利用癌细胞脆弱性开发Ras驱动肿瘤的联合治疗

内质网应激诱导剂促进肿瘤消退体内但只有与雷帕霉素联合使用时

基于MPNST细胞对这些药物的超敏反应在体外，我们假设它们可能促进肿瘤退化。在Nf1/p53型肿瘤模型动物在～5个月内发生MPNST(Cichowski等人，1999年)肿瘤检测后平均存活10.7天(Johannessen等人，2008年). 对荷瘤动物使用载瘤剂、thapsigargin或雷帕霉素进行治疗(图1E). Thapsigargin表现出最小的疗效（红色条），并且不如雷帕霉素（黄色条）有效。鉴于观察到的塔必佳和雷帕霉素的细胞毒性和细胞抑制作用，这一发现出乎意料在体外(图1D和Johannessen等人，2008年). 然而，雷帕霉素/他司加金联用治疗引发肿瘤快速消退（绿色条；p=0.013）。肿瘤平均缩小45%；然而，一些肿瘤退行性>75%(图1F)剩余的肿块主要由出血和细胞碎片组成(图1G). 虽然在3天内检测到显著的肿瘤消退，但在10天内观察到最大疗效(图1F，G). 没有进行广泛的长期生存研究，因为老鼠经常抓挠或咬这些迅速缩小的损伤，导致溃疡，需要进行安乐死。然而，当动物成功治疗更长时间的肿瘤时，肿瘤并没有复发(图1F). 一只动物在肿瘤发生后存活107天，没有复发迹象，存活时间是对照动物的10倍以上(图1F、G). 当与雷帕霉素合用时，衣霉素也能诱导肿瘤消退，这与过度内质网应激是这种反应的关键驱动因素的结论一致(图S1).

HSP90抑制剂IPI-504与雷帕霉素协同作用促进肿瘤消退

虽然这些观察结果引人注目，但他司加金和衣霉素并不代表临床上可行的药物。HSP90抑制剂是另一类已知可诱导内质网应激的药物，目前正在临床上进行研究(临床试验.gov). HSP90通过折叠新合成和错误折叠的蛋白质、组装和分解蛋白质复合物以及分解蛋白质聚集体来维持蛋白质的稳态(Whitesell和Lindquist，2005年). HSP90还直接稳定UPR的两个关键压力敏感组件：IRE1和pPERK/PERK(Marcu等人，2002年). 因此，HSP90抑制剂有望通过两种协同机制促进癌细胞的内质网应激：第一，通过直接破坏这些已经受损的肿瘤细胞中的全局蛋白折叠，第二，通过失活UPR的两个臂提供的后续适应性反应。因此，我们评估了IPI-504的治疗效果，这是一种格尔德霉素衍生物17-AAG的盐酸对苯二酚盐(Sydor等人，2006年).

正如预测的那样，IPI-504快速诱导内质网应激并激活UPR，表现为在2-4小时内上调BiP、eIF2α、sXBP-1、IRE1和磷酸化PERK(图2A) (Healy等人，2009年). 然而，长期接触IPI-504导致IRE1和pPERK/PERK的不稳定(图2A). 因此，包括sXBP-1和pEIF2α在内的下游UPR信号如预期的那样在8小时内被灭活(Marcu等人，2002年)(图2A). 值得注意的是，不依赖于IRE1和PERK的BiP水平进一步升高了16小时，表明ER应激在两个阶段得到增强，以响应IPI-504(图2A) (Marcu等人，2002年). 与thapsigargin和突尼斯霉素类似，MPNST细胞对低剂量IPI-504敏感在体外(图2B、C).

