癌症诊断的下一代测序：一个实用的观点

第二代测序平台

目前有三家公司提供第二代测序平台：罗氏、Illumina和生命科技。每家公司进入市场时都考虑到了大规模仪器和最大产量，以满足研究市场的需求，该市场需要高通量技术来实现基于发现的应用和全基因组测序潜力。罗氏公司是第一个进入市场的公司，从其创始人乔纳森·罗斯伯格手中收购了454生命科学公司。罗氏454平台与其他两个读取长度较长的大型平台不同，这两个平台现在接近桑格测序平台（700–1000碱基对（bp））。然而，即使是最大容量的454仪器（454 FLX+）的总序列输出也远低于Illumina（HiSeq）和Life Technologies（SOLiD 5500），后者产生更多序列读取，但长度要短得多。最近，随着罗氏454 Junior、Life Technologies Ion Torrent和即将发布的Illumina MiSeq的推出，人们的注意力转向了小型低成本仪器，它们非常适合小型研究和诊断应用。关于当前可用或即将发布的仪器及其性能的简要总结，请参见表1但我们也建议读者参考当前测序平台、其规格和成本明细的更全面的综述，以了解更多详细信息。¹⁷

第二代测序器依赖于两个原理：基于聚合酶的克隆复制单个DNA分子在固体支撑基质（珠状或平面）上的空间分离和循环测序化学。每个平台都由用于实现这两个过程的方法定义。所有平台都有类似的前端库准备方法，包括将通用适配器序列添加到DNA片段的末端。这些寡核苷酸适配器是用于扩增文库的PCR引物的补充，寡核苷酸固定为克隆DNA扩增的坚实支撑。罗氏（454）和生命科技（SOLiD 5500和Ion Torrent）都使用乳液PCR（emPCR）在珠子上生成克隆DNA片段。¹⁸在水和油的乳液中，以精确的浓度添加珠子和模板，使每个乳液滴可能包含单个珠子和单个DNA分子。emPCR后，乳状液被破坏，模板携带珠被富集，然后沉积到单独的“微阱”中或结合到衍生的玻璃流动池中。^19,20Illumina采用另一种策略，通过桥接PCR直接在流动细胞上创建DNA簇。²¹从实践的角度来看，每种方法都有优点和缺点。emPCR的过程是劳动密集型的，尽管每家公司都开发了自动化技术，以部分减轻这一过程的劳动负担。桥式PCR的聚类生成已经完全自动化，因此更加简化。事实上，MiSeq工具从集群生成到数据分析都不需要用户干预，从流程角度来看，这非常有吸引力。Illumina bridge PCR的潜在缺点是，在测序开始之前，不知道簇生成的成功，如果簇生成失败，这是一项代价高昂的工作。根据我们的经验，如果测序文库具有高质量，并且文库的浓度通过定量PCR准确测量，则聚类生成通常是相当稳健的。

每个可用平台都使用不同的测序化学和方法进行信号检测。所有454个平台均采用焦磷酸测序，化学发光信号指示碱结合，信号强度与通过均聚物读数结合的碱数量相关。²²Ion Torrent使用了类似的顺序合成（SBS）策略，但通过核苷酸掺入期间DNA聚合酶活性产生的氢离子释放来检测信号。本质上，离子激流芯片是一种非常灵敏的pH计。每个离子芯片包含数百万个离子敏感场效应晶体管（ISFET）传感器，可以并行检测多个测序反应。²³最近有报道称，罗氏公司将通过英国公司DNA Electronics的许可证，采用与Ion Torrent类似的检测方法，这将使454和Ion Tortent平台基本相同。²⁴半导体技术的优点是，仪器、芯片和试剂的制造成本很低，测序过程很快（尽管emPCR无法满足要求），系统具有可扩展性，尽管这可能受到emPCR所用珠粒大小的限制。²⁵454和Ion Torrent使用的SBS化学成分也有利于更长的读取时间。离子激流目前仅限于比罗氏454短得多的碎片，但未来版本可能会有所改进。两者都有一个共同的问题，即均聚物序列错误表现为虚假插入或删除（indels）。微调检测和分析软件是否能改善这一问题尚待观察。

