表观遗传学。2010年8月16日；5(6): 527–538.
正常成人躯体组织中CpG岛的组织特异性DNA甲基化区分神经组织和非神经组织
,1 ,2 ,三 ,4 ,5和
1 斯里莫耶·戈什
1癌症遗传学系；罗斯韦尔公园癌症研究所；美国纽约州布法罗
艾伦·J·耶茨
2病理科；俄亥俄州立大学；美国俄亥俄州哥伦布
迈克尔·C·弗鲁瓦尔德
三儿童血液肿瘤科；蒙斯特大学儿童医院；德国蒙斯特
杰弗里·米奇尼科夫斯基
4生物统计系；纽约州立大学水牛城分校；美国纽约州布法罗
克里斯托夫·普拉斯
5表观基因组学与癌症危险因素司；德国癌症研究中心；德国海德堡
多米尼克·J·史密拉格里亚
1癌症遗传学系；罗斯韦尔公园癌症研究所；美国纽约州布法罗
1癌症遗传学系；罗斯韦尔公园癌症研究所；美国纽约州布法罗
2病理科；俄亥俄州立大学；美国俄亥俄州哥伦布
三儿童血液肿瘤科；明斯特大学儿童医院；德国蒙斯特
4生物统计系；纽约州立大学布法罗分校；美国纽约州布法罗
5表观基因组学与癌症危险因素司；德国癌症研究中心；德国海德堡
通讯作者。 收到日期：2010年3月29日；2010年5月4日接受。
- 补充资料
补充图表
GUID:D424D1B9-CEFC-49D1-92DC-69FE5F506048
摘要
虽然大多数CpG岛通常被认为在所有成年体细胞组织中保持非甲基化，但最近的全基因组方法发现，一些CpG岛屿在各种组织中具有不同的甲基化模式，生殖细胞和体细胞组织之间存在最大差异。很少有研究在人体体组织中解决这一问题，而对来自多个个体的同一组组织进行研究的研究更少。在当前的研究中，我们使用限制性地标基因组扫描研究了从多个个体收集的12个人体组织中的组织特异性甲基化模式。我们在这些组织中鉴定了34个不同甲基化的CpG岛，其中许多在多个个体中表现出一致的模式。特别令人感兴趣的是CpG岛甲基化的显著差异，不仅在大脑区域之间，而且在同一区域的白质和灰质之间。这些发现通过亚硫酸氢盐定量测序对选定的位点进行了确认。RLGS数据的聚类分析表明，几个组织聚集在一起，但最强的聚集在大脑中。来自不同脑区的组织聚集在一起，作为一个整体，脑组织不同于中胚层或内胚层衍生组织，这些组织表现出有限的聚集性。这些数据表明某些CpG岛的组织特异性甲基化一致，大脑白质和灰质之间存在明显差异。此外，有一种组织特异性甲基化CpG岛的总体模式，将神经组织与非神经组织区分开来。
关键词：组织特异性甲基化、CpG岛甲基化、神经、脑组织、灰质、白质
介绍
30多年来，人们一直在研究哺乳动物DNA甲基化的作用。已经清楚地证明，DNA甲基化是小鼠早期胚胎发生后生存所必需的。1,2目前尚不清楚的是DNA甲基化这一绝对要求的确切性质。众所周知，DNA甲基化在女性X染色体失活中起着关键作用，三印迹基因的等位基因特异性表达。4此外，大量数据表明，表达组织中组织特异性基因甲基化不足与非受压组织中这些基因甲基化之间存在相关性。5,6这些数据表明，DNA甲基化可能在哺乳动物的发育中起着关键作用。
在脊椎动物基因组中的所有CpG二核苷酸中，60-90%是甲基化的。7,8哺乳动物基因组中的大多数CpG二核苷酸分散在大块染色质中，通常高度甲基化，并被认为有助于抑制Alus和反转录转座子等重复元件的转录。9在人类DNA中，约15%的CpG二核苷酸存在于CpG岛，7,8定义为DNA长度>200 bp，G+C含量大于50%，观察到的CpG与预期的比率≥0.6。10CpG岛通常存在于“管家”基因和组织特异性基因的启动子中。除了失活的X染色体和印记基因外，人们一直认为CpG岛通常是非甲基化的，至少在生殖细胞中是这样，7也许在发育中的和成年的有机体中5对于大多数CpG岛屿。
具有非CpG岛启动子的组织特异性基因显示出组织特异性甲基化。然而，带有CpG岛启动子的组织特异性基因最初受到的关注较少。早期使用候选基因方法的研究导致了关于CpG岛组织特异性甲基化的相互矛盾的观点。一项针对七个组织特异性基因启动子甲基化状态的研究发现，四个具有CpG岛状特征的基因的启动子几乎没有甲基化，11支持这样的观点，即无论发育状态、组织或表达如何，带有CpG岛启动子的组织特异性基因都不会甲基化。然而，其他数据表明，CpG岛确实可以在正常成人组织中甲基化，这种现象可能与年龄有关。12最近发表了一些基于基因组的研究，这些研究着眼于正常体细胞组织中的大量CpG岛，提供了强有力的证据，证明组织特异性转录在一定程度上是由组织特异性差异甲基化区域控制的，包括CpG岛和非CpG岛屿。
