表明，人类表皮生长因子受体2（HER2/neu）参与前列腺癌的进展。最近，据报道，肌氨酸在前列腺癌进展过程中高度增加，外源性肌氨酸可诱导良性前列腺上皮细胞的侵袭性表型。本研究的目的是研究肌氨酸对前列腺癌细胞株LNCaP（雄激素依赖性）、PC-3和DU145（均为雄激素非依赖性）HER2/neu表达的影响。
使用RT-qPCR测定HER2/neu和雄激素受体（AR）转录物的相对量。通过Western blot（WB）证实HER2/neu的总表达。用HER2/neu特异性荧光探针通过共焦显微镜观察活LNCaP细胞表面的HER2/neu蛋白。LNCaP细胞暴露于50μM肌氨酸24小时后，HER2/neu mRNA水平增加58%（p<0.001），表明肌氨酸在转录水平上影响HER2/neu的表达。用肌氨酸异构体丙氨酸进行的对照实验表明，对HER2/neu转录没有显著影响。WB和共聚焦显微镜显示，暴露于肌氨酸48小时后，HER2/neu mRNA的上调先于蛋白质水平的相应增加。有趣的是，肌氨酸对HER2/neu的活化（磷酸化）形式没有影响。暴露于肌氨酸后，AR表达无明显变化。这是第一份表明肌氨酸参与调节癌蛋白HER2/neu的报告。因此，肌氨酸可能通过增加HER2/neu的表达而诱导前列腺癌的进展。然而，有关细胞机制的详细信息仍有待阐明。
关键词：HER2/neu、LNCaP、前列腺癌、肌氨酸
简介
人表皮生长因子受体2（HER2/neu或HER2）是一种酪氨酸激酶受体，在多种癌症中是一种有效的癌蛋白，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和膀胱癌。HER2/neu蛋白的过度表达和HER2/neu基因的扩增与肿瘤的发展和进展有关，并与几种癌症的不良预后有关[1,2]. HER2/neu能够激活核因子κ-β（NF-κB）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路[三]，导致乳腺癌细胞的侵袭和增殖发生变化。越来越多的证据表明HER2/neu也参与前列腺癌[4,5,6,7,8]. 最近，Minner等人在一项大型研究中证明，前列腺癌中HER2/neu的表达水平是可变的，HER2/neu表达水平的增加与不良肿瘤表型、肿瘤细胞快速增殖和预后不良有关[6]. 此外，术前血浆HER2/neu水平与前列腺癌根治术后的进展相关，并预测化疗后的不良预后[9]. 然而，HER2/neu下游的通路并没有很好的特征，但最近已经证明NF-κB和PI3K也参与前列腺癌HER2/neu信号传导[5].
最近，Sreekumar等人证明了肌氨酸,一种氨基酸甘氨酸的N-甲基衍生物，是一种差异代谢物，在前列腺癌向转移的发展过程中，这种代谢物似乎高度增加[10]. 此外，作者证明，添加外源性肌氨酸或击倒导致肌氨酸降解的酶，即肌氨酸脱氢酶，会在良性前列腺上皮细胞中诱导侵袭性表型。尽管肌氨酸被认为是参与癌症进展的潜在重要代谢介质，但其下游细胞信号导致侵袭性增加的研究尚未展开。
对侵袭性癌症（包括前列腺癌）HER2/neu的认识不断增长[4]，以及最近提出的肌氨酸在前列腺癌进展中的作用[10]促使我们研究雄激素依赖性（LNCaP）和雄激素非依赖性（PC3和DU145）前列腺癌细胞中肌氨酸和HER2/neu表达之间的可能关系。
材料和方法
细胞培养和实验装置
前列腺癌细胞系LNCaP、PC3和DU145来自美国类型培养物收集中心（ATCC，Rockville，MD）。培养基由补充有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen，Carlsbad，CA）、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基组成（该培养基称为生长培养基）。细胞在6孔板中生长至70-80%的汇合处，在饥饿培养基中饥饿24小时[生长培养基中用0.1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma）和100 ng/ml表皮生长因子（EGF，Invitrogen，Carlsbad，CA）替换FBS]，并暴露于50μM肌氨酸[10]将肌氨酸类似物丙氨酸（50μM）作为对照。为了进行显微镜观察和图像采集，细胞生长在35-mm的IbiTreat培养皿中（Ibidi GmbH，Martinsried，德国），培养皿盖滑动式底部。如果处理时间超过24小时，则每24小时向细胞中添加一次新鲜的含有肌氨酸的饥饿培养基。对于所研究的每种条件，处理细胞和对照细胞均在两个或三个重复的微孔中生长，整个实验至少进行三次。这些数字是使用Adobe Photoshop制作的。
逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）