Illumina和Life Technology SOLiD 5500平台均被视为短读测序器，但采用的测序化学方法截然不同。Illumina使用可逆染料终止剂SBS化学，包括单碱掺入、成像和终止剂化学的分解的迭代循环。SOLiD使用结扎测序（SBL），包括重复的寡聚结扎延伸轮，这就是名称的来源(S公司按…排序O（运行）利戈语L（左）诉讼D类检测）。大规模平行测序背景下的SBL原理最初由Church及其同事描述。²⁶SBL过程基本上通过二核苷酸编码对每个碱基进行两次测量，二核苷酸编码被转换为“颜色空间”而不是传统的碱基空间。5500线仪器提供的新型“精确通话化学”使用三基编码，可实现更高的准确性和实际通话。Illumina SBS在读取长度方面略优于SOLiD SBL，现在HiSeq的读取长度高达100 bp，其他Illuminia仪器的读取长度为150 bp。SOLiD SBL化学试剂的最大读取长度为75 bp，但与Illumina化学试剂相比，两个或三个碱基编码的准确性更高。Illumina和SOLiD平台都具有配对或配对功能，能够从单个克隆片段的两端生成读取，Roche 454平台也是如此。

DNA文库制备

无论采用何种技术，所有NGS平台都遵循类似的分子协议来准备测序库。虽然标准的图书馆准备不需要任何专用设备，但有许多辅助仪器可以帮助图书馆准备过程(表3). 为了制备“霰弹枪”片段，DNA通过机械或酶消化进行剪切，以产生所需大小范围内的片段大小。然后，使用一系列酶步骤修复库DNA末端，并连接与珠状细胞或流细胞上的寡核苷酸互补的常见适配器。图书馆制备试剂由主要NGS供应商以试剂盒的形式提供，也可通过第三方公司获得。传统片段库制备的一种相对较新的替代方法包括在体外转座法（Nextera、Epicenter/Illumina），无需进行机械剪切和多种酶和纯化步骤。PCR通常用于在测序之前扩增文库，然而，为了避免可能导致假阳性测序错误的过多PCR重复，周期数通常会受到限制。PCR和通用适配器序列的使用带来了库之间交叉污染的高风险，因此PCR前和PCR后工作区的标准原则至关重要。DNA文库的大小选择可能有助于分析和标准化簇大小。传统上，尺寸选择是使用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行的，然而，也可以使用新的自动化方法。最后，高吞吐量的库准备可以自动化，目前有几种商业解决方案可用。

排序要求

为了克服NGS平台与传统Sanger测序相比的较高错误率，需要高水平的冗余或序列覆盖来准确调用基。通常，准确的碱基调用需要30–50倍的覆盖率，尽管这可能因测序平台的准确性、变体检测方法和测序材料的不同而有所不同。³³使用Illumina HiSeq仪器，使用新的V3测序试剂对二倍体基因组或流动细胞的三条通道进行测序需要大约100 Gb的序列数据。SOLiD 5500平台上可能需要更少的覆盖范围，因为双基编码可以实现更高的读取精度。如果正常组织污染和某些癌症的异质性可以将序列数据中的变异等位基因表达降低到远低于二倍体杂合子呼叫预期的50%的频率，那么对癌症基因组的查询可能需要更深入的研究。

测序前的目标富集可以降低成本，提高对感兴趣区域的覆盖率，并可能简化NGS数据的生物信息学解释。目标应用程序所需的测序量最终取决于方法和目标区域大小。例如，对于整个外显子组测序（针对所有带注释的编码基因），需要大约10–12 Gb的数据，对于80–90%的目标碱基，实现平均100倍覆盖率和至少20倍覆盖率。按照当前规范，这意味着HiSeq仪器上每个流动池最多可以运行32个外显子，SOLiD 5500上可能具有类似的吞吐量。较小的测序仪器，如MiSeq，产生的数据要少得多（~1Gb），因此适用于较小的靶向测序应用，在这种应用中，一次最多可以测序几百个基因。

靶向DNA测序

在研究和临床诊断领域，有针对性的浓缩策略正在被纳入NGS。文献中描述了各种方法和技术，其中大多数现在可以作为商业产品购买(表4). 在比较这些方法时，需要考虑几个因素。从技术角度来看，捕获的保真度很重要。非靶向富集和捕获的低均匀性意味着需要更多测序才能获得所有靶区的足够序列深度。不同的捕获方法也会受到样本质量和捕获区域内存在的变体的影响。可扩展性、吞吐量和易用性对于高吞吐量来说很重要，而目标区域大小可能决定哪种方法最合适。最后，对专用设备的需求和试剂价格也是关键考虑因素。

