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公共科学图书馆一号。2012; 7（3）：e32869。
2012年3月2日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0032869
预防性维修识别码：项目经理3292581
PMID：22396798

TrkB对BDNF和抗抑郁药物的反应在小鼠发育过程中受到不同调节

安东尼奥·迪·利托,#1 托米·兰塔梅基,#1 莉莎·维萨,1 Sudhirkumar Yanpallewar公司,2 汉娜·安提拉,1 杰西·林德霍姆,1 玛丽贝尔·里奥斯,三 利诺·特萨罗洛,2和埃罗·卡斯特伦1,*
斯蒂芬·金斯伯格，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

背景

以前的研究表明，TrkB受体对BDNF的反应性在大鼠体内是发育调节的。抗抑郁药物（AD）已被证明能增加成年啮齿动物大脑中的TrkB信号，最近的研究结果表明这一现象背后有BDNF依赖性机制。当在出生后早期使用时，AD会产生成年动物中观察到的长期生化和行为改变。

方法

我们在这里检测了小鼠出生后早期大脑TrkB受体对BDNF和ADs的反应性，测量为TrkB（pTrkB）的自磷酸化。

主要调查结果

我们发现，在出生后第12天（P12）之前，ADs未能诱导TrkB信号传导，之后观察到成人对ADs的TrkB反应。有趣的是，TrkB对系统性AD的反应性的出现与脑微片中BDNF诱导的TrkB的显著发育性降低之间存在时间上的负相关体外只有在出生后早期，BDNF缺陷小鼠大脑中的基本p-TrkB状态才显著降低。增强cAMP（环磷酸腺苷）信号未能促进TrkB对BDNF的反应。TrkB对BDNF的反应性降低并不是由显性阴性截断TrkB表达的发育增加引起的。T1，因为在trkB。时间T1 −/−老鼠。此外，出生后服用AD可在成年小鼠中观察到长期的行为改变，但当ADs没有（P4-9）或（P16-21）激活TrkB时，对小鼠的反应不同。

结论

我们发现，ADs仅在2周以上的小鼠中诱导TrkB的激活，并且在同一时间段内，脑微丝对BDNF的反应性降低。在AD激活TrkB的年龄前后暴露于AD会在成年小鼠中产生不同的长期行为反应。

介绍

脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体TrkB是神经元存活、分化、轴突和树突状生长以及突触形成的关键调节因子[1]在过去的几年里，它们在成人中枢神经系统（CNS）中的作用，调节功能，如神经元可塑性、认知、焦虑和情绪调节，已经被阐明[2]–[5].

BDNF和TrkB在抗抑郁药物（AD）的作用机制中起核心作用[6],[7]所有临床使用的ADs都能快速诱导TrkB的自身磷酸化，TrkB活化似乎是所有ADs作用机制中的一个常见步骤[8],[9]在中枢神经系统BDNF或TrkB信号水平降低的动物中，AD的行为影响减弱[8]另一方面，BDNF注入成年大脑或神经元中TrkB过度表达会在啮齿类动物中产生AD样行为[10]–[12]这些数据表明，BDNF-TrkB信号对AD诱导的成年啮齿动物行为效应是必要的，也是充分的。

先前的研究表明，TrkB对BDNF的反应性在发育过程中受到调节；BDNF很容易激活出生后早期大鼠脑微切片中的TrkB，但出生后第二周BDNF的这种作用被强烈减弱[13]这一发现与大脑中BDNF水平在此期间迅速增加的事实形成了对比[14]，这对应于最强烈的神经元迁移和分化期的结束。

研究表明，在啮齿动物的早期暴露于AD会产生长期的行为变化，即使在成年期也很明显。具体来说，抑郁、焦虑、运动和性行为在成年后会发生改变[15]–[17]这些变化可以通过成人AD治疗得到改善[17]出生后第4至21天的AD治疗会导致bdnf公司和trkB型小鼠mRNA表达[17]这表明BDNF-TrkB信号可能在AD早期治疗的长期行为后果中发挥作用。

我们在此研究了TrkB对系统性ADs和体外BDNF在小鼠出生后发育的不同阶段。我们的结果提出了一个有趣的假设，即在出生后的发育过程中，TrkB的反应性从一个容易被BDNF激活但对ADs不敏感的受体转变为一个被ADs明确磷酸化但仅弱于BDNF活化的TrkB。这种转变可能在某些成人情绪表型的发展中起作用。

结果

系统性丙咪嗪治疗以年龄依赖的方式激活大脑TrkB信号

我们之前已经证明，一次性腹腔注射AD可在一小时内诱导成年啮齿动物大脑前额叶皮层（PFC）和海马（HC）TrkB磷酸化[8],[9],[18]在本研究中，我们用生理盐水或抗抑郁药物丙咪嗪（IMI；30 mg/kg）单次腹腔注射治疗P5至P21岁的幼鼠，并分析注射后30分钟TrkB不同酪氨酸残基的磷酸化状态。

我们的结果表明，在出生后，TrkB对ADs的反应受年龄的调节。在PFC中，P5和P11之间小鼠的急性IMI治疗未能增加PLCγ1位点的TrkB磷酸化（pY816）( 图1a ). 然而，与生理盐水处理的对照组相比，IMI处理的动物从P12到成年期间pY816带免疫反应性在统计学上显著增加( 图1a ). 在HC中，TrkB对急性IMI治疗的反应呈现类似的激活模式( 图1a ). 在这两种组织中，出生后后期Y816的磷酸化程度与成年动物中观察到的类似。