总RNA通过RNeasy Miniprep Kit（德国希尔登QIAGEN GmbH）纯化，其浓度通过测量紫外线吸收测定。含A的RNA制剂260/280>1.8用于进一步PCR分析。转换为cDNA（Affinity Script™Master Mix Kit，Stratagene，La Jolla，CA）后，以下PCR引物对用于相对定量PCR（Brilliant®SYBR公司®Green QPCR master Mix Kit，加利福尼亚州拉霍拉市斯特拉赫尼）：HER2/neu：正向5'-CAGCAGGCTTCTTCTGT-3'，反向5'-TCCAGCCCTAGTGTCAGGTC-3'；应收账：前进5'-TACAGCTCACCAGCTCCT-3'，后退5'-AAAGTCCACGCTCACCATT-3'；和β-肌动蛋白：向前5'-ACTCTTCCAGCCTCCCCTTCCC-3'，反向5'-AGCACTGTGGCGTACAG-3’（TAGC哥本哈根A/S，丹麦）。所有引物均使用Primer 3设计，并由TAGC Copenhagen A/S（丹麦哥本哈根）合成。PCR使用热循环器（Mx3000P QPCR系统，加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫尼）和MxPro™QPCR软件进行。每个样本中HER2/neu和AR转录物的相对数量使用标准曲线法并通过归一化β-actin mRNA表达水平来确定，如别处所述[11]. 在肌氨酸治疗的整个实验中，发现参考基因β-actin稳定表达。
蛋白质提取和蛋白质印迹分析
刮取并收获细胞（500 g，持续5分钟），用PBS清洗一次，并在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液（Sigma）中溶解（德国曼海姆罗氏诊断有限公司Complete Mini）。通过离心（10000 g，持续20分钟）去除细胞碎片，并通过Bio-Rad蛋白质测定（加州大力士BioRad）测定总蛋白浓度。将70μg总蛋白提取物加载到4–12%梯度聚丙烯酰胺凝胶上，并使用XCell对分离的蛋白质进行印迹单频激光器™微型电池系统（加利福尼亚州拉霍亚市英维特罗根），符合制造商指南。将参考蛋白β-肌动蛋白的印迹用作负荷控制。简言之，用PBS-T中5%的脱脂干乳（PBS含有0.05%吐温-20）封闭膜，然后在4°C下过夜，在封闭缓冲液中用以下主要抗体（均来自加州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）进行探测：抗HER2/neu（C-18；1μg/ml）、抗磷-HER2/neu和抗β-肌动蛋白（ACTBD11B7；1μg/ml）。使用二级抗体（抗兔HRP或抗鼠HRP；1:10000；加州Hercules BioRad）和增强化学发光检测系统（SuperSignal®West Pico，Pierce Biotechnology，Inc.，伊利诺伊州罗克福德）和MultiGauge软件。
共焦显微镜下的活细胞成像
用50μg/ml HER2/neu特异性荧光亲和探针Z（HER2）-红色探测细胞表面上显示的HER2/neu分子[12]室温下，在RPMI 1640介质（无酚红）中放置30分钟。在图像采集过程中（每个培养皿<30分钟），使用带有HCX PL APO CS 63×/1.4油物镜的Leica TCS SP5共焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems CMS GmbH，Mannheim，Germany）进行图像采集，去除未结合的仿射探针，并将活细胞保存在RPMI 1640培养基（不含酚红）中。SYTO13（Invitrogen，La Jolla，CA）用于细胞核的复染。收集细胞的差异干涉对比（DIC）图像，检查细胞形态。使用LAS AF软件（Leica Microsystems CMS GmbH，Mannheim，Germany）和Adobe Photoshop处理采集的图像进行显示。
结果
肌氨酸对LNCaP细胞HER2/neu mRNA水平的影响
首先，我们评估了增加肌氨酸浓度对培养24小时的LNCaP细胞中HER2/neu表达的影响，如LNCaP细胞暴露于25、50和100μM肌氨酸后，HER2/neu mRNA呈剂量依赖性上调，50μM组的上调效果最强。因此，该浓度用于以下实验。丙氨酸是肌氨酸的一种异构体，用作对照。如图所示丙氨酸对HER2/neu mRNA水平无明显影响。
肌氨酸对前列腺癌细胞HER2/neu mRNA相对水平的影响。（a） LNCaP细胞暴露于25-100μM肌氨酸或50μM丙氨酸24小时；（b） 将雄激素依赖型（LNCaP）和雄激素依赖性（PC-3和DU145）暴露于50μM肌氨酸24小时。黑色、灰色和白色条分别代表不添加肌氨酸、肌氨酸和丙氨酸的对照实验。显示了至少三个独立实验的平均值。错误条显示SD，星号表示明显的折叠变化(P（P）<0.001，由学生的t检验确定）
肌氨酸对其他前列腺癌细胞株HER2/neu mRNA水平的影响
为了确定肌氨酸是否与其他前列腺癌细胞株相关，我们用50μM肌氨酸培养了两个雄激素非依赖性细胞株PC-3和DU145，并与LNCaP细胞进行了比较。LNCaP细胞与肌氨酸孵育后，LNCaP细胞中HER2/neu表达显著增加（p<0.001）。LNCaP细胞暴露于50μM肌氨酸24小时导致HER2/neu mRNA相对水平增加58%()表明肌氨酸在转录水平上影响HER2/neu的表达。相反，在两个雄激素非依赖性细胞系PC-3和DU145中，未观察到HER2/neu mRNA相对表达的显著变化().