靶向富集方法大致分为两类：PCR-扩增子和杂交捕获方法。由于基于PCR的方法已经在诊断实验室中常规使用，因此它们与现有的诊断工作流程非常吻合。PCR具有很高的特异性，与比较杂交方法相比，PCR具有产生更均匀覆盖率的优势，前提是单个PCR产物的浓度在汇集和测序之前已充分标准化。PCR扩增文库的生成采用了不同的策略。一些人使用PCR产物的串联来生成片段库；剪切PCR连接子并送入鸟枪文库准备。与长阅读测序仪器兼容的一个更简单的协议是将序列适配器合并到PCR引物的5′端，从而实现扩增子池和直接测序。常规PCR方法显然更适合针对少数区域，因为检测较大区域所需的物流、成本和DNA数量可能会令人望而却步。

长范围PCR（LR-PCR）可以减少生成数十个PCR引物集的负担，以跨感兴趣区域进行扩增，并已被用于靶向邻近区域或跨几个外显子区域进行扩增。不均匀覆盖可能是使用LR-PCR的一个问题，尽管已经描述了一些补救措施。³⁴长扩增子的产生也可能容易出现重复性问题，并且天生不适合使用降解的DNA，例如来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）材料的DNA。此外，无论测序平台如何，在PCR后生成鸟枪测序文库的需要都会带来进一步的工作、费用以及失败和污染的潜在风险。

扩展基于PCR的序列富集的关键在于PCR反应的自动化、小型化和多路复用。所有这些方法都旨在增加PCR的规模，使数百至数千个PCR反应成为可能，同时最大限度地减少试剂的使用、劳动力负担和所需的DNA模板数量。两个商用平台实现了微流体微型PCR。Fluidigm是一种基于微流体的方法，使用多层软光刻技术（MSL）。³⁵微流体电路由软橡胶复合材料制成，通过使用压力在电路和PCR反应室中创建微型阀门，可以控制试剂的流动。Fluidigm最初是为实时定量PCR和单核苷酸多态性（SNP）基因分型应用而开发的，但最近发布了Access Array，允许检索PCR产物以用于目标重测序应用。当前的Access Array系统能够通过48次单复合物分析对48个样本进行并行PCR反应。该平台的一个吸引人的方面是需要相对少量的模板（～50 ng/样品）。分析也可以多路进行，以提高吞吐量。此外，与许多靶向方法一样，索引或条形码标签可以被结合到PCR产物的通用适配器区域中，从而能够在直接测序之前汇集样本。

第二个平台，RainStorm（Raindance Technologies）³⁶)包括在油乳剂中生成微滴，然后作为PCR的微型反应室。³⁷使用微流控芯片设计和高压泵相结合，可以生成高度均匀的微滴，其中包含反应成分（PCR引物和DNA模板）。数千个反应剂发光的微液滴被加载到一个微流体装置中，该装置具有稳定的油流，在emPCR扩增和扩增产物提取之前，它们可以通过使用电磁场的通道进行合并和操作。最近，这种方法已上市，用于从FFPE组织中提取DNA。这项技术目前的局限性是需要相对大量的DNA以及对单个样本的顺序处理。

替代微型化和微流体操作的方法是使用能够实现高度多重PCR的方法。其中一种方法使用分子反转探针（MIP）。MIP是一种由序列特异性引物末端组成的长寡核苷酸，由通用连接子序列连接。靶向特异性引物末端与感兴趣区域两侧的互补DNA杂交。聚合酶延伸然后结扎导致MIP循环。捕获的区域然后通过滚动圈扩增或通过PCR从连接子区域内的通用PCR启动位点进行扩增。^38,39该检测最初描述为针对相对较少数量（10）的基因扩增外显子。然而，该方法后来被证明具有高度可扩展性，通过使用可编程微阵列，可以生成针对多达50000个外显子区域的MIP池。^40,41然而，MIP的缺点是，与基于杂交的富集相比，它们的捕获均匀性较差，并且对于低吞吐量或定制应用来说，它们可能很昂贵，因为目前没有商业试剂可用。

Illumina开发了一种原则上与MIP类似的方法，预计将于2011年发布（个人通信，Illumiana Australia）。“TruSeq Amplicon”方法源自Illumina“金门基因分型”分析所用的方法。不使用MIP，而是将两个独立的左侧和右侧寡核苷酸与基因组DNA模板杂交，从而实现聚合酶延伸和连接。与MIP一样，侧翼寡核苷酸包含跳出PCR和通用条形码Illumina适配器结合的通用序列。根据供应商（Illumina）的说法，一次反应最多可扩增384个靶点。理论上，捕获具有很强的可扩展性，因为所有步骤都可以在96 well PCR板中进行，并且可以通过液体处理实现自动化。该方法的详细性能规范目前尚不清楚。