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图2

雷帕霉素和IPI-504促进MPNST回归

（A）用IPI-504治疗的人MPNST中BIP、pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK随时间（小时）的免疫印迹。注意，pEIF2α、sXBP1、IRE1和PERK的激活（*表示活化的磷酸化PERK）和BIP的初始上调发生在2-4小时内。当pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK被抑制时，第二波BIP上调发生在8-16小时之间。Actin用作加载控件。（B）正常细胞（IMR90）、人MPNST细胞系（S462，SNF96.2）和小鼠MPNST电池系（185-3，1A50）对IPI-504（72小时）的反应LD50值。（C）不同浓度IPI-504处理的S462细胞株的生长曲线。（D）瀑布图描绘了使用载体（蓝色）、IPI-504（红色）、雷帕霉素（黄色）和雷帕霉素/IPI-504（绿色）治疗10天后的肿瘤生长。左y轴表示肿瘤折叠生长与第0天的对数2，右y轴表示折叠体积的变化。该表报告了每个治疗组（n=8）的平均值和标准偏差以及平均肿瘤收缩率。Shapiro-Wilk检验表明，所有数据集都具有正态分布。（E）MPNST的照片显示在用雷帕霉素/IPI-504治疗的第0天和10天后。（F）雷帕霉素/IPI-504治疗动物的H&E染色肿瘤。（G）Hsp70和磷酸化S6免疫印迹显示治疗16小时后肺组织的药效学分析。p120用作加载控制。（H）肿瘤治疗16小时的TUNEL染色。（一）肿瘤负荷的Kaplain-Meier曲线Nf1/p53基因如前所述，用载体（黑色）或雷帕霉素（蓝色）治疗突变小鼠。X表示由于皮肤溃疡而被安乐死的动物。所有错误栏均显示+/-SD。（另请参阅图S2)

使用之前制定的IPI-504给药计划(Douglas等人，2009年)，我们评估了该药物单独使用和与雷帕霉素联合使用的效果体内IPI-504与thapsigargin一样，不能作为单一药物促进肿瘤消退，但当与雷帕霉素联合使用时，它确实起到了促进作用(图2D)（p=0.001）。肿瘤平均缩小49%(图2D，绿色条）。肿瘤消退明显(图2E)组织学分析显示大量细胞死亡和碎片堆积(图2F).

通过测量HSP70水平来评估临床试验中对IPI-504的药效学反应，当HSP90被有效抑制时，HSP70会增加(Ramanathan等人，2007年). 确认目标抑制体内使用此读数(图2G). 雷帕霉素也有效抑制mTOR通路(图2G). 雷帕霉素/IPI-504治疗后，肿瘤在3-5天内出现最大程度的消退，根据体重、仪容或身体评分，在本研究过程中未观察到任何毒性(图S2). TUNEL染色在16小时内很明显，这在单独接触雷帕霉素或IPI-504的动物肿瘤中没有观察到(图2H). 为了模拟临床试验中使用的IPI-504剂量，每周给药一次，而不是两次，剂量为100mg/kg。这种治疗方案还促进了肿瘤缩小，显著延长了生存期(图2I)（p=8.9×10⁻⁵). 这种卡普兰-梅耶曲线可能低估了存活率，因为大多数动物因残留损伤部位的自我损伤而被安乐死（用Xs表示）(图2I). 治疗50天后，未观察到长期毒性。

IPI-504通过抑制HSP90和促进内质网应激调节其治疗作用

HSP90由一个以上的基因编码，极其丰富，并与20多个共同伴侣相互作用(Taipale等人，2010年). 因此，通过基因抑制单个基因来完全灭活HSP90活性是不可能的。然而，另外两种结构不同的HSP90抑制剂BEP800和AUY-922(Massey等人，2010年)以及17-AAG本身，杀死MPNST，诱导内质网应激，并以与IPI-504相同的动力学影响UPR(图3A、B、C和图S3A)证实这些药物都通过抑制HSP90发挥作用。