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系统性丙咪嗪对小鼠脑内TrkB磷酸化和信号传导的年龄依赖性影响。

（a） 急性丙咪嗪治疗（30 mg/kg，30 min，i.p.）后，前额叶皮层（PFC）和海马（HC）TrkB磷脂酶-Cγ1（PLCγ1）结合位点（Y816）磷酸化。磷酸化TrkB值相对于总TrkB水平进行归一化。（b） CREB的磷酸化（Ser133)在前额叶皮层（PFC）和海马（HC）接受急性丙咪嗪治疗（30mg/kg，30min，i.p.）后。磷-CREB值根据总CREB水平进行标准化。（c） 急性丙咪嗪治疗（30 mg/kg，30 min，i.p.）对磷酸化PLCγ1（Tyr）结合的影响783)在P8小鼠幼鼠海马中具有催化TrkB受体。（d） 急性丙咪嗪治疗（30 mg/kg，30 min，i.p.）对磷酸化PLCγ1（Tyr）结合的影响783)P25小鼠幼鼠海马中含有催化TrkB受体。结果表示为各自控制的百分比。在不同年龄的每个对照组和治疗组动物之间进行t检验*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001. 每组n=6–7。

我们之前已经证明，ADs在PLCγ1位点（Y816）特异性诱导TrkB磷酸化和CREB磷酸化（cAMP反应元件结合蛋白），CREB是该途径的下游靶点，而在Shc位点（pY515）或其下游靶点Akt没有观察到磷酸化水平的增加[9]与此一致，急性IMI治疗仅在P13后诱导小鼠脑pCREB水平显著增加( 图1b ). CREB激活的时间模式与TrkB磷酸化的时间模式密切相关。IMI处理也诱导P25小鼠幼崽磷酸化PLCγ1与催化TrkB受体的结合，而在P8小鼠幼崽中未观察到这种结合( 图1c–d ). 相反，IMI给药在出生后的任何年龄段都不会影响PFC或HC中Y515位点或Akt的磷酸化(图S1). 此外，正如成人大脑中已经报道的那样[9],[18]，IMI急性治疗在任何年龄段都不能调节TrkB的总蛋白水平(数据未显示).

小鼠脑样本中年龄依赖性BDNF-TrkB信号

克努塞尔等 [13]据报道，从大鼠幼崽制备的海马和皮层微丝培养到P7岁时，对BDNF暴露有反应，TrkB磷酸化显著增加。然而，从P14开始，在成人大脑中，TrkB对BDNF的反应显著降低[13]与这些观察结果一致，新鲜PFC和HC微丝与BDNF孵育后，P5处pTrkB水平显著增加( 图2a ). P9和P11仍存在此响应( 图2a ). 然而，在P11和P12之间观察到BDNF诱导的pTrkB水平明显下降，在P15或之后仅检测到pTrkB水平的适度增加( 图2a ). BDNF诱导成年小鼠（P60）脑微丝中TrkB磷酸化的能力被完全消除( 图2a )与之前的研究结果一致[13]经BDNF急性治疗后，任何年龄段的TrkB总蛋白水平均无差异(图S2).

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BDNF诱导的TrkB受体磷酸化的发育调控。

（a） 在小鼠皮层（PFC）和海马（HC）微丝中显示BDNF诱导的TrkB酪氨酸磷酸化（Y816）反应的年龄依赖性改变的典型实验印迹体外（b）典型的实验印迹表明，BDNF（50 ng/ml，15 min，37°C）容易诱导P8海马微片中Y515和Y705/6位点的TrkB磷酸化，而P24海马微片的BDNF没有有效磷酸化这两个位点。（c） 在相同条件下，NGF（50 ng/ml，15 min，37°c）容易诱导P24海马微片中的TrkA酪氨酸磷酸化（Y674/5），而BDNF（50 ng/ml，15 min）对TrkB磷酸化（Y705/6）没有影响。对于统计分析，先进行单因素方差分析，然后进行Bonferroni分析事后（post-hoc）进行试验***P（P）<0.001. n=每组4个。磷-TrkB值根据总TrkB水平进行标准化。

克努塞尔的研究等 [13]检测了BDNF应用后TrkB的总酪氨酸磷酸化，而我们检测了TrkB（Y816位点）中特定酪氨酸残基的磷酸化状态。因此，我们检测了TrkB中的其他酪氨酸残基在出生后晚期是否对BDNF低反应。事实上，从P24小鼠获得的海马微片中可以看到BDNF诱导的TrkB的Y515和Y705/6（催化域）位点磷酸化显著降低，但在P8，这两个位点都有明显的诱导作用( 图2b ). 在从幼鼠（P7-P27）制备的海马微切片中，TrkB的Y515和Y705/6位点的发育低反应性基本相似(数据未显示).

BDNF诱导小鼠脑微片TrkB磷酸化的发育能力降低可能不是由于BDNF进入成熟脑组织的外显率降低，因为在P24小鼠海马微片中，一种高度相关的神经营养素NGF（神经生长因子）容易诱导TrkA磷酸化（Y674/5）( 图2c ).