使用亚硫酸氢盐DNA测序，Eckhart等人（2006年）13报道了12种不同组织中人类6、20和22号染色体的高分辨率甲基化谱。这些数据表明，进化上保守的区域是差异DNA甲基化的主要位点，特别是在转录起始位点周围的核心区域内的甲基化是启动子范围甲基化的信息替代物。另一项研究以较低的分辨率采用了更广泛的基因组方法14生成人类初级成纤维细胞和成熟精子中16000个启动子的DNA甲基化、RNA聚合酶II占有率和染色质状态的表观基因组图。结果表明，启动子序列和基因功能是启动子甲基化状态的主要预测因子，并表明弱的CpG岛在分化过程中容易发生从头甲基化，而强的CpG-岛启动子大多是非甲基化的，即使在不活跃的情况下也是如此。
一种比较基因组方法确定了小鼠和人类之间进化上保守的组织特异性CpG岛甲基化。从不同小鼠组织的全基因组DNA扫描中发现的这种CpG岛15用候选基因方法在人体组织中进行了研究。16在14个具有组织特异性甲基化的小鼠CpG岛中，有6个被发现在人类直系同源物中保留了类似的甲基化模式。其中五个与基因表达模式相关，进一步证明人类基因表达可以通过组织特异性CpG岛甲基化介导的基因沉默来调节。最近又有多个小组应用了各种全基因组CpG岛甲基化方法17–20证实并拓宽了CpG岛甲基化在细胞特性和组织特异性基因表达中发挥重要作用的观点，这些区域大多具有广泛的CpG密度。
大多数研究都没有解决人类组织中组织特异性CpG岛甲基化的个体间变异问题。只有少数研究在候选基因水平上使用来自多个个体的相同组织，16,18,20但这些研究都没有通过对来自多个个体的相同组织使用基因组方法来确定CpG岛的组织特异性甲基化是否一致来解决这个问题。最近的基于基因组学的方法已经解决了这个问题，并表明正常人类组织中的CpG岛甲基化模式在从多个个体研究的同一组织中比从同一个体研究的组织彼此之间更相似。21另一项研究发现，DNA甲基化模式的诱导间差异可能与年龄和环境暴露（如吸烟）有关。22
最近的一项研究着眼于大脑的三个区域，探讨了组织特异性甲基化的诱导差异问题。23这项研究确定了76个大脑样本中1505个CpG位点的定量DNA甲基化水平，这些样本代表大脑皮层（n=35）、小脑（n=34）和脑桥（n=7）。一组156个loc显示了大脑区域之间具有统计学意义的甲基化差异，无监督的层次分析显示大脑的聚集性强，与小脑和脑桥的聚集性不同。他们的数据表明，DNA甲基化特征区分了大脑区域，在许多个体中是一致的，可能有助于解释区域特定的功能专门化。
在本研究中，我们分析了大约1500个不是通过限制性Landmark基因组扫描（RLGS），从7个人的12个不同组织中获得I位点。每个组织均取自至少两个人，最多五个人。我们的数据清楚地表明，大脑区域之间以及其他组织类型之间存在组织特异性CpG岛甲基化，并且这些甲基化差异在不同的个体之间得以保留。此外，我们证明，正如之前报道的那样，组织特异性甲基化的差异不仅存在于大脑的不同区域，23而且还在同一大脑区域的灰质和白质之间。尽管大脑区域之间存在差异，但神经组织与非神经组织仍有明显区别。
结果
在多个个体中发现组织特异性甲基化差异。
对7名患者尸检时采集的12个组织的DNA进行RLGS图谱的制备。收集了不同的脑区，包括基底神经节、小脑、大脑额叶和颞叶。小脑和大脑额叶被分为灰质和白质。非脑组织包括肾、肺、前列腺、脾、胃和甲状腺。将单个患者的所有轮廓进行相互比较，并注意到二维模式的差异。并非所有组织都是从每个患者身上采集或产生的高质量DNA。显示了对每个患者的RLGS凝胶进行分析的组织。用这种方法分析了总共33个RLGS剖面。为了避免因遗传多态性引起的模式差异，没有直接比较这七名患者的特征。然而，在每个患者的所有组织中的所有33个RLGS图谱中，研究了单个患者的一组图谱中发现的差异。
