波形蛋白的氨酰化₃₅₄与PIAS3抑制胶质瘤细胞迁移有关

摘要

简介

多形性胶质母细胞瘤（GBM）占美国所有原发性脑肿瘤的29%或每年新增5000例[1]. 这些肿瘤的浸润性生长模式妨碍了治疗性神经外科手术，并且没有任何治疗方式实质性改变了GBM患者的预后[2]. GBM通过主动细胞迁移传播，而不是通过被动血行传播[三-5]. GBM的一个主要特征是细胞的极端迁移潜能和地形扩散性，导致无法完全解剖GBM肿瘤[6]. 迫切需要新的有效治疗方法来治疗晚期和侵袭性GBM。

P（P）蛋白质我抑制剂A类激活的S公司周转时间三通过阻断STAT3的DNA结合活性和抑制STAT3介导的基因激活，首次将（PIAS3）鉴定为一种特异性抑制剂[7]. 新证据表明，PIAS3通过与ATBF1相互作用抑制STAT3介导的信号转导[8]. PIAS3还充当其他转录调节因子的结合蛋白，如雄激素受体、TIF2和NF-kappaB[9]. 最近的研究表明，PIAS3作为一种E3类连接酶，刺激小泛素样修饰物（SUMO）与靶蛋白的连接，这些靶蛋白在Wnt信号、p53信号和类固醇激素信号等重要的细胞途径中发挥作用[9,10].

PIAS3在体内外诱导前列腺癌细胞凋亡[11]. 当PIAS3在GBM细胞中过度表达时，观察到生长受到完全抑制，细胞迁移受到抑制[12]. 考虑到PIAS3的SUMO连接酶活性，一个明显的问题是PIAS3介导的凋亡/迁移途径调控因子的sumoylation是否参与抑制过程。为了表征GBM的极端迁移潜能，我们重点研究了PIAS3刺激的sumoylation对GBM细胞迁移的抑制作用。

结果

Ad/PIAS3抑制U373细胞迁移

当静止的GBM U373细胞被低滴度（5 pfu/cell）的Ad/PIAS3感染时，细胞形态发生改变，细胞变圆，失去突起（图​（图1A）。1安培). 如“人工伤口试验”所示，这是一个二维细胞运动系统[13]与Ad/EGFP感染的细胞相比，U373细胞迁移明显受到抑制（图​（图1A）。1安培). 运动抑制可以通过细胞数量的减少反映出来（图​（图1B）1B年)和缩短距离（对于igure，F聚合温度为72OC​图1C）1摄氏度)从人工伤害的源头移出。控制细胞向运动方向有很长的过程。相比之下，经Ad/PIAS处理的细胞形成的长过程很少（如果有的话），并且这些过程不会向前延伸。

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图1

Ad/PIAS3抑制U373细胞迁移

答：。汇合的U373细胞在起始处被切割和提升（箭头所示），并感染5 pfu/cell Ad/PIAS3。在指定的时间用相差显微镜拍摄迁移图像（原始放大倍数×10或×20）。图像大小为：420×210 nm用于24小时，420×315 nm用于48小时，840×630 nm用于72小时。

B。从原点迁移出去的细胞数量；C、。从原点迁移的细胞的中间距离。与对照细胞相比，Ad/PIAS3感染的细胞数量减少，迁移距离缩短（三个独立实验的平均值，Student t检验P<0.01）。

D。PIAS3促进U373细胞的sumoylation。收集24小时对照组（U373）、Ad/PIAS3感染组（+PIAS3）、EGFP-SUMO1瞬时转染组（+GFP-SUMO）和EGFP-SUMO1转染后Ad/PIAS3感染的U373细胞（+GFP-SUMO+PIAS2）的相控显微图像。荧光EGFP-SUMO1清楚地表明，PIAS3增加了SUMO1的表达和细胞核中EGFP-SSUMO融合蛋白的积累（分别位于下方的两个面板）。

为了检测PIAS3是否促进sumoylation，在感染U373细胞之前，用增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的SUMO1转染细胞。如图所示​图1D，1天，PIAS3确实促进了EGFP-SUMO1融合蛋白在细胞核中的积累，这反映在Ad/PIAS3处理的GBM细胞中绿色荧光强度的增加。

PIAS3促进Vimentin354 sumoylation

下一个问题是PIAS3刺激的sumoylation的分子靶点是什么，它在抑制GBM细胞运动中起着重要作用。PIAS3主要定位于细胞核[9,12]PIAS3刺激后，荧光EGFP-SUMO1积聚在细胞核内。与过表达tag-SUMO鉴定的大多数sumoylated蛋白不同，我们的目标是检查PIAS3对内源性SUMO的刺激作用。然后，用琼脂糖偶联SUMO1抗体（Santa Cruz）进行核蛋白免疫沉淀（IP）。如图所示​图2B，2B型在Ad/PIAS3感染细胞中，SUMO抗体可鉴定出两种最显著的蛋白质，分子量约为53kDa和86kDa，表明PIAS3确实促进核蛋白的内源性sumoylation。由于western blot结果的分辨率有限，我们无法通过SUMO-IP检测到更多的sumoylated但较少的蛋白质。

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图2

PIAS3刺激的波形蛋白的验证₃₅₄U373细胞细胞核中的sumoylation

答：。蛋白质鉴定的代表性纳米HPLC/MS/MS分析。完整的vimentine₃₅₄肽序列在顶部面板上给出。中间面板：凝胶切片胰蛋白酶消化物的纳米HPLC/MS/MS基峰色谱图，质量范围为53kDa；下面板：保留时间为63.2分钟的质谱图，以及波形蛋白特有的肽ILLAELEQLK的质谱图₃₅₄蛋白质。