为了检查体内TrkB对BDNF的发育反应性，我们分析了BDNF水平降低的幼年和成年小鼠海马中TrkB的基础磷酸化状态。符合体外实验中，Y816和Y705/6位点的基础TrkB磷酸化在Bdnf公司 +/−小白鼠幼崽[19]与年龄匹配的野生型（WT）小鼠相比( 图3a ). 从P11获得的样品中几乎检测不到pTrkB水平Bdnf公司 −/−小河马( 图3a ). 然而，在前脑BDNF条件缺失的成年小鼠中，基础TrkB磷酸化水平没有改变（cBdnf公司 −/−)[20]( 图3b ). 此外，如前所示[21]，成人海马TrkB基础磷酸化未发生改变Bdnf公司 +/−老鼠( 图3c ).

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BDNF缺乏的未成年小鼠表现出海马TrkB磷酸化降低。

（a） P11老年人基底海马TrkB磷酸化（Y816，Y705/6）显著降低Bdnf公司 +/−（+/-）和Bdnf公司 −/−（−/−）小鼠幼崽与年龄匹配的野生型（WT）小鼠的比较。（b） 在前脑BDNF有条件缺失的小鼠中，基底海马TrkB磷酸化（Y816）没有改变（cBdnf公司 −/−或（c）−/−）。（c） 成人基底海马TrkB磷酸化（Y705/6）没有改变Bdnf公司 +/−（+/-）鼠标。为了进行统计分析，进行了t检验**P（P）<0.01. n=3-6/组。磷-TrkB值根据总TrkB水平进行标准化。

TrkB的作用。T1调节TrkB对BDNF和丙咪嗪的反应性

由于TrkB的表达在发育过程中增加。T1是主要的截断TrkB受体，与TrkB对BDNF的反应性降低相一致[13]，建议TrkB。T1，作为全长TrkB的显性负性伴侣和BDNF清除受体[22],[23]，可能解释了出生后发育后期TrkB对BDNF的反应性降低[13]因此，我们研究了TrkB对BDNF和IMI治疗在WT和trkB。时间T1 −/−敲除小鼠[24]用BDNF孵育脑微丝后，两种细胞中TrkB磷酸化水平从P10降到P20的年龄依赖性下调trkB。时间T1 −/−敲除小鼠和WT小鼠( 图4a-b ). 这些数据表明TrkB的发育增加。T1表达不能解释TrkB对BDNF反应性的发育性丧失。出乎意料的是，P10中的基础TrkB磷酸化水平trkB。时间T1 −/−与野生型小鼠相比，敲除的海马组织显著减少( 图4a ). 急性全身IMI治疗使成年WT和trkB。时间T1 −/−敲除小鼠( 图4c ).

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TrkB对体外BDNF和全身丙米嗪在trkB。时间T1 −/−老鼠。

BDNF诱导的(体外，50 ng/ml，5 min）从P10（a）或P20（b）野生型和trkB。时间T1 −/−KO幼犬。（c） Imipramine诱导的成年男性野生型和野生型TrkB磷酸化（Y816）（30 mg/g，i.p.，30 min）trkB。时间T1 −/−小鼠海马。双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）进行统计学分析**P（P）<0.01, ***P（P）与各自的对照组相比<0.001#P（P）与wt/对照组相比<0.05。CTRL栏表示每个年龄段的控制治疗。磷-TrkB值根据总TrkB水平进行标准化。n=每组3-5人。

细胞内cAMP和抗抑郁药对BDNF-TrkB信号的潜在促进作用

研究表明，环磷酸腺苷（cAMP）信号能够促进或“阻断”成熟海马神经元中BDNF诱导的TrkB信号在体外 [25].AD急剧增加[cAMP]i水平通过增强去甲肾上腺素（NE）和/或5-羟色胺（5-HT）的突触水平，随后可激活Gs连接的突触后受体。因此，我们接下来测试了IMI急性治疗是否可以恢复TrkB对BDNF的反应性体外成年海马。正如预期的那样，IMI治疗增加了海马中的pTrkB水平，但在应用BDNF时没有观察到进一步的磷酸化( 图5a ). 我们还决定直接测试cAMP对BDNF-TrkB信号的潜在促进作用体外使用细胞渗透性cAMP磷酸二酯酶抗性cAMP类似物sp-cAMP进行检测。在由P24小鼠海马体制备的微片中，BDNF仅略微增加TrkB的磷酸化状态，而sp-cAMP预培养并未进一步调节该反应( 图5b ).在P20小鼠幼鼠海马组织中观察到的基本相似的结果(数据未显示).

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TrkB对体外BDNF不会被抗抑郁药物或cAMP信号改变。

（a） 用丙咪嗪（Imi；30mg/kg i.p.，60 min）或生理盐水（Sal）对P60小鼠进行急性预处理，收集、切片并孵育海马体外在37°C下，加入或不加入BDNF（50 ng/ml）5分钟。用western blotting分析TrkB磷酸化（Y816）。（b） 将P24海马微片与载体或sp-cAMP（10µM）在37°C下预孵育15分钟，然后再暴露于BDNF（50 ng/ml）或37°C载体下15分钟。用western blotting分析TrkB磷酸化（Y705/6）。（c） 成年动物在饮用水中用赋形剂（Veh）或氟西汀（0.08mg/ml）慢性治疗21天，收集海马，切片并孵育体外在37°C下，加入或不加入BDNF（50 ng/ml）5分钟。用western blotting分析TrkB磷酸化（Y816）。磷-TrkB值根据总TrkB水平进行标准化。双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）进行统计学分析**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001. n=3-6/组。

用抗抑郁药氟西汀进行长期系统治疗已被证明可以重新打开成年啮齿动物大脑的发育样可塑性[26],[27]鉴于此，我们试图检测TrkB对BDNF的反应性体外用氟西汀（FLX）预处理成年小鼠脑微片的检测通过饮用水（0.08 mg/ml）21天[9],[28].与我们之前的调查结果一致[9]长期FLX治疗增加海马TrkB磷酸化，但当微丝与BDNF孵育时，pTrkB水平没有进一步增加( 图5c ).