RLGS片段根据前面描述的主RLGS配置文件的编号系统命名。29共有141个RLGS点在至少一名患者的组织中显示出组织特异性甲基化差异。其中，82个RLGS斑点存在于每个患者的至少一个组织中，或仅部分甲基化，因此排除了遗传多态性作为RLGS点丢失的解释。需要注意的是，我们为3号患者破例。所有患者中至少有一个组织中存在的斑点，但患者3中没有（只有19个这样的斑点），对于该患者来说，仍然被认为是非多态性的，因为我们只有该患者两个脑组织的数据。这82个点，列于补充表1，包含我们的一组非多态RLGS斑点，显示正常组织中的差异甲基化。
在这82个RLGS位点中，我们通过各种RLGS点克隆方法确定了这些位点代表的34个序列。24,28
显示了每个患者每个组织中34个RLGS点中每个点的甲基化模式，黑框表示甲基化。34个RLGS位点中每个位点的基因组位置和基因同源性信息如所示.补充表1显示了所有82个显示组织特异性甲基化差异的非多态RLGS点（包括基因组位置尚未确定的点）的数据。
表2
| RLGS公司 | 1非I+/-200 bp | 2基因同源性 | 上下文 | 5CpG岛 | GC百分比 | O/E CpG公司 |
| 2E20型 | 电话：10:26545049-26545449 | GAD2型 | 三5′端 | Y（Y） | 62 | 0.83 |
| 3B07号机组 | 电话：154975702-154976102 | CNPY1公司 | 4非5′端 | Y（Y） | 66 | 0.77 |
| 三维46 | 电话17:69861884-69862284 | 基辅19 | 非5′端 | Y（Y） | 70 | 0.72 |
| 2C66型 | 克时14:55654263-55654663 | PELI2公司 | 5′端 | Y（Y） | 72 | 0.99 |
| 2D45型 | 电话19:36534086-36534486 | TSHZ3型 | 5′端 | Y（Y） | 58 | 1.06 |
| 2C57个 | 电话：10:103579943-103580343 | KCNIP2型 | 非5′端 | Y（Y） | 63 | 0.89 |
| 5E22型 | 电话：12:50603467-50603867 | ACVRL1型 | 非5′端 | N个 | - | - |
| 3C76公司 | 电话：12:122322149-122322549 | CDK2AP1基因 | 5′端 | Y（Y） | 52 | 1.31 |
| 4楼36 | chr1:44655757-44656157 | RNF220系列 | 非5′端 | Y（Y） | 68 | 0.84 |
| 3G78型 | chr1:47463932-47464332 | TAL1（目标1） | 非5′端 | Y（Y） | 58 | 1.06 |
| 2009年4月 | chr3:9570143-9570543 | 左侧FPL4 | 5′端 | Y（Y） | 66 | 1.07 |
| 3C64型 | 电话：7:1253663-1254063 | - | - | Y（Y） | 70 | 0.81 |
| 1F22层 | 电话：9:125817263-125817663 | LHX2型 | 5′端 | Y（Y） | 58 | 0.77 |
| 二维25 | 电话：10:135086929-135087329 | SPRN公司 | 5′端 | Y（Y） | 67 | 0.81 |
| 第二季第33集 | chr1:110412400-110412800 | ALX3系列 | 5′端 | Y（Y） | 65 | 0.83 |
| 4E50个 | 电话15:83326046-83326446 | PDE8A型 | 5′端 | Y（Y） | 61 | 1.12 |
| 2F68型 | 电话14:23850460-23850860 | 贷款B4R | 5′端 | Y（Y） | 68 | 0.83 |
| 三维24 | 电话17:55534607-55535007 | LOC653653号 | 5′端 | N个 | - | - |