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图3

IPI-504诱导的细胞死亡是由于HSP90的抑制以及随后对UPR和ER应激的影响

（A）用两种不同的HSP90抑制剂（500nM IPI-504和500nM BEP800）处理的MPNST细胞系S462的生长曲线。（B）用HSP90抑制剂AUY-922（100nM）处理S462细胞72小时。左y轴表示肿瘤折叠变化与第0天的对数2，右y轴表示细胞数量与第0天相比较的相对变化。（C）免疫印迹显示AUY-922对人类MPNST细胞BIP、pEIF2α、sXBP-1、IRE1α和PERK随时间（小时）的影响。Actin用作加载控件。（D）在1μM IPI-504存在和不存在sXBP1（XBP1的激活剪接形式）过度表达的情况下，细胞死亡的相对水平。右侧面板确认sXBP1的表达。（E）在IRE1α和/或PERK被siRNA击倒的细胞中，低剂量IPI-504对生长曲线的反应。免疫印迹证实击倒。（F）用100nM IPI-504处理S462细胞72小时，有或没有雷帕霉素预处理（100nM）（左）或猛禽shRNA（右）。左侧y轴表示肿瘤折叠变化相对于第0天的log2，右侧y轴表示细胞数量相对于第0天的相对变化。（G）与雷帕霉素加IPI-504（300nM）相比，IRE1α和PERK联合敲除（含或不含雷帕霉素）后S462细胞的相对数量。（F）在暴露于载体（Veh）、IPI-504（IP）、雷帕霉素（R）和雷帕霉素/IPI-504（RIP）的小鼠中治疗16小时的动物肿瘤组织的pAKT/AKT免疫球。所有错误栏均显示+/-SD。（另请参阅图S3)

HSP90抑制剂增强内质网应激，三种不同的内质网胁迫诱导剂（IPI-504、thapsigargin、tunicamycin）诱导了相同的治疗反应，这一观察结果支持了IPI-505通过触发过度内质网压力来介导其作用的假设。为了正式说明这种可能性，我们评估了sXBP1的异位表达，这是一种下游UPR成分，可以减少内质网应激(Ozcan等人，2008年)，可能会减弱IPI-504的治疗效果。值得注意的是，sXBP1表达减少并延迟了IPI-504引起的细胞死亡(图3D). 相反，识别PERK和IRE1的siRNAs使MPNST对低于阈值剂量的IPI-504敏感(图3E). 这些数据共同表明，过度内质网应激在驱动治疗反应中起着因果作用。

雷帕霉素使MPNST对IPI-504致敏在体外就像它那样体内(图3F)TORC1的关键成分猛禽的基因消融也起到了同样的作用(图3F). 雷帕霉素还增强了PERK和IRE1 siRNAs的抑制作用(图3G). 然而，这种组合不如雷帕霉素和IPI-504有效，这与PERK和IRE1失稳有助于治疗反应的概念一致，但并不完全介导HSP90抑制的作用，HSP90对这些受损癌细胞中的蛋白质稳态具有更全面的影响。因此，遗传和化学研究均表明，IPI-504和雷帕霉素通过其预期靶点（HSP90和TORC1）发挥作用，内质网应激是治疗反应的重要介体。有趣的是，虽然蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以在专业分泌细胞（例如多发性骨髓瘤细胞）中诱导蛋白毒性应激，但硼替佐米未实质性诱导MPNST中的内质网应激，与雷帕霉素联合使用时也未促进肿瘤退退(图S3B)，进一步强调了内质网应激反应在介导观察到的治疗效果中的重要性。

mTOR抑制剂的临床疗效有限，这是由AKT激活引起的，AKT激活可通过抑制负反馈途径发生(Dancey等人，2009年). 然而，正如我们之前报道的那样，雷帕霉素在MPNST中没有诱导AKT激活体内(图3H) (Johannessen等人，2008年). 此外，雷帕霉素/IPI-504联合治疗并没有抑制AKT磷酸化或表达水平，这表明这种联合治疗并不更有效，因为它抑制了AKT(图3H). 然而，mTOR激酶抑制剂或双重PI3K/mTOR抑制剂仍有可能通过同时抑制这一既定的生存途径，与HSP90抑制剂协同作用，甚至更有效。