BDNF在无细胞激酶检测中激活成人脑源性TrkB

我们使用了在体外无细胞激酶分析，以检查TrkB受体蛋白本身是否存在任何可能阻止BDNF结合并激活成熟脑组织中TrkB的结构修饰。当成人PFC和HC匀浆在存在三磷酸腺苷（ATP，100µM）的情况下进行激酶分析时，观察到对BDNF的反应中TrkB磷酸化明显增加( 图6a )表明来源于成人大脑的TrkB能够在无细胞条件下对BDNF产生反应。同样，当对P20海马组织进行激酶分析时，观察到对BDNF反应的TrkB磷酸化的强烈上调( 图6b ). 然而，在无细胞激酶试验中，ADs丙咪嗪和氟西汀没有引起TrkB磷酸化的任何增加( 图6b ). 当与P20脑微片直接孵育时，Imipramine和氟西汀也不能改变TrkB磷酸化体外化验，化验(图S3).

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BDNF（而非抗抑郁药物）在无细胞激酶分析中诱导TrkB磷酸化。

（a） 用BDNF（50 ng/ml）孵育成人皮层或海马脑裂解物可诱导Shc（Y515）的酪氨酸磷酸化和TrkB的磷脂酶-Cγ1（Y816）结合位点。*表明抗体检测到的未知磷酸蛋白。（b） BDNF（50 ng/ml）诱导P20小鼠海马裂解物中TrkB磷酸化，而不是丙咪嗪或氟西汀。使用磷酸化TrkB ELISA分析TrkB的总酪氨酸磷酸化。对于统计分析，先进行单因素方差分析，然后进行Bonferroni分析事后（post-hoc）进行试验***P（P）与各自的对照组相比<0.001###P（P）与ATP/控制相比<0.001。n=每组4个。

出生后早期或晚期抗抑郁药治疗后的差异性长期行为改变

研究表明，在出生后的生活中，啮齿类动物接触AD会引起情感行为的改变，这种改变在成年后很长一段时间内都很明显[15]–[17],[29],[30]因此，我们测试了TrkB对ADs反应性的生化变化是否会对成人行为产生不同的影响，以应对出生后的ADs治疗。幼犬接受生理盐水或每日剂量的AD氯丙咪嗪（CLO）治疗在出生后的两个不同时间窗口：出生后早期（E-PS，从P4到P9，当TrkB对AD没有反应时）和出生后晚期（L-PS，从P16到P21，当TrkB对AD有反应时）( 图7a ). 之所以选择CLO，是因为它在单次静脉注射后半衰期相对较短，而且它具有普遍的5-羟色胺作用。此外，Vogel及其同事广泛描述了早期CLO治疗的长期效果[15],[29]我们发现CLO以与IMI产生的类似的发育模式激活TrkB( 图7b ). 此外，在E-PS和L-PS过程中，CLO处理都不会使成年动物HC或PFC中的BDNF或pTrkB水平发生任何变化(数据未显示)这表明BDNF或TrkB水平的长期变化不能解释成年动物中观察到的行为表型。

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产后系统性氯丙咪嗪治疗可导致长期和独特的行为，具体取决于暴露时间。

（a） 显示治疗组的示意图。在出生后早期（P4-9；E-PS）或晚期（P16-21；L-PS），每天给动物服用氯丙咪嗪（20 mg/kg，i.p.）。在3个月大时，对动物进行行为分析（b）用氯丙咪嗪急性治疗（20 mg/g，i.p.，60 min）后，小鼠大脑中TrkB受体（Y816）的年龄依赖性磷酸化。（c） 出生后后期的氯丙咪嗪治疗（激活TrkB）会在明暗试验中产生类似焦虑的行为。（d） 出生后早期的氯丙咪嗪治疗（不会激活TrkB）会在新型抑制喂养任务中产生焦虑样行为。使用Bonferroni进行t检验（b）或双向方差分析事后（post-hoc）进行c–d检验进行统计分析*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）与各年龄盐水（Sal）治疗组相比<0.001。CTRL栏代表每个年龄段的每个控件。n=6/组（生化分析）或n=10-15组（行为分析）。