| 2B53号机组 | 电话22:17658760-17659160 | CLTCL1公司 | 5′端 | Y（Y） | 61 | 1.04 |
| 4E16型 | 电话：174326770-174327170 | GALNT7公司 | 5′端 | Y（Y） | 68 | 0.99 |
| 二维48 | 电话：27231338-27231738 | - | - | Y（Y） | 70 | 0.98 |
| 二维34 | 电话：81947988-81948388 | ZNF704型 | 非5′端 | Y（Y） | 56 | 1.23 |
| 二维68 | 电话：10:104394156-104394556 | 装饰8 | 5′端 | Y（Y） | 65 | 0.93 |
| 2B54型 | 电话：10:131659907-13160307 | - | - | Y（Y） | 57 | 0.89 |
| 2010年2月 | 电话：979471-979871 | - | - | Y（Y） | 68 | 0.83 |
| 2B46型 | 电话15:29406195-29406595 | 吉隆坡13 | 5′端 | Y（Y） | 66 | 1.06 |
| 3B30型 | 电话15:40816055-40816455 | CDAN1公司 | 5′端 | Y（Y） | 69 | 0.84 |
| 3B19号机组 | 电话：23461579-23461979 | KLHL29号机组 | 5′端 | Y（Y） | 53 | 1.11 |
| 第2页第35页 | 电话：10:23502265-23502665 | LOC729385号 | 5′端 | Y（Y） | 68 | 0.86 |
| 3C70型 | 电话：12:122321009-122321409 | CDK2AP1号机组 | 5′端 | Y（Y） | 53 | 1.31 |
| 2E17型 | 电话17:52026137-52026537 | NOG公司 | 5′端 | Y（Y） | 68 | 0.85 |
| 4B10型 | 电话15:32181122-32181522 | 前列腺素BD4 | 5′端 | Y（Y） | 63 | 0.78 |
| 2015年2月 | 电话17:75398454-75398854 | - | - | Y（Y） | 60 | 0.8 |
| 3C74公司 | 表5:81082153-81082553 | SSBP2型 | 5′端 | Y（Y） | 57 | 1.04 |
显示了所有12个组织的RLGS分析示例，其中包括患者1的脑组织和患者2的非脑组织。RLGS碎片3D24（见箭头，)存在于小脑白质（C.white）剖面中，但明显不存在于小脑皮层（灰质）（C.Cort）中。如所示并被视为3D24片段在，某些其他神经系统组织也被评分为甲基化。我们估计我们通过RLGS评分甲基化的能力受到35-45%片段强度损失的检测下限的限制，这取决于DNA的质量。29随后克隆3D24 RLGS片段（NotI-EcoRV片段）并将该片段用作Southern blot分析的杂交探针显示所有组织中存在部分甲基化。甲基化的定量是通过比较甲基化带的强度和甲基化带和非甲基化带组合的强度来确定每个组织的估计甲基化百分比来完成的(). 这些数据表明，RLGS分析的预期敏感性与随后通过定量Southern blot分析测量的组织特异性甲基化非常吻合。此外，这些数据表明，RLGS位点仅在小脑皮层中高水平甲基化，但在其他组织中，包括小脑白质，仅低水平甲基化。