雷帕霉素和IPI-504引起MPNST内质网和线粒体的灾难性破坏体内

为了阐明雷帕霉素/IPI-504联合治疗的生物学后果，我们对MPNST进行了透射电镜观察体内在7小时内，雷帕霉素/IPI-504诱导了双膜囊泡的大量积聚(图4A)（n=5）。这些结构显示出自噬体的细胞特征，并含有可见的货物(图4B) (Klonsky等人，2008年). 内质网和线粒体都可以作为自噬体膜的来源(Hayashi Nishino等人，2009年;Yla-Anttila等人，2009年; Hailey等人）。我们检测到在雷帕霉素/IPI-504的作用下，两个细胞器中都出现了自噬体，其意义将在下文讨论(图4C). 自噬血管的出现可以由自噬诱导引起，也可以在生产性自噬受阻时发生(Klonsky等人，2008年). 然而，雷帕霉素/IPI-504诱导了这些肿瘤中p62/SQSTM1的降解，这是产生性自噬的结果(图4D) (Klonsky等人，2008年). 此外，雷帕霉素/IPI-504触发了MPNST中LC3表达点的快速增加，随后不久与溶菌体融合，表明自噬是诱导而非阻断的(图4E、F) (N'Diaye等人，2009年;Pankiv等人，2007年). 值得注意的是，过度内质网应激会激活自噬，自噬是降解未折叠蛋白聚集体的保护机制(Hotamisligil，2010年). 然而，虽然IPI-504和雷帕霉素都能诱导促进自噬的信号，但每种药物都无法单独诱导有效的自噬反应体内(图4A)这表明这些药剂在某种程度上起到了协同作用。

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图4

IPI-504和雷帕霉素引起MPNST内质网和线粒体的灾难性破坏

（A）载体、IPI-504、雷帕霉素或雷帕霉素/IPI-504治疗7小时后肿瘤的透射电镜（TEM）图像（5900×1.4×）。（B）用雷帕霉素/IPI-504治疗7小时肿瘤的TEM图像（15000×1.4×）。黑色箭头表示带有货物的双层自噬体。（C）用雷帕霉素/IPI-504处理7小时的肿瘤的TEM图像。黑色箭头显示自噬体从线粒体（左侧）和ER（右侧）发出。（D）（顶部）用载体（V）、IPI-504（I）、雷帕霉素（R）或雷帕霉素和IPI-505（RIP）处理的动物MPNST组织p62（SQSTM1）的免疫印迹。（下图）第二个免疫印迹显示RIP治疗的其他肿瘤中p62水平降低。（E）用mCherry-EGFP-LC3B感染S462细胞，并用100nM雷帕霉素和4μM IPI-504处理2和8小时。黄色/绿色斑点代表自噬体。红色斑点代表自噬溶酶体。（F）条形图表示雷帕霉素和IPI-504治疗0、2和8小时后自噬体（黄色条）和自噬溶酶体（红色条）的平均数量。（G）说明内质网应激、线粒体和活性氧生成之间相互作用的模型。（H）TEM显示暴露于载体、IPI-504、雷帕霉素或雷帕霉素/IPI-504的肿瘤中ER的相对大小。（一）TEM显示，雷帕霉素治疗的肿瘤（蓝色圆点）中存在大量内质网膜，而与雷帕霉素/IPI-504暴露16小时的肿瘤相比，这些肿瘤不可见。黑色箭头显示，雷帕霉素治疗的肿瘤中有一些自噬体，而雷帕霉素/IPI-504治疗的肿瘤则有许多。（J）TEM显示载体治疗肿瘤中的正常线粒体（蓝色箭头，左）与雷帕霉素/IPI-504治疗肿瘤中肿胀的囊泡化线粒体16小时（蓝色箭头（右））。图中左侧的线粒体被自噬体吞噬。（另请参见图S4)