当我们测试3个月大的成年动物的行为时，我们发现早在行为测试之前，在E-PS或L-PS期间暴露于CLO的动物在探索性运动和焦虑相关行为方面表现出不同的变化，这些变化与AD治疗的年龄相关。具体地说，当药物在L-PS期间给药时，暴露于CLO治疗在光暗试验中产生了强烈的长期行为效应，而在E-PS期间则没有(表S1和 图7c ). 双向方差分析显示，出生后年龄与治疗交互作用对以下参数有显著的主要影响：黑暗中的距离（F[1,48]=8.94，p<0.05）、黑暗中的饲养（F[1.48]=12.74，p<0.01）、总饲养（F[1,48]=8.09，p<0.05），黑暗中的活动时间（F[1.4.8]=9.76，p<0.05）和总休息时间（F=1,48]=8.34，p<0.05），黑暗中的刻板印象F[1,48]=7.79，p<0.05）和总刻板印象（F[1,48]=8.53，p<0.05）。这个事后（post-hoc）试验表明，暴露于L-PS CLO的小鼠在光照下的时间显著增加（F[3,48]=3056，p<0.05， 图7c )，光照下的休息时间（F[3,48]=3025，p<0.05）和总休息时间（F[3,48]=3329，p<0.01）。另一方面，同样的动物在黑暗中的时间缩短（F[3,48]=3209，p<0.05），在光明中的距离缩短（F[3]48]=3001，p<0.05）、在黑暗中距离缩短（F[3,48]=3457，p<0.01），总行驶距离缩短（F[3,480]=2870，p<0.05， 图7c )，黑暗中饲养（F[3,48]=4332，p<0.01），总饲养量（F[3，48]=2850，p<0.05），黑暗中活动时间（F[4,48]=3195，p<0.01）， 图7c )黑暗中的定型数（F[3,48]=5082，p<0.01）和定型总数（F[3，48]=4464，p<0.01）。在光线下的进入次数、黑暗中的进入次数、总区域进入次数和黑暗潜伏期之间没有发现统计差异(表S1).

在新型抑制喂养（NSF）试验中，只有在E-PS期间服用CLO对成人行为有显著影响。在这个范例中，在一个新的环境中，给缺乏食物的小鼠一个食物颗粒，并测量接近食物的潜伏期[31]双向方差分析显示，对出生后年龄（F[1,48]=5560，p<0.05）和治疗（F[1.48]=4826，p<0.05）的影响具有统计学意义(表S1和 图7d ). 这个事后（post-hoc）试验表明，与同龄对照小鼠相比，E-PS中CLO处理的小鼠喂食潜伏期缩短（p<0.05）(表S1和 图7d ). 在对出生后年龄变量进行测试后，家庭笼子的食物摄入量显示出较小但显著的影响（F[1,48]=5266，p<0.05）(表S1)，但是事后（post-hoc）试验表明，对照组和CLO处理的动物之间并没有任何差异。在产后年龄和治疗测试前，两组之间的体重减轻情况没有差异(表S1).

讨论

在本研究中，我们观察到一种年龄依赖性的转换，从出生后早期容易被BDNF激活但不被AD激活的TrkB受体转换为由AD激活但对直接激活不太敏感的受体体外出生后晚期和成年期的BDNF刺激。这种发育转换前后的AD暴露对成年动物的运动和焦虑行为产生不同的长期影响。虽然TrkB对系统性ADs的反应性的出现与BDNF诱导的TrkB磷酸化的强烈降低在体外微丝不能作为因果关系的任何证据，人们很容易推测，导致AD反应性的相同成熟过程会导致发育变化，从而限制BDNF对TrkB的影响。

药理学上，AD，如本研究中使用的药物，与单胺再摄取泵结合并抑制单胺再摄取泵，从而增强单胺受体信号传导。虽然单胺能神经元是早期胚胎发育过程中产生的首批神经元，但这些细胞的完全成熟期超出了啮齿动物出生后的寿命[32],[33]此外，一些单胺能成分（受体、再摄取泵和酶）的表达和功能受到发育调控[32],[33]因此，本研究中给出的年龄特异性早期AD暴露所产生的长期和差异性行为改变可以用单胺能系统中正在进行的发育过程来解释，其中一些方面可以通过增强TrkB-PLCγ1-CREB信号在出生后期而非出生后早期进行调节。然而，这些发现需要谨慎解释，未来的研究需要在这些特定的发育时期对单胺能系统进行更具体的操作。

出生后晚期AD诱导的TrkB磷酸化具体发生在Y816（PLCγ1的结合位点），而不是Y515（Shc的结合位点[8],[18]因此，AD处理诱导磷酸化的PLCγ1与TrkB受体的相互作用和CREB的磷酸化，而不是Akt[9]，这与它们分别是PLCγ1和Shc途径的下游介体是一致的。有趣的是，IMI治疗引起的CREB激活遵循与pTrkB相同的发育时间过程。CREB被认为在AD药物反应中起关键作用[34]和pCREB序列133由多种信号途径诱导，包括PKA（蛋白激酶a）、Ca2+-钙调蛋白激酶II和有丝分裂原激活的蛋白激酶途径[35]通过G蛋白偶联单胺受体激活PKA通路被认为是CREB磷酸化对AD反应的一个中心机制[34]TrkB和CREB对AD反应性的发育时间过程紧密耦合，表明TrkB的激活是AD进行CREB磷酸化的先决条件。

我们在此确认并扩展了Knüsel之前报告的意外观察结果等 [13]证明了在BDNF存在下，从成年啮齿动物脑中制备的脑微丝培养未能诱导pTrkB反应，而从胚胎或出生后早期脑中制得的微丝中观察到了强烈的自身磷酸化。在相同条件下，一种密切相关的神经营养素NGF容易在成熟脑组织制备的脑微片中诱导其受体TrkA磷酸化，表明成熟组织中TrkB对BDNF反应性的显著降低与神经营养素外显率的降低或成人脑组织检测的一般不适用性无关。此外，BDNF缺陷小鼠出生后早期海马中的TrkB磷酸化基础状态显著降低，而与对照小鼠相比，BDNF-缺陷成年小鼠的pTrkB水平没有变化，之前也有报道[21].