通过杂交捕获的靶向富集已广泛应用于研究环境中，通常适合捕获数百个基因的较大靶区和外显子。针对互补靶区设计的寡核苷酸被用作探针或“诱饵”，以杂交和捕获预先准备好的猎枪库中的目标DNA或“猎物”。⁴²大多数方法使用微阵列就地寡核苷酸合成以产生诱饵文库（例如Agilent、Roche Nimblegen、Rivia），而Illumina使用其大规模寡核苷酸生产设施通过传统的基于柱的合成来产生长寡核苷酸。微阵列本身可以用作捕获设备，也可以将序列从阵列中分离出来，以生成溶液中的诱饵库。⁴³由于过程的可扩展性、更大捕获区域的更好性能以及不需要专用设备，溶液捕获方法得到了更广泛的应用。⁴⁴杂交富集的优点是能够在单管分析中轻松捕获大区域，并且它已成为研究“外显子”富集重测序的主要方法。^45–48除了用于常见应用的现成试剂外，所有公司现在都提供定制诱饵库的设计服务，这意味着快速周转和具有价格竞争力的市场。杂交捕获的缺点是由于交叉杂交和捕获的不一致性而缺乏特异性（与PCR相比），这与靶序列的GC含量有关。除了高通量自动化的优化方法外，还描述了对该方法的改进，有助于克服其中一些问题。⁴⁹

RNA测序

RNA测序（RNA-seq）的应用是快速取代微阵列技术的一种方法，它提供了卓越的数字读数，同时还能够发现新的剪接形式、转录物和RNA编辑。⁵⁰来自RNA-seq的定量基因表达数据与微阵列的数据相当，但对于低表达转录物具有更好的动态范围和更低的检测限。⁵¹然而，分析RNA-seq数据差异表达的方法仍在解决中，这让人想起了微阵列数据归一化和统计分析中遇到的最初问题。⁵²基因表达微阵列作为一种癌症诊断和预后工具的临床应用已经得到证实，包括识别未知原发癌的组织起源以及预测早期乳腺癌和结直肠癌的复发。^53–55虽然RNA-seq是否可以取代微阵列或定量PCR作为临床检测仍有待观察，但直觉似乎认为，如果技术变得更便宜、更稳健，这可能发生。

RNA-seq也已被应用于突变检测，并且已被证明特别适用于检测由基因组易位引起的基因融合。⁵⁶通过基因组DNA测序从RNA-seq数据中调用变体的一个优点是，数据同时提供关于变体或融合产物的功能信息。然而，基因之间的动态表达范围很大，使得很难获得足够的序列覆盖率来准确调用变体，而不必为每个样本生成大量数据。cDNA文库的靶向杂交捕获，类似于DNA测序所用的杂交捕获，最近被证明可以提高从RNA-seq数据中检测序列变异和融合产物的灵敏度。⁵⁷在突变检测中，RNA测序优于DNA测序的任何优点尚待证明。然而，从单个细胞中获得的RNA转录副本数量越多，这可能表明基于RNA的方法可能比询问DNA的方法更敏感。

分析管道方面

每个平台的主要数据输出基本上包括一个文本文件，其中包含原始序列读取以及每个基的质量分数。每个测序平台都有自己的专有分析软件，用于调用碱基并生成相关的质量指标。还开发了独立的基站呼叫算法和软件工具，以提高基站呼叫精度并减少系统错误，⁶⁹尽管对于普通用户来说，这些第三方软件不太可能被考虑。虽然无法在测序平台之间直接比较质量分数，但它们通常都使用Phred-like分数，该分数与底牌错误概率呈对数关系。^70,71分配给基础的质量分数与检测置信度有关，影响基础质量的个别因素由每种测序技术的细微差别决定。基本质量在接近读取结束时往往会恶化，因此可能需要修剪低质量的结束以提高整体数据质量(图1B). 每个平台提供的软件通常会提供一份总体运行质量报告，同时使用第三方工具（例如FastQC）进行质量评估⁷²)也经常使用。

较短的读取时间、较高的错误率和庞大的数据规模意味着需要特定的方法来进行NGS读取校准。存在许多对齐算法，其中一些最流行的算法是BWA、MAQ、Bowtie和Novoalign，^73–76而大多数商业软件都开发了自己的专有算法。与MAQ和Bowtie等非间隙对准器相比，BWA和Novoalign等间隙对准器更适合于变异检测，因为它们可以实现indel检测，并且不太容易调用indel周围的假阳性SNV(图1C). 算法之间存在性能差异，通常在速度和准确性之间进行权衡。⁷⁷一旦比对完成，就会生成序列比对图（SAM或二进制格式BAM），可用于在IGV等基因组浏览器中可视化序列读取。⁷⁸商业解决方案可能在软件包中内置一个基因组浏览器，在分析过程中生成的中间文件通常对用户隐藏。