为了研究这种协同作用，我们检测了MPNST中的ER和线粒体。值得注意的是，在内质网应激反应中，内质网和线粒体之间存在复杂的相互依赖关系(Malhotra和Kaufman，2007年) (图4G). 内质网应激触发钙离子内释放，促进线粒体膜去极化和活性氧的产生(Malhotra和Kaufman，2007年;Kim等人，2008年). 活性氧进一步促进蛋白质错误折叠，从而增强内质网应激。为了应对低水平的内质网应激，需要进行适应性反应；然而，当内质网应激水平变得不可逾越时，恶性循环随之发生，导致内质网、线粒体和细胞死亡的灾难性损害(Malhotra和Kaufman，2007年). 与雷帕霉素和IPI-504协同诱导无法解决的内质网应激的概念一致，我们在7小时内观察到内质网严重肿胀(图4H). 此外，我们检测到多泛素化蛋白聚集体的显著积累，这是在未折叠蛋白积累时发生的(图S4). 有趣的是，16小时后，在雷帕霉素/IPI-504治疗的肿瘤中几乎检测不到内质网膜(图4I)这表明内质网膜可能已被这些膜发出的过度持续自噬耗尽。最后，由于过度内质网应激最终会引发严重的线粒体损伤，16小时后线粒体肿胀、高度囊泡化，并被自噬体吞噬（线粒体吞噬）(图4J). 雷帕霉素/IPI-504联合治疗对自噬、内质网肿胀和破坏以及线粒体损伤的显著影响在所有检查过的肿瘤中观察到（每种情况≥5/5），而在暴露于单一药物的动物肿瘤中未检测到。

氧化应激在调节雷帕霉素和IPI-504的治疗反应中起着关键作用

这些观察结果表明，雷帕霉素和IPI-504通过诱导不可溶解的内质网应激、持续自噬以及内质网和线粒体的渐进性损伤，促进肿瘤退行(图4G). 由于活性氧被认为在助长这种恶性循环中起着关键作用，我们评估了治疗反应中对活性氧的需求在体外和体内重要的是，IPI-504触发了ROS生产(图5A)抗氧化剂维生素C抑制MPNST细胞死亡73%(图5B). 更引人注目的是，当小鼠预先服用维生素C时，雷帕霉素/IPI-504不再能够诱导肿瘤消退(图5C). 因为geldanamcyin衍生物除了对HSP90的作用外，还可以通过机制诱导ROS(Sreedhar等人，2003年)，我们评估了一种结构无关的HSP90抑制剂。值得注意的是，BEP800还导致活性氧产量增加(图S5A). 维生素C也将这种药物的治疗效果抑制了78%(图5D)，提供了额外的证据，证明ROS是对这类药物产生反应的细胞死亡的一般介质。

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图5

氧化应激在调节IPI-504和雷帕霉素的治疗反应中起着关键作用

（A）IPI-504诱导MPNST细胞活性氧水平的变化在体外。红线表示荧光强度的变化，反映活性氧的产生。（B）500nM IPI-504+/-100uM维生素C存在下的细胞死亡相对水平。（C）瀑布图描述了雷帕霉素/IPI-504治疗10天后的肿瘤生长，如图2（绿色）与雷帕霉素/IPI-504和维生素C（黑色）。左y轴表示肿瘤折叠生长与第0天的对数。（D）500nM BEP800+/-100uM维生素C引起的细胞死亡相对水平。（E）（前4幅）如图所示，使用PML抗体（绿色）对治疗7小时的肿瘤进行免疫细胞化学。（底部2个面板）冷冻MPNST肿瘤组织的二氢乙硫啶染色（红色）显示在治疗7小时后，ROS水平随着Rap/IPI-504的反应而增加。（F）IPI-504/Rap诱导S462细胞活性氧的动力学。（G）S462细胞对IPI-504/Rap的反应中ADP/ATP比率的动力学。请注意，ROS的产生先于ADP/ATP水平的增加（ATP的减少）。（H）如图所示，治疗7小时的动物肿瘤中的SREBP1 mRNA水平。（一）免疫印迹显示FASN、ACC和G6PD在治疗7h的动物肿瘤中的表达。Actin用作加载控件。（J）按照i。（K）用载体或雷帕霉素/IPI-504治疗的肿瘤中还原型谷胱甘肽（GSH）的相对水平（n-6）。（左）在体外表达G6PD或GFP控制质粒的细胞中，IPI-504引起的细胞死亡的相对水平。免疫印迹显示左侧面板中使用的MPNST中的G6PD蛋白水平。（另请参见图S5)