此前有人认为，发育调节的TrkB截断增加。T1受体可作为全长TrkB的显性负性伴侣，可能解释TrkB对BDNF反应性的特异性降低。我们排除了这种可能性，因为海马TrkB受体对WT和trkB。时间T1 −/−老鼠。另一种可能的解释是，BDNF在成熟大脑中诱导TrkB激活的能力取决于额外的门控机制，如cAMP或腺苷[25],[36]为了测试这种可能性，我们研究了已知激活[cAMP]的系统性AD治疗我信号，可能促进或恢复BDNF激活TrkB的能力，但事实并非如此。此外，[cAMP]的直接上调我在中发送信号体外该试验未能促进成熟微丝中BDNF诱导的TrkB磷酸化。神经元网络的功能成熟和敏感期的关闭可能会改变TrkB对BDNF（和AD）的反应性。AD氟西汀的慢性治疗已被证明可以重新打开成年啮齿动物皮层的发育样可塑性[26]但这种治疗也未能促进TrkB对体外成年小鼠大脑中的BDNF。然而，无细胞TrkB激酶分析表明，TrkB蛋白本身似乎没有任何结构修饰，可以阻止受体与BDNF结合并被BDNF激活。

TrkB对BDNF（也对高浓度，参见[13])在中体外出生后早期的化验仍不清楚。虽然最近的证据表明缺乏BDNF对中枢神经系统皮层神经元的存活和结构只有轻微影响[37]然而，BDNF在成人中枢神经系统中具有特征性的作用。例如，BDNF的丧失对成年期产生明显的行为影响[20],[38],[39]此外，体内将BDNF注入成人大脑会增加TrkB磷酸化，尽管只有在相对较高的浓度下[40]，并根据注射部位产生不同的行为反应[10],[11],[41]并且这些影响中至少有一部分是被调节的通过TrkB公司[11]此外，我们观察到两组患者对AD的行为反应基本相同bdnf公司 +/−小鼠和小鼠体内过表达抑制形式的trkB型大脑中的（TrkB.T1）[8]，这显然意味着BDNF-TrkB信号在该响应中。因此，尽管造成这种差异的机制尚不清楚，需要进一步研究，但这些结果清楚地表明，TrkB反应性在小鼠2周左右大脑成熟期间发生变化。

先前的研究表明，啮齿动物在出生后早期发育过程中接触不同的抗抑郁药会产生长期的生化和行为影响，这种影响可以在药物从体内消失很久之后在成年动物身上观察到[15]–[17],[29],[30]鉴于TrkB在出生后对AD的不同发育反应性，我们试图研究在药物激活或不激活TrkB期间亚慢性CLO治疗产生的潜在长期行为改变（分别为P16-21或P4-9）。有趣的是，我们发现，在P4-9期间用CLO治疗的小鼠在新奇抑制喂养试验中表现出长期行为变化，而在P16-21期间治疗的动物中没有观察到这种变化。相反，明暗试验显示，只有在P16-21期间接受CLO治疗的小鼠出现了长期行为改变。

总之，我们目前的数据表明了一个有趣的假设，即在啮齿类动物中，TrkB在出生后成熟期对BDNF和ADs的反应性存在差异，并且这种调节可能对成年行为表型的发展产生重要影响。

材料和方法

动物

雄性C57BL/6JRccHsd小鼠（荷兰哈伦实验室），trkB。时间T1 −/− [24],Bdnf公司 +/− /Bdnf公司 −/− [19]或BDNF2L/2LCk-cre型 [20]他们的野生型室友被用于研究。动物在标准实验室条件下饲养（21°C，12小时明暗循环，早上6点开灯）。所有实验均按照神经科学学会的指南进行，并得到芬兰南部县行政委员会的特别批准（许可证：ESLH-2007-09085/Ym-23）。

实验设计

产后急性抗抑郁治疗

带着垃圾的水坝被单独安置。对于出生后的急性抗抑郁药物治疗，年龄匹配的幼崽（P5-21）被随机分配接受生理盐水（SAL）（NaCl 0.9%，5 ml/kg）、丙咪嗪（IMI）（HCl盐，溶于SAL，30 mg/kg，5 ml/kg；Sigma-Aldrich Finland Oy，赫尔辛基）或氯丙咪嗪（HCl盐，溶于SARL，20 mg/kg，5ml/kg；Simma-Aldrich）的腹腔注射如下所述，收集大时间（30–60分钟）海马和内侧前额叶皮层[9]简单地说，老鼠被一氧化碳惊呆了2之后，大脑很快被切除，双侧海马体和前额叶皮层被切开，放在一个干冰冷却的盘子上。样品在NP++缓冲液（300µl/样品；成分：137 mM NaCl、20 mM Tris、1%NP-40、10%甘油、48 mM NaF、H2O、 2×完全抑制剂混合物（罗氏）和2 mM Na三VO（旁白）4). 在冰上培养15分钟后，对样品进行离心分离（16100克，15分钟，+4°C），收集上清液进行进一步分析。

产后亚慢性氯丙咪嗪治疗

水坝和它们的垃圾被单独安置。将幼崽随机分为4组：生理盐水注射组（SAL）（NaCl 0.9%，5 ml/kg）和氯丙咪嗪注射组（CLO）（溶于SAL，20 mg/kg，5 ml/kg）[16]从出生后第4天（P4）开始到第9天（早期产后阶段，E-PS），从第16天到第21天（晚期产后阶段，L-PS）。每只幼崽称重并每天注射一次（上午9点至11点）。在治疗过程中，将垃圾从家中的笼子中移出，并与家中笼子的一些刨花一起放在桶中。在不到3分钟的时间内，随机注射属于一窝幼崽的所有幼崽。注射后，幼崽立即被放回家中的笼子。CLO治疗对幼崽和成年后期的体重增加没有任何显著影响(图S4).