通过12个组织的RLGS分析确定的组织特异性甲基化示例，并通过Southern blot分析进行量化。（A） 所有12个组织的完整RLGS分析的切割图，箭头指示片段3D24。（B） 使用3D24进行定量Southern blot分析不是我-生态RV片段作为杂交探针。第一通道含有小脑皮层DNA生态仅限RV。2–13号车道均为双消化道生态RV和不是I.第2–13通道中的DNA按照（A）中所示的顺序加载，第8通道中的外周神经代替肾脏。根据DNA的可用性，在每条通道中加载0.5微克（外周神经）到10微克（小脑皮层）。指示甲基化或无甲基化的条带。（C） （B）中Southern blot检测到的甲基化百分比的定量。对于通道2–13，甲基化百分比按照材料和方法.*，13 kb生态RV序列没有不是与探针同源的I位点。用探针序列进行的BLAST分析鉴定了解释该条带的BAC克隆。29（D） 具有代表性的RLGS剖面图显示了多个患者的大脑皮层中的3B07点并显示出一致的点存在（缺乏甲基化），但多个患者大脑其他区域中的点缺失（甲基化）。缩写：B.gang，基底神经节；C.cort，小脑皮层；C.白色，小脑白质；F.cort，额叶皮层；白色，额叶白质；T.cort，颞叶皮层。
多个患者之间最显著且一致的甲基化差异发生在大脑区域之间，甚至发生在同一区域的灰质和白质之间。尽管许多基因座在有限的组织中表现出甲基化，如上述3D24，但五分之四的患者小脑皮层中甲基化()，其他基因座在一个组织中始终显示缺乏甲基化。例如，在CNPY1基因的3′端发现的RLGS位点3B07在小脑皮层的每一例中都是非甲基化的（n=5），但在包括小脑白质在内的大多数其他脑区中都是甲基化的。显示了具有代表性的RLGS凝胶区域，表明三名患者的小脑皮层凝胶中存在斑点，而其他脑区域中没有斑点。
我们对RLGS总数据集进行了分层聚类分析，如所示，以寻找甲基化模式。我们发现，虽然一些组织倾向于基于甲基化模式聚集在一起，例如C.cort，但更引人注目的是，神经组织与非神经组织明显地聚集在一起。聚类分析使用样本之间的“曼哈顿”距离（绝对距离）和“沃德”方法进行聚类。简言之，两个样本之间的”曼哈顿”距离等于显示甲基化差异的位点数量，而“沃德聚类方法试图最小化任何两个（假设）聚类的平方和，而不是在聚类算法的每个步骤中可以形成的平方和。从树状图的检查来看，似乎有两个主要组，一组由中胚层和内胚层衍生的组织组成，而另一组仅由外胚层衍生的脑组织组成。
RLGS数据的分层聚类。热图和dendogram（顶部）显示了使用“Ward”方法进行聚类的样本之间的“曼哈顿”距离（绝对距离）。RLGS点排列在Y轴上。黑框表示所示组织中的RLGS斑点甲基化阳性。组织排列在X轴上。缩写：B.gang，基底神经节；大脑皮层；C.白色，小脑白质；F.cort，额叶皮层；白色，额叶白质；T.cort，颞叶皮层；Ecto，外胚层衍生组织；中胚层，中胚层衍生组织；内胚层，内胚层衍生组织。
显示了代表性RLGS剖面图，指出了来自三名患者的六个外胚层衍生组织的3D46点。该斑点在所有六个剖面中都不存在或几乎无法检测到。然而，该斑点存在于中胚层和内胚层衍生组织中，包括患者2和9的胃、患者5的脾脏、患者2和5的肺以及患者8的甲状腺(). 鉴于研究中中胚层或内胚层衍生的组织数量有限，并且使用的唯一外胚层衍生的组织是神经组织，我们无法区分甲基化模式的差异是否与组织来源的胚层有关，或者更具体地说与神经细胞和非神经细胞谱系之间的差异有关。
斑点3D46的RLGS图谱显示神经组织与非神经组织的特异性。（A） 该斑点在外胚层组织（C.皮层、T.皮层和B.神经节）中缺失（顶部）或微弱存在（底部）。（B） 在中胚层和内胚层组织（胃、脾、肺和甲状腺）中，斑点明显存在，因此未甲基化。缩写：B.gang，基底神经节；C.cort，小脑皮层；C.白色，小脑白质；F.白色，额叶白质；T.cort，颞叶皮层。
MAQMA证实了组织和神经特异性甲基化。
上述RLGS数据提供了有关NotI限制位点甲基化状态的信息，并依赖于斑点丢失的主观测定，斑点丢失的程度可能因部分甲基化而有所不同(). 为了验证RLGS结果，并利用定量数据获得NotI位点区域周围更广泛的甲基化信息，我们在Sequenome平台上通过质谱定量甲基化分析（MAQMA）使用亚硫酸氢盐测序。31,32MAQMA给出了每个甲基化百分比的定量值信息性CpG二核苷酸。定量数据的图解表示如所示对于RLGS点1F22，这通常确认了RLGS结果，如甲基化程度最高的是小脑皮层和额叶白质。为了获得一个用于组织类型或组织的神经或非神经性质之间比较的单一值，计算测序CpG岛内所有CpG二核苷酸的平均甲基化百分比，并绘制结果().