鉴于活性氧的重要性，我们研究了IPI-504和雷帕霉素是否可能通过增强氧化应激在这些肿瘤中发挥协同作用。PML已被提议为体内氧化应激传感器，因为它以活性氧依赖的方式与核体相关(Jeanne等人，2010年). 有趣的是，只有雷帕霉素/IPI-504治疗才能诱导MPNST中含有PML的核小体的形成(图5E)这表明雷帕霉素和IPI-504共同作用才能达到最大程度的氧化应激。这些结果通过使用二氢乙硫酸氢钠（DHE）测量肿瘤组织中的活性氧水平得到了证实，其中活性氧在治疗后7小时内升高(图5E). 此外，维生素C抑制了多泛素聚集体的积累(图S5B)核PML体的形成(图S5C)强大而持续的自噬反应(图S5D)内质网肿胀和破坏以及线粒体损伤(图S5E). 总之，这些结果表明氧化应激是治疗反应所必需的体内发现ER肿胀、蛋白质聚集和ROS生成均发生在治疗后7小时内（参见图4H,S4系列,5E、5F)在ATP耗尽和线粒体破坏之前(图5G和​和4J），4J型)，表明这些效应是由内质网应激触发的，不是线粒体代谢崩溃的次要后果。sXBP1抑制细胞死亡的观察进一步支持了这一结论(图3D).

雷帕霉素和IPI-504通过诱导ROS并同时抑制G6PD/谷胱甘肽抗氧化途径促进过度氧化应激

氧化应激是由活性氧生成和清除途径之间的不平衡引起的。鉴于IPI-504刺激ROS的产生，我们研究了雷帕霉素是否可能通过抑制内源性抗氧化剂来增强IPI-504的作用。由于谷胱甘肽（GSH）的高浓度和维持氧化还原状态的核心作用，其还原形式是最重要的内源性细胞抗氧化剂之一(梅斯特和安德森，1983年). 谷胱甘肽的减少依赖于NADPH，NADPH主要由戊糖磷酸途径（PPP）产生。PPP的第一种也是限速酶是葡萄糖6-磷酸脱氢酶（G6PD）。因此，G6PD通过其对谷胱甘肽生成的影响，在保护细胞免受氧化应激方面发挥着公认的作用(Pandolfi等人，1995年; Xu等人；Efferth等人，2006年). 观察到G6PD的低形态突变是蚕豆症的基础，它会导致接触蚕豆和其他氧化应激源的受影响个体出现急性溶血性贫血，这一发现突显了G6PD在这一途径中的重要性(贝尔西，1973年). 有趣的是，G6PD和mTOR通路之间的直接联系最近已经建立。具体来说，G6PD的表达可以被mTOR抑制剂抑制在体外，通过对转录因子SREBP1的抑制作用(Duvel等人，2010年). 因此，我们检测了MPNST中该通路的成分（SREBP1、G6PD、GSH）。

与细胞研究显示SREPB1受mTOR调节一致(Duvel等人，2010年;Porstmann等人，2008年)雷帕霉素显著降低已知SREBP靶点的表达，包括SREBP1号机组自身，自动控制和FASN，体内7小时内(图5H，I). IPI-504对SREBP1号机组但两种药剂一起减少了SREBP1号机组92%的表达，并有效抑制自动控制和FASN公司(图5H，I). 雷帕霉素也被有效抑制G6PD公司MPNST肿瘤组织中的mRNA水平(图5J). 然而，雷帕霉素单独对G6PD蛋白水平的影响并不一致(图5I)可能反映了G6PD蛋白在这一短时间内周转较慢。然而，雷帕霉素和IPI-504一起显著抑制了两者第6页MPNST的mRNA和蛋白表达体内(图5I，J). 因此，雷帕霉素/IPI-504使这些肿瘤中还原型谷胱甘肽水平降低了34%(图5K，p=0.003）。谷胱甘肽的这种下降幅度尤其显著，因为受蚕豆中毒影响的个体红细胞中谷胱甘氨酸的平均减少率同样为34%，这使这些细胞对氧化应激源敏感，导致严重的蛋白质错误折叠和蛋白质聚集形成(Szeinberg等人，1958年). 最后，为了从遗传学上证实G6PD在保护肿瘤细胞免受IPI-504诱导的氧化应激中发挥作用，我们在MPNST中体外表达了G6PD。重要的是，G6PD将IPI-504诱导的MPNST细胞死亡抑制50%(图5L). 综上所述，这些数据表明，雷帕霉素和IPI-504通过促进过度氧化应激而协同作用，这是IPI-505诱导ROS生成和雷帕霉素依赖性抑制G6PD和GSH的结果。