在进行行为实验之前，用P22断奶小鼠，雄性小鼠被关在一起（4-6只/笼）。为了进行生化分析，在最后一次行为测试2周后将动物杀死，并按照之前的描述收集和处理其组织。

成人抗抑郁治疗

对于急性AD治疗，成年（～P90）小鼠接受单次静脉注射丙咪嗪（溶于SAL，30 mg/kg，5 ml/kg）或SAL，并在30分钟后死亡。对于慢性AD治疗，成年（～P90）小鼠可自由饮用自来水或0.08 mg/ml氟西汀溶液（FLX；HCl盐；芬兰图尔库Orion Pharma）21天[9],[28]在治疗的最后一天，动物被杀死。海马和前额叶皮层样本被快速解剖出来，并按照之前的描述进行处理。

体外试验

这个体外根据Knüsel进行BDNF刺激试验等 [13]稍作修改。解剖了不同年龄段的小鼠海马和内侧前额叶皮层。解剖后，将样品放在一张用冷的神经基底培养基（NBM）（神经基底培养液（Gibco）、2%B27补充剂（Gibco-）、0.5 mM谷氨酰胺（Gibco/）和青霉素/链霉素（Sigma）润湿的滤纸上，然后将组织切成大小相等的薄片。将切片转移到新鲜试管中，并用NBM+10%热灭活胎牛血清（FCS）（Gibco）清洗两次。用巴斯德吸管轻轻地将组织重新悬浮。移除培养基，并添加600µl NBM+10%FCS（含或不含BDNF（Peprotech）或NGF（Promega））。关闭试管，并在+37°C温度下孵育5或15分钟，轻轻摇晃。最后，将试管置于冰上，旋转，除去培养基，用PBS冲洗一次沉淀，然后将样品在NP++缓冲液中匀浆。在刺激BDNF之前，将一组样品在+37°C下与cAMP类似物sp-cAMP（10µM；Sigma-Aldrich）预培养15分钟。

TrkB激酶活性测定

根据Angeles描述的程序进行分析等 [42]进行了一些修改。每次分析的最终体积为20µL 50 mM Hepes，pH 7.4，140 mM NaCl，10 mM MnCl2，0.05%BSA，2%DMSO，含或不含100µM ATP和/或50 ng/mL BDNF。反应开始时，向混合物中添加40µg NP++裂解蛋白提取物，并在37°C下进行10分钟的培养。对于一部分样品，通过添加等体积的4×Laemmli样品缓冲液来终止反应，并通过SDS-PAGE分离蛋白质，通过western blotting分析TrkB磷酸化状态，如下所述。我们立即将剩下的样品转移到含有Trk抗体的ELISA（酶联免疫吸附试验）平板上，3%BSA/PBS-T（+2 mM Na三VO（旁白）4)已添加广告200µl，然后按照前面的描述进行磷酸化TrkB ELISA[18].

免疫沉淀和western印迹

使用Lowry方法（Bio-Rad DC蛋白质分析）测量样品蛋白质浓度。凝集素沉淀基本上如所述进行[9]使用小麦胚芽凝集素（EY Laboratories，San Matteo，CA，USA）。使用TrkB特异性抗体（5µl/样品；#AF1494，英国阿宾顿欧洲研发系统公司）在下述条件下进行TrkB免疫沉淀[9]在还原条件下在SDS-PAGE中分离蛋白质，并将其印在PDVF膜上（4°C下300 mA持续1 h）。膜与以下主要抗体孵育：抗p-TrkBY816年（1∶5000；M.Chao博士馈赠，美国纽约斯基尔贝尔研究所），抗p-TrkA/BY490/Y515（#9141；1∶2000；细胞信号技术（CST），马萨诸塞州，美国），抗p-TrkA/BY674-5/Y705-6型（1∶1000；CST），抗TrkB外面的（#610102；1∶2000；美国新泽西州富兰克林湖RD转导实验室），抗p-CREB第133节（#9198；1∶1000；CST）、抗CREB（sc-186；1∶100，圣克鲁斯生物技术（SCB），加利福尼亚州，美国）、抗p-AktThr308型（#9275；1∶2000，CST）、抗AKT（#4691；1∶1000，CSTY783型（#2821，1∶1000，CST）或抗Trk（#sc-11（兔子），1∶1000SCB）。此外，用TBS/0.01%吐温®（TBST）清洗膜，并用辣根过氧化物酶结合二级抗体（1∶10000，在无脂奶粉中，1 h，RT，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）孵育。在随后的TBST清洗后，使用电化学发光试剂盒（Amersham Biosciences）观察二次抗体，然后使用Fuji LAS-3000相机（芬兰万塔市Tamro Medlabs）进行ECL检测。