使用MAQMA确认RLGS数据。（A） 所有正常人体组织上1F22 CpG岛的MAQMA数据。每行代表一个样本，标记在左侧，表示患者编号和组织。在串珠图中，每个串珠代表一个CpG二核苷酸。甲基化的百分比由图顶部的键所示的灰度阴影表示，深灰色表示100%甲基化。底部的两个肺样本未能进行PCR扩增。为了检测亚硫酸氢盐PCR偏倚，我们使用外周血淋巴细胞（PBL）DNA作为0%甲基化对照，并使用与100%甲基化对照相同的DNA的体外甲基化（IVM）小份。以适当的比例混合这些DNA，以生成75、50和25%甲基化对照，所有对照均经过亚硫酸氢盐处理，用作亚硫酸氢PCR和MAQMA分析的模板，如图顶部所示。（B–E）MAQMA检测到的每个样本的CpG岛序列片段的平均甲基化水平显示在y轴上。该值来自于取每个样本的每个CpG二核苷酸的MAQMA值的平均值，每个样本针对每个图顶部显示的四个RLGS点中的每个点进行测序。样本沿着x轴按左侧的组织类型和右侧的神经组织与非神经组织进行分类。每个符号代表一个样本。黑色圆圈表示小脑皮层样本。使用Wilcoxon秩和检验确定p值39确定神经和非神经细胞的平均甲基化水平是否存在差异。给出了使用和不使用小脑皮质样本进行的Wilcoxon秩和检验的值。
这些数据证实了斑点1F22、3B07、3D24和3D46的组织特异性甲基化差异。对于所有四个基因座，小脑皮层显示出差异甲基化，3B07是唯一甲基化程度较低的病例。对于所有四个基因座，所有五个小脑皮层样本中甲基化水平的一致性引人注目。用于RLGS点1F22()小脑皮层平均甲基化率为78%（n=5），而同一区域的白质仅显示35%的甲基化（n=3）。RLGS点3B07()灰质低甲基化平均为31%，白质平均为52%。在这种情况下，即使是小脑白质的甲基化程度也比任何其他组织略低，平均甲基化率为62%（n=24）。通过定量Southern blot分析(和C)spot 3D24在小脑皮层中表现出高水平的甲基化，但在所有其他组织中只有中等程度的甲基化水平，这在.
此外，这些数据证明了RLGS点1F22、3D24和3D46的神经与非神经甲基化特异性，无论小脑皮质样本是否包括在分析中。例如，显示了3D46的甲基化状态。所有脑组织的甲基化水平（51–78%）均高于非神经组织（内胚层衍生组织（18–48%）和中胚层派生组织（17–38%））。统计分析表明，脑组织中的甲基化程度显著高于非神经组织（分别为17和15）（p<0.001）。此外，即使从分析中删除小脑皮层样本，差异仍然非常显著（p＜0.001）。1F22和3D24的神经与非神经甲基化特异性相似。3B07的情况并非如此，它显示CpG岛仅在小脑皮层发生低甲基化。
讨论
本文中的数据提供了正常成人人体组织中CpG岛甲基化差异的总体评估。我们的数据显示，经多种方法证实，三个RLGS基因座的组织特异性CpG岛高甲基化：3D24（AP1S2的假基因）、3D46（KIF19）和1F22（LHX2），以及3B07的组织特异CpG岛屿低甲基化（CNPY1）。我们进一步证明，人脑的不同区域不仅有不同的甲基化模式，可能与Laad-Acosta等人（2007）的研究所建议的特定功能有关，23但在同一脑区内，灰质和白质之间也有明显的差异。通过比较RLGS 1F22点的小脑皮层和白质，可以最清楚地证明这一点。我们认为，皮层和白质之间的甲基化差异反映了提取DNA的主要细胞类型的差异，即皮层中神经元的细胞核和白质中少突胶质细胞和星形胶质细胞的细胞核。我们还通过RLGS基因座3D46（KIF19）和1F22（LHX2）的证实例子，提供了甲基化模式中胚层特异性的证据。外胚层衍生（脑）组织在这两个部位的甲基化水平最高，而中胚层组织和内胚层组织的甲基化程度较低。然而，对这种解释的一个警告是，我们只能比较外胚层的神经组织。因此，我们所证明的甲基化差异可能更多地与神经与非神经分化有关，而不是与组织来源的胚层有关。Sakamoto等人就NotI位点甲基化模式与细胞类型发育相似性之间的关系得出了类似结论。34在小鼠组织中。