B和C。用Ad/PIAS3感染静止细胞24小时，制备细胞溶质或核蛋白裂解物。然后对Ad/EGFP模拟对照（C）或Ad/PIAS3（P）感染的U373细胞中由SUMO抗体（nuclear IP）免疫沉淀的80%的核蛋白进行免疫印迹，以证明两种SUMO的运动性相同(B类)和波形蛋白₃₅₄(C类). 对50微克的细胞溶质和核蛋白进行印迹，以显示未修饰波形蛋白的分子量₃₅₄约41.5 kDa。D类.核波形蛋白的Sumoylation₃₅₄在Ad/PIAS3感染后的不同时间点。E类波形蛋白的比较₃₅₄和波形蛋白₄₆₆具有91%的同源性，每个都有一个丝杆结构域，对蛋白质相互作用至关重要。波形蛋白₃₅₄在N末端缺乏负责DNA结合的IF头部结构域。

切除聚丙烯酰胺凝胶上分离的考马斯蓝染色核IP蛋白带，并对凝胶中的蛋白质或琼脂糖珠上的整个IP产物进行胰蛋白酶化。然后通过高效液相色谱和质谱/质谱（HPLC-MS/MS）分析消化肽。令人惊讶的是，vimentin₃₅₄（登录号AAA61281）[14]在所有四个独立的SUMO-IP中进行鉴定，然后对两个MS岩芯进行MS-MS分析（图​（图2A）。2安培). 波形蛋白的分子量₃₅₄约为41.5 kDa，当被SUMO1（MW:11 kDa）修改时，应移至52.6 kDa。山羊抗波形蛋白抗体的Western blot证实了波形蛋白的sumoylation₃₅₄仅在核裂解物的IP产物中发现（图2B和C). 波形蛋白₄₆₆（登录号NP_003371，分子量53.6 kDa）也从约86 kDa的带中鉴定出，但山羊抗波形蛋白抗体无法识别。当SUMO-IP从不同时间点提取核蛋白时，通过western blot分析，波形蛋白₃₅₄发现随着Ad/PIAS3感染时间的延长而减少，48小时后降至检测不到的水平（图​（图2D第2天).

解散

波形蛋白已被用作GBM和星形细胞瘤的分子标记物[15-17]. 激光捕获微核检测的GBM细胞的基因表达谱显示肿瘤核心中波形蛋白水平较高[18]. 理论分析预测了两种高概率赖氨酸（K261和K201）和一种低概率赖氨碱（K111）[19]作为假定的SUMO站点。根据western blot上的分子量计算，只有一个SUMO附着在波形蛋白上₃₅₄，导致SUMO-IP上的主频带预计为53 kDa。波形蛋白的亚细胞定位₃₅₄经理论计算，其可靠性为76.7%[20]，这与我们的观察结果相吻合。与丰富的波形蛋白相比₄₆₆位于细胞核和细胞质中的核波形蛋白₃₅₄表达水平很低，因此，波形蛋白₃₅₄荧光免疫组化无法显示（数据未显示）。哺乳动物SUMO的C末端缺乏赖氨酸或精氨酸残基，这使得绘制sumoylation位点很困难[21]这可能解释了我们在MS/MS分析中未能识别SUMO肽的原因。

波形蛋白是细胞骨架和核膜的原始成分，属于间充质细胞中发现的III类中间丝（IF）。波形蛋白的从头表达经常参与上皮-间充质转化（EMT），与上皮细胞和癌细胞的侵袭/迁移特性增加相关[22]. 在前列腺癌细胞中，波形蛋白的表达水平与细胞运动性相关，大多数低分化癌症和骨转移瘤细胞中波形蛋白表达较高[23]. 当波形蛋白在实验中减少时，细胞的侵袭潜力可以在在体外基质侵入试验[24]. 波形蛋白在乳腺癌模型中的过度表达导致体外运动性和侵袭性增强，波形蛋白反义寡核苷酸可暂时下调其表达[25]. 利用体外创伤愈合模型，已经证明波形蛋白与乳腺上皮细胞的迁移状态短暂相关，并可能在功能上参与其迁移状态[26]. 我们的观察提示，sumoylation可能是去除功能性波形蛋白的另一种方式，从而抑制GBM细胞的运动。

与波形蛋白相比₄₆₆，波形蛋白₃₅₄在N末端缺少112个残基，代表IF头部（DNA结合）序列，该序列能够改变核结构和染色质分布。与波形蛋白具有91%的同源性₄₆₆（图​（图2E），第二版)，波形蛋白₃₅₄具有相同的B-Box型锌指、锌结合域、RING-finger（Really Interest New Gene）域，参与介导蛋白质相互作用，具有信号转导和发育等广泛功能。迁移与细胞形状和细胞骨架的力学密切相关。除了目前认为黏性流体状细胞质和弹性膜是主要承重元件的模型外，还提出了“硬线”跨膜受体、细胞骨架丝（包括波形蛋白）和核支架负责细胞形状控制的观点[27]. 波形蛋白₃₅₄可能作为细胞核中的末端连接分子来容纳整个IF网络，这对于支持细胞骨架的三维形状至关重要。

SUMO-1的翻译后修饰是真核细胞中一个高度保守的过程，在许多细胞过程中起着重要的调节作用。自从vimentin₃₅₄是PIAS3刺激后细胞核内源性sumoylation的主要靶点，可能在维持GBM细胞的正常细胞形状和运动中起关键作用。靶向细胞运动成分肌动蛋白已被提议用于对抗癌细胞迁移[28]. 我们的数据表明波形蛋白₃₅₄可添加到治疗靶点以对抗GBM。

材料和方法

致谢

脚注

参考文献