肌氨酸对LNCaP细胞HER2/neu蛋白表达和磷酸化的影响
用50μM肌氨酸处理LNCaP细胞48和72小时后，HER2/neu蛋白表达量增加(). 如Western blot所示，HER2 mRNA的上调先于蛋白质水平的相应增加(). 加载控制β-肌动蛋白的带强度在采样点之间似乎不同(). 然而，每个实验（分别在24、48或72小时后的对照细胞和处理细胞）中β-肌动蛋白的表达是稳定的。接下来，为了研究肌氨酸是否也激活HER2/neu受体，我们使用Western blot在肌氨酸处理的LNCaP中寻找其磷酸化形式HER2/neu-P的存在。与肌氨酸治疗48小时后发现的HER2/neu显著上调相反，无论是治疗6小时还是48小时后，HER2/neu-P均未出现这种情况().
肌氨酸对LNCaP细胞HER2/neu蛋白表达和磷酸化的影响。肌氨酸（50μM）处理48和72小时后，LNCaP细胞HER2/neu蛋白表达上调（a）。这些数字表示HER2/neu蛋白带的检测强度的相对增加。磷酸化形式HER2/neu-P没有增加（b）。50μM肌氨酸暴露6、24、48或72小时后LNCaP总蛋白提取物的Western blot分析；±S分别表示肌氨酸和对照细胞的添加
HER/neu受体在LNCaP细胞中的膜定位及肌氨酸的作用
用共焦显微镜观察HER2/neu在活细胞上的总表达。用红色荧光亲和探针标记活LNCaP细胞表面的HER2/neu分子并采集图像。肌苷治疗48小时后，活LNCaP细胞表面HER2/neu的存在似乎更为明显。在72小时暴露后也观察到了这种影响().
HER2/neu在活LNCaP细胞表面的表达。用50μg/ml的Z（HER2）-红检测（a）48和（b）72 h肌氨酸处理后活细胞表面的HER2/neu细胞外部分[10]（红色）；箭头表示HER2/neu-bound探针局部增加。比例尺=20μm。显示了五个独立实验的代表性图像
肌氨酸对LNCaP细胞雄激素受体表达的影响
最后，我们评估了肌氨酸对雄激素依赖性LNCaP细胞中雄激素受体（AR）表达的影响。通过RT-qPCR和Western blot判断，暴露于肌氨酸24或48小时对AR或HER2/neu mRNA均无明显影响(）。此外，将LNCaP细胞与比卡鲁胺（一种纯非甾体类抗雄激素原，通过与AR结合阻止其激活）孵育，对肌氨酸调节HER2/neu表达没有影响（数据未显示）。
肌氨酸对LNCaP细胞雄激素受体（AR）的表达没有明显影响。（a） 肌苷治疗24和48小时后LNCaP细胞中AR mRNA的相对水平。黑色和灰色条分别表示控制细胞和处理细胞。显示了至少三个独立实验的平均值；误差条显示SD；（b） 肌苷作用24和48小时LNCaP细胞全细胞提取物的Western blot分析
讨论
在这项研究中，我们研究了肌氨酸和HER2/neu表达在前列腺癌进展中的可能联系。为了模拟从局部前列腺癌向转移性前列腺癌的转化，我们使用LNCaP细胞系作为雄激素依赖性前列腺癌模型[13,14]. 该实验由另外两种前列腺癌细胞系（即雄激素依赖细胞系PC-3和DU145）补充。我们发现，经RT-qPCR、Western blot和共聚焦显微镜分析，暴露于肌氨酸的LNCaP细胞在转录水平和表达蛋白上均显示HER2/neu显著上调。所使用的技术提供了相关结果，支持肌氨酸可能参与HER2/neu途径触发前列腺癌进展的观点。
在Sreekumar等人的工作中，用于细胞治疗的肌氨酸浓度设置为50μM[10]. 在暴露于这种浓度的细胞中观察到的细胞内肌氨酸浓度的增加，对应于比较良性和转移性活检时发现的肌氨酸水平的相对增加。尽管作者没有进一步解释，但对所示数字的解释使我们继续使用50μM肌氨酸，并辅以低浓度和高浓度的评估(). HER2/neu mRNA在最高浓度下的下调可能是由于细胞毒性作用。
有趣的是，雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC3和DU145在肌氨酸暴露后HER2/neu水平没有增加。这与在雄激素依赖性LNCaP细胞中获得的结果相反，表明AR在肌氨酸途径中的作用，如Sreekumar等人[10].