行为测试

行为测试系列[43]从P90开始，在成年雄性E-PS、L-PS和对照小鼠上进行。测试时间为上午9点至下午3点，每次测试间隔至少3天。探索性运动、抑郁和焦虑样行为通过以下测试进行评估：明暗测试、高架+迷宫、开阔场地测试、强迫游泳测试和新奇抑制进食测试。试验按此顺序在3周内进行[43]在所有这些试验中，只有光暗试验和新型抑制喂养试验在药物治疗组和生理盐水治疗组之间显示出统计上的显著差异，本手稿仅对这两项试验进行了更详细的描述。

光暗试验（LD）

在一个丙烯酸笼（28.5×28.5×20 cm）（TSE，Bad Homburg，Germany）中进行10分钟的测试，该笼分为两个大小相等的隔间：一个隔间有透明的墙壁，顶部敞开，光线明亮（由固定在地面以上55 cm的40 W灯泡提供约450 lx的照明），另一个由黑色塑料制成（通过红外线）盖上盖子。两个隔间由一个隔墙隔开，隔墙的中心在地板上有一个开口（7×5 cm）。将动物置于背离开口的光室中心，测量10分钟内进入黑暗区域的潜伏期、在光室中花费的时间、移动的总距离、静止时间和进入黑暗的次数。此外，还计算了饲养时间。在每只动物之前，使用70%乙醇彻底清洁测试仪器。

新奇-抑制Fedding

新颖性抑制喂养：新颖性抑制喂养（NSF）如前所述进行[30]简单地说，测试是在明亮的（800–900勒克斯）露天场地（51×35厘米）进行的。一小片滤纸和预先称重的食物颗粒放在场地中央。这些动物被剥夺了24小时的食物和可用的水随意在测试日，将每只动物从家中的笼子中取出，并在测试前将其放在笼子中30分钟，然后将其放在竞技场的一个角落。测量喂食开始的潜伏期（最大持续时间为5分钟）。开始喂食后，立即将老鼠从竞技场移走，将食物颗粒放在家中的笼子中，并允许喂食随意在5分钟的时间内，通过称重颗粒来量化所消耗的食物量。

数据分析

使用NIH ImageJ定量免疫印迹条带。所有数据均表示为平均值±SEM（平均值标准误差）和控制百分比。使用GraphPad Prism 4.0 for Windows（GraphPad-Software，San Diego California USA）进行统计分析。为了进行两组之间的比较，使用了双向Student t检验。使用重复测量的双向方差分析或双向方差分析来揭示Bonferroni之后因素的主要影响和相互作用事后（post-hoc）测试。显著性标准设定为p<0.05。

支持信息

图S1

丙咪嗪对发育过程中TrkB-Shc结合位点和Akt磷酸化的影响。（a） 急性丙咪嗪治疗（30 mg/kg，30 min，i.p.）后前额叶皮层（PFC）和海马（HC）TrkB-Shc结合位点（Y515）的磷酸化。（b） Akt（Thr）的磷酸化308)在前额叶皮层（PFC）和海马（HC）接受急性丙咪嗪治疗（30mg/kg，30min，i.p.）后。磷蛋白值根据相应的总蛋白水平进行标准化。结果表示为各自控制的百分比。在不同年龄的每个对照组和治疗组动物之间进行t检验。n=每组6-7人。

（畅通节能法）

图S2

急性BDNF刺激不能调节脑微丝中的总TrkB蛋白水平。显示对照组或BDNF刺激后P5-P60老年小鼠皮层（PFC）或海马（HC）微片中全长TrkB水平的代表性印迹。

（畅通节能法）

图S3

Imipramine和氟西汀不直接诱导海马微片TrkB磷酸化 体外 .将P20海马微片与载体或不同浓度的丙咪嗪（Imi；1-100µM）（a）或氟西汀（Flx；1-100μM）（b）在37°C孵育15分钟，并用western blotting分析TrkB磷酸化（Y705/6）。每组n=3。

（畅通节能法）

图S4

出生后氯丙咪嗪对小鼠增重的影响。出生后早期（P4-9；E-PS）或晚期（P16-21；L-PS）每日剂量的氯丙咪嗪（20 mg/kg，i.p.）或生理盐水在（P4-21）（A）或治疗后（P28-120）（b）期间的体重增加没有变化。n=每组10-15人。

（畅通节能法）

表S1

出生后使用氯丙咪嗪进行治疗会导致长期和独特的行为，这取决于早期接触期。出生后早期（出生后4-9天）和晚期（出生后16-21天）氯丙咪嗪治疗（20 mg/kg，静脉注射，每天一次）对成年（P90）动物暗盒试验和新奇抑制喂养试验中行为的影响。双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）进行统计学分析*P（P）<0.05, **P（P）<0.01. n=每组10-15人。

（DOCX）

致谢

作者感谢Dario Greco和Vootele Vöikar的评论和讨论。我们还要感谢Outi Nikkilä提供的宝贵技术援助，以及Sissi Pastell和Virpi Nousiainen对动物的照顾。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：本研究得到了芬兰科学院卓越中心项目（E.C.）、赫尔辛基生物技术和分子生物学研究生项目（L.V.）、Sigrid Juselius基金会（E.C。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

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