一个特别有趣的发现是，与大脑的其他区域相比，LHX2基因（LIM/同源盒蛋白LH2）在小脑皮层中的甲基化率很高。LHX2基因起转录调节器的作用，最近有报道称，在小鼠大脑发育过程中，LHX2在决定皮层身份方面发挥了经典选择基因的作用。35我们发现，与成人大脑的其他区域（范围26-56%；n=12）相比，LHX2基因（RLGS点1F22）在小脑皮层中仍高度甲基化（范围76-81%；n=5）。如所示补充图1艾伦大脑地图集项目通过原位杂交发现，Lhx2在小鼠小脑中的表达非常低，但在包括额叶和颞叶在内的一些前脑结构中的表达很高（在我们的研究中使用）。这很符合我们的观察结果，即LHX2仅在小脑中高度甲基化。此外，LHX2被认为在小鼠中胚层（间充质）发育中发挥作用。36在我们的研究中，Lhx2基因在肾脏、前列腺和脾脏等中胚层组织中显示出最小的甲基化。
由于尸检样本中RNA的缺乏，我们无法在研究中直接研究基因表达。然而，从GNF表达数据库中，我们可以关联一些基因的甲基化和表达模式。与我们的甲基化研究结果和艾伦脑图谱项目的原位研究结果一致，GNF表达数据库表明，Lhx2基因在小鼠和人类的大多数脑区都有高表达，但小脑除外，小脑的表达相对较低(补充图2). 有趣的是，该基因在大多数非脑组织中都没有表达，包括我们研究中使用的组织，但我们没有通过RLGS分析或亚硫酸氢盐测序检测到这些组织中的DNA甲基化。这表明DNA甲基化不是某些组织中基因沉默所必需的。这些观察结果表明，DNA甲基化可能只需要在神经细胞中沉默该基因，而非神经细胞无论甲基化状态如何，都不具备表达LHX2的能力。
CNPY1基因显示出与LHX2完全相反的模式。虽然LHX2在前脑发育中很重要，但CNPY1在后脑发育中也很重要。研究发现，Canopy 1基因在斑马鱼的中脑-后脑边界表达，在中脑顶盖和小脑的发育中起着重要作用。37艾伦脑图谱项目发现，小鼠Cnpy1在小脑中高度表达，但在大多数其他脑区中不表达(补充图1). GNF表达数据库显示了类似的结果，仅在小脑中有高水平表达(补充图2). 我们的数据表明，该基因（RLGS点3B07）在除小脑外的所有组织中都高度甲基化()因此，它的甲基化在非小脑组织中的基因沉默中起作用是一致的。
综上所述，这些数据表明，有限数量的CpG岛表现出组织特异性甲基化，并且显示出显著的特异性，不仅比较了大脑的一个区域与另一个区域，还比较了同一神经解剖结构中不同区域之间的特异性。一种更全面的微阵列或基于高通量测序的方法肯定会识别出更多这样的CpG岛，但比例预计是相同的。我们认为，这些组织特异性甲基化模式是不同发育阶段组织特异性基因表达调控机制的一个关键方面。此外，大脑的不同区域具有不同的甲基化模式，这一事实支持了DNA甲基化是特定大脑区域功能专门化的主要决定因素，甚至可能是其细胞组成的观点。此外，我们对神经特异性甲基化模式的发现表明，一些CpG岛的甲基化可能在发育早期确定。这可能与一些表观遗传差异有关，这些差异已在结合多梳抑制复合物2（PRC2）的位点上得到证明，因为干细胞沿不同谱系分化。38
材料和方法
正常组织样本。
7名患者在死亡后4-8小时内进行尸检，获得正常组织。组织立即在液氮中冷冻并储存在−70°C。组织取自以下患者供体：患者1为54岁高加索女性；患者2为80岁白人男性；患者3为38岁白人男性；患者4为69岁高加索女性；患者5为60岁男性；患者6为58岁男性；患者9为40岁男性。所有患者在死亡时均无肿瘤或自身免疫性疾病的证据。经俄亥俄州立大学机构审查委员会批准，收集了1-4名患者的组织，该委员会确定本研究中使用的样本来自非活人，因此，根据美国联邦法规第46.102（f）条，不构成人体受试者研究。德国蒙斯特威斯特法利安威廉大学（IRB#2007-254-f-S）医生委员会伦理委员会批准后，收集患者5、6和9的组织。
