图2。

罗匹尼罗介导Akt激活。 A类，PH-Akt-GFP的D易位₂受体刺激。PC12-D（PC12-D）₂表达PH-Akt-GFP的R细胞（转染后48小时）用D刺激₂激动剂罗哌尼罗（1μ米)固定15min，用表观荧光显微镜检测PH-Akt-GFP的易位。罗匹尼罗刺激PH-Akt-GFP报告子在治疗后15分钟内移位到膜(右侧面板)。所示面板来自八个独立实验中的一个。B类，内源性Akt转位到细胞膜，以响应罗哌尼罗治疗。PC12-D（PC12-D）₂用罗哌尼罗（1μ米)在指定的时间段内，对磷酸化Ser进行免疫染色⁴⁷³Akt的(红色)DAPI作为细胞核的标记(蓝色)。磷酸化Akt的染色增强主要在罗哌尼罗处理15和30分钟后的细胞膜区域检测到。C类，罗哌啶醇处理细胞中磷酸化Akt的线强度分布。测量磷酸化-Ser质膜定位的相对增加⁴⁷³在Akt中，横切细胞但避开细胞核的线条轮廓用于评估荧光强度。使用ImageJ（NIH）对每组6至8个行细胞进行评估，以获得每个治疗组的平均荧光强度分布。注意，给药后15和30分钟，Akt明显从整个细胞的弥散分布转移到膜周定位。D类，Ser磷酸化⁴⁷³通过罗哌尼罗对Akt进行治疗。PC12-D（PC12-D）₂用1μ米罗哌尼罗用于指定的时间段。刺激后，制备细胞裂解物，并用抗磷酸化Akt（Ser⁴⁷³)抗体或带有抗Akt抗体。磷化氢-Akt(p-Akt公司)印迹被剥离并用抗β-肌动蛋白抗体重新处理。注意，罗匹尼罗在15分钟和30分钟诱导Akt磷酸化。E类定量结果显示罗哌尼罗治疗后磷酸化Akt水平的变化。图表显示了三个实验的平均值±S.D。Ser的磷酸化⁴⁷³Akt的比值计算为磷酸化Akt和总Akt之间的比值，并表示为治疗期之间的-倍差异。