实时PCR

使用液氮冷却的Bessman组织粉碎机粉碎组织，并将其溶解在Trizol试剂（Invitrogen）中。RNA用DNaseI（Roche）处理，并使用qScript逆转录酶试剂盒（Quanta）逆转录。使用PerfeCTa SYBR Green试剂盒（Quanta）对以下基因进行实时PCR分析：小鼠G6PDx公司（5′-cctaccatctggtggctgtt-3′5′-tggctttaaagaaggctca-3′）；人类G6PD公司（5′-aagaacgtgaagactccctga-3′5′-aatataggatgggcttgg-3′）；鼠标SREBP1号机组（5′-gatcaagaggacaggc-3′5′-tagatgggctgctgagtg-3′）；人类SREBP1号机组（5′-tgcatttgacaccttc-3′-5′-caagctgtacctcc-3′）。

RNA干扰

非靶向siRNA和针对PERK的siRNA分别从Dharmacon购买（D-001810-10-05和L-004883-00）；靶向IREα的siRNA（Qiagen，S100605248）。使用来自Invitrogen的脂质体RNAiMAX转染siRNA。使用包含以下shRNA（5′-CGACTACACATCTCTCTCCGTGTA-3′）的慢病毒pLKO载体靶向猛禽。

免疫荧光

组织用福尔马林固定，石蜡包埋。遵循标准免疫荧光方案。通过将载玻片在10mM柠檬酸盐（pH 6）中煮沸10分钟，然后冷却30分钟，进行抗原揭开。在含有5%血清和0.3%Triton X-100的1×PBS中进行阻断和杂交。抗体以1:250稀释。

TUNEL染色、ROS检测、GSH分析和ADP/ATP比率

使用ApopTag荧光素原位凋亡检测试剂盒（Millipore）进行TUNEL染色。在体外通过MitoSOX红（M36008）和在快速冷冻肿瘤切片（D11347）中通过二氢乙锭染色评估活性氧物种（均为Invitrogen）。使用GSH-glo谷胱甘肽测定试剂盒（Promega，V6911）测量GSH。使用ApoSENSOR ADP/ATP比值测定试剂盒（K255-200）（Biovision）测定ADP/ATP比率。

构件

将人G6PD（Open Biosystems）和小鼠sXBP-1克隆到pLenti CMV/TO Puro载体中。pBabe-puro mCherry-EGFP-LC3B构建物来自Addgene。如前所述进行慢病毒和逆转录病毒感染(Johannessen等人，2005年).

药物治疗和给药时间表

根据NIH实验动物护理和使用协会和动物福利法案，动物程序由哈佛医学院动物和比较医学中心批准。每周服用一次或两次IPI-504（100mg/kg）。每周给药两次Thapsigargin（0.2mg/kg）和tunicamycin（0.2g/kg）。雷帕霉素每日给药5mg/kg(Johannessen等人，2008年). 按顺序给药组合中的化合物。在IP注射雷帕霉素和IPI-504之前，小鼠每天口服40mg/kg维生素C。

肿瘤体积测量

相对长度单位

在单次给药7和16小时后，固定肿瘤组织进行EM检查，并根据标准EM技术进行进一步处理（Barth等人）。

我们感谢Wade Harper、Steve Elledge、Nathanel Gray、Heather Harding和Hugues de Thé的有益讨论。这项工作得到了NCI KC:（CA129814）和DF/HCC路德维希中心的支持；KWW：（CA122794，CA140594）。TD是儿童肿瘤基金会青年研究员奖的获得者。OM是佛兰德斯研究基金会的博士后研究员。