限制性标志基因扫描和点克隆。
先前描述了从组织中提取基因组DNA的方案。24Dai等人公布的研究方案。25对RLGS凝胶进行跟踪。如前所述克隆感兴趣的RLGS点。24,26–28如前所述进行RLGS凝胶分析，并对剖面进行目视检查。29,30我们之前已经证明，并在本研究中证实，当NotI位点的DNA甲基化约为40%或更大时，该方法准确地将DNA甲基化识别为相对于同一凝胶上周围斑点的斑点强度损失。29,30
Southern杂交分析。
用适当的限制性内切酶消化基因组DNA 4小时，然后按照前面所述进行Southern blot分析。24使用PhosphorImager和Imagequant软件（Molecular Dynamics，Inc.）对Southern印迹进行定量，以量化个别条带。在每个通道中，在甲基化带和非甲基化带的位置上量化相等区域的总像素强度。为了表示甲基化的百分比，甲基化带的值除以甲基化带和非甲基化带之和，再乘以100。由于所有的计算和测量都是在每个单独的车道内进行的，因此车道的不均匀荷载受到控制。
亚硫酸氢钠处理。
按照制造商的方案EZ-96 DNA甲基化试剂盒（Zymo Research，Orange，CA，USA），使用750 ng的50µl蒸馏水和M-稀释缓冲液进行亚硫酸氢钠处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为胸苷。将处理过的样品重新悬浮在75µl M-Elution缓冲液中，并在−20°C下保存。
MassARRAY定量甲基化分析（MAQMA）。
如前所述，使用Sequenome公司开发的MassArray Compact系统进行MassArray定量甲基化分析（MAQMA）。31可根据要求提供引物序列。该系统利用质谱（MS）检测和定量分析DNA甲基化。这种方法被证明是一种高度准确和可重复的定量甲基化的方法。32
统计。
对于每个CpG位点位点，采用Wilcoxon秩和检验比较MAQMA测量的不同组织类型的甲基化平均百分比。通过小于0.05的单变量p值评估显著性(). 图中所示的热图和dendogram使用R中的“image”函数和样本之间的“manhattan”距离（绝对距离）以及用于聚类的“Ward”方法生成。33简而言之，两个样本之间的“曼哈顿”距离等于显示甲基化差异的基因座数量，而用于聚类的“沃德”方法试图将聚类算法中每一步形成的任何两个（假设）簇的平方和最小化。R计算语言用于创建并执行所有统计测试。33
使用MAQMA确认RLGS数据。（B–E）MAQMA在每个样本的CpG岛序列片段中检测到的平均甲基化水平显示在y轴上。该值来自于取每个样本的每个CpG二核苷酸的MAQMA值的平均值，每个样本针对每个图顶部显示的四个RLGS点中的每个点进行测序。样本沿着x轴按左侧的组织类型和右侧的神经组织与非神经组织进行分类。每个符号代表一个样本。黑色圆圈表示小脑皮层样本。p值采用Wilcoxon秩和检验确定39确定神经和非神经细胞的平均甲基化水平是否存在差异。给出了使用和不使用小脑皮质样本进行的Wilcoxon秩和检验的值。
致谢
这项工作得到了国家癌症研究所通过罗斯韦尔公园癌症中心支持拨款的部分支持，[CA 16056]（D.J.S.，S.G.，J.C.M.）。
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