在我们的研究中，如Western blot分析结果所示，HER2/neu的活化，即磷酸化似乎不受肌氨酸治疗的影响。考虑到磷酸化形式的缺失可能是由于快速降解[15]我们还分析了暴露于肌氨酸6小时后的细胞样本，但在早期阶段没有发现任何影响。肌氨酸明显不能直接激活HER2/neu，这可能是由于缺乏能够直接激活该受体的配体[16,17]. 此外，使用共焦显微镜观察活LNCaP细胞证实HER2/neu表达增加；我们的研究中添加肌氨酸似乎并没有损害细胞增殖或形态，这是通过使用差异干扰对比度（DIC）检查判断的（未显示）。
Sreekumar等人证明，肌氨酸途径的激活与AR和ETS基因融合调控直接相关[10]. Berger等人证明，LNCaP细胞中HER2/neu的调节是雄激素依赖性的：在雄激素缺乏的环境中，HER2/neu上调[13]. AR和HER2/neu之间的假定连接[13]结合我们的发现，促使我们研究肌氨酸对雄激素依赖性LNCaP细胞AR表达的影响。AR表达无影响。此外，抗雄激素比卡鲁胺抑制AR并不影响HER2/neu表达的增加。因此，肌氨酸诱导雄激素依赖性前列腺细胞HER2表达增加的确切细胞机制尚待解释，目前正在研究中。
正在进行的关于肌氨酸作为前列腺癌筛查中可能的新生物标记物的讨论对Sreekumar 2009年的初步研究的前景提出了质疑[10]. 最近，Jentzmik等人重新评估了肌氨酸作为早期前列腺癌检测生物标记物的潜力[18]. 与Sreekumar等人相比，作者发现直肠指诊后尿中的肌氨酸不能作为区分前列腺癌患者和非前列腺癌患者的合适标记物[18]. 然而，这两项研究在几个层面上存在差异，这可能解释了相互矛盾的结果[19]. 此外，尽管肌氨酸被评估为前列腺癌的生物标志物，但我们关于肌氨酸对HER2/neu表达的影响的结果，以及Sreekumar研究中的发现，表明肌氨酸在前列腺癌进展中的作用。
近年来，人们一直把重点放在个性化药物上，通过个性化药物治疗，药物治疗可以根据患者的具体特点进行调整。我们的结果支持HER2/neu在前列腺癌中的作用，前列腺癌中HER2/neu表达增加是分子成像和靶向治疗的潜在靶点[20,6]. 然而，个性化药物常规用于前列腺癌还需要大量研究。
结论
我们在此报告了外源性肌氨酸暴露后雄激素依赖性前列腺癌细胞中HER2/neu的高度显著上调，表明肌氨酸可能参与HER2/neu的调节。然而，有关下游细胞机制的详细信息仍有待阐明。我们的结果与之前所建议的HER/neu在前列腺癌中的作用一致。HER2/neu表达增加可能是前列腺癌患者未来治疗策略的潜在靶点。
致谢
我们感谢Majken Madvig Jansen（丹麦Koege医院临床生物化学部癌症和分子成像科）提供的专家技术援助。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。这项工作由丹麦霍尔格·K·克里斯蒂安森基金会赞助，赠款编号：74272KB；丹麦新西兰地区基金会，批准号：1-01-83-0011-07。JC和GKM对这项工作的贡献得到了NIH、国家癌症研究所、癌症研究中心的内部研究计划的支持。
参考列表
1Slamon D，Clark G，Wong S，Levin W，Ullrich A，McGuire W。人类乳腺癌：复发和生存与HER-2/neu癌基因扩增的相关性。科学。1987;235:177–182.[公共医学][谷歌学者] 2Slamon D、Godolphin W、Jones L、Holt JA、Wong S、Keith D等。人类乳腺癌和卵巢癌中HER-2/neu原癌基因的研究。科学。1989;244:707–712.[公共医学][谷歌学者] 三。Merkhofer EC、Cogswell P、Baldwin AS。Her2激活NF-kappaB并通过涉及IKKalpha的经典途径诱导侵袭。致癌物。2010;29:1238–1248. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Carlsson J.EGFR-靶向放射性核素治疗的家族表达和意义。编辑：Stigbrand T，Carlsson J，Adamas G。靶向放射性核素肿瘤治疗。施普林格；2008年，第25-58页。[谷歌学者] 5Koumakpayi I，Le Page C，Mes-Masson A，Saad F.前列腺癌激活的ErbB/PI3K/Akt/NF-kappaB信号通路免疫组织化学分析的层次聚类和预后意义。英国癌症杂志。2010;102:1163–1173. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Minner S、Jessen B、Stiednroth L、Burandt E、Kollermann J、Mirlacher M等。低水平HER2过度表达与前列腺癌中肿瘤细胞快速增殖和预后不良相关。临床癌症研究。2010;16:1553–1560.[公共医学][谷歌学者] 7Shi Y、Brands F、Chatterjee S、Feng A、Groshen S、Schewe J等。前列腺癌中Her-2/neu的表达：与激素治疗和雄激素非依赖性疾病相关的高水平表达。乌洛尔杂志。2001;166:1514–1519.[公共医学][谷歌学者] 8Signoretti S、Montironi R、Manola J、Altimari A、Tam C、Bubley G等。人类前列腺癌中Her-2-neu的表达与雄激素非依赖性的进展。癌症研究所。2000;92:1918–1925.[公共医学][谷歌学者] 9Shariat S、Bensalah K、Karam J、Roehrborn C、Gallina A、Lotan Y等。术前血浆HER2和表皮生长因子受体在临床局限性前列腺癌患者分期和预后中的作用。临床癌症研究。2007;13:5377–5384.[公共医学][谷歌学者] 10Sreekumar A、Poisson L、Rajendiran T、Khan A、Cao Q、Yu J等。代谢组学特征描述了肌氨酸在前列腺癌进展中的潜在作用。自然。2009;457:910–915. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 发现研究不当行为 11Livak KJ，Schmittgen TD.使用实时定量PCR和2-ΔΔCT方法。方法。2001;25:402–408.[公共医学][谷歌学者] 12Lyakhov I、Zielinski R、Kuban M、Kramer-Marek G、Fisher R、Chertov O等。HER2和EGFR-特异性亲和探针：用于细胞成像的新型重组光学探针。化学生物化学。2009;10:1–7. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13.Berger R、Lin DI、Nieto M、Sicinska E、Garraway LA、Adams H等。前列腺癌细胞中Her-2/neu的雄激素依赖性调节。癌症研究。2006;66:5723–5728.[公共医学][谷歌学者] 14Horoszewics J、Leong S、Kawinski E、Karr J、Rosenthal H、Chu T等。人类前列腺癌LNCaP模型。癌症研究。1983;43:1809–1818.[公共医学][谷歌学者] 15Cai C，Portnoy D，Wang H，Jiang X，Chen S，Balk S。前列腺癌细胞中雄激素受体的表达受到表皮生长因子受体和ErbB2的激活的抑制。癌症研究。2009;69:5202–5209. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Rubin I，Yarden Y。HER2的基本生物学。Ann Onc公司。2001;12：S3–S8。[公共医学][谷歌学者] 17Shepard H，Brdlik C，Schreiber H.信号整合：了解针对人类EGFR家族的治疗药物疗效的框架。临床研究杂志。2008;118:3574–3581. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Jentzmik F、Stephan C、Miller K、Schrader M、Erbersdobler A、Kristiansen G、Lein M、Jung K。数字直肠检查失败后尿中的肌氨酸作为前列腺癌检测和侵袭性肿瘤识别的标志物。当前运营成本。2010正在印刷中。[公共医学][谷歌学者] 19Schalken J.尿肌氨酸对鉴别前列腺癌患者有用吗？生物标记物开发的试验和磨难。当前运营成本。2010正在印刷中。[公共医学][谷歌学者] 20Bouchelouche K，Capala J.“影像与治疗”：泌尿系肿瘤的个体化治疗方法。当前运营成本。2010新闻界。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