与对齐一样，有许多程序可用于变量调用，其中最常用的是Samtools、GATK Unified Genotyper和SOAPsnp。^79–81面临的挑战是从测序噪声中分离出真实的变异，大多数变异呼叫者使用贝叶斯算法，该算法结合了已知多态率和测序错误下在特定位置看到变异的概率。变体检测变得越来越复杂，现在通常会在对齐后执行进一步的细化步骤，以提高变体检测的准确性。对于全基因组和外显子组分析，这些步骤包括重新排列索引周围的读取，删除重复读取，以及在变量调用之前重新校准基本质量分数。⁷⁹类Phred质量分数是为共识变量调用生成的，然而，与为单个读取生成的质量分数一样，这些分数不能在不同变量调用程序之间直接进行比较。

变异检测完成后，通常会对结果进行注释，以添加基因和转录标识符，并预测功能重要性（即非同义或移码变化）。变异体可以与数据库进行比较，以确定与疾病的已知关联，也有许多工具可用于预测新的错义变化的功能后果。⁸²ENSEMBL等基因组数据库提供了一个应用程序接口（API），有助于自动注释变体。⁸³商业程序通常要求用户单独上传单个注释文件，这可能会很费力，而且本质上更难管理。

结构变化和拷贝数分析

结构变异，包括拷贝数的改变，是个体间变异的主要原因⁸⁴并且是癌症中的常见事件。由于可能发生复杂的重排类型，如易位、反转和串联重复，从NGS数据（尤其是短阅读平台）中识别结构变体通常被认为比SNV和小指数更具挑战性。在重复区域中，结构变化也更为常见，这会为短期对齐带来映射问题。从NGS数据中检测结构变化的方法仍在积极研究和开发中，目前正在使用四种不同的方法；读取对、读取深度、拆分读取和组装。这些方法可以产生差异很大的结果，几乎没有重叠。⁸⁵应用此类分析的大多数研究都使用了来自WGS的数据来识别结构变化，然而，研究表明，结构变化分析也可以应用于目标重测序数据。这可能在临床环境中有新的应用，以取代识别常见易位融合伙伴或识别病毒整合位点的方法。^86–88

常见错误/假阳性及其克服方法

误报仍然是使用NGS的主要问题，但可以采取措施将此问题降至最低。常见错误是由于短读取序列对齐和排序错误中的模糊性造成的。如果读取与基因组中的同源或重复区域对齐，则经常会出现多重映射。此外，众所周知，人类基因组组装并不完美，存在缺口和错误组装，这也可能导致错位。^89,90通过简短读取，更可能发生与参考基因组的不对中。较长的读取（例如由Roche 454技术生成的读取）可以使读取具有更高的可信度，同时使用配对读取也可以帮助缓解多映射问题。

假阳性变异的另一个主要来源是PCR扩增过程中碱基错配或序列检测错误。重复读取会导致PCR相关错误产生假阳性，因此在分析过程中会定期清除。在这种情况下，猎枪片段库中的成对基因测序非常有用，因为如果来自两个独立片段的成对序列具有相同的起始位点，则两次读取极有可能重复。当使用PCR-amplicon方法时，这个问题不太容易解决，因为所有读取都将根据底漆设计与相同的起始位置对齐。设计重叠的PCR扩增子并在扩增间隔之间只接受一致的变异调用可能有助于减少这个问题。最近，一种称为SafeSeq的替代方法被描述为减少PCR扩增物的假阳性。⁹¹该方法原则上类似于样品的分子条形码（索引）。在文库制备过程中，不是使用已知的4-6碱基索引来标记单个样本，而是通过将退化的12-16碱基索引合并到通用适配器序列中，为每个分子提供一个唯一的条形码。样本经过PCR和深度测序，其中只有95%的重复读数中识别出的变体被保留。该应用程序非常适合检测罕见变异，但可以应用于任何基于PCR的诊断应用程序。

家族遗传检测

高外显率家族性癌症基因的基因检测，如BRCA1、BRCA2、APC和错配修复基因等，提供给因其家族和临床病史而被认为具有高风险的个体。NGS的引入应通过同时对多个目标和多个样本进行测序，从而大幅节省成本。降低基因检测成本测序的一个直接而积极的影响是，患有乳腺癌和卵巢癌等疾病的人，如果不符合目前推荐基因检测的严格标准，可能有资格进行筛查，因为决定此类指南严格性的一个主要因素是基因检测和可用资源的成本。据报道，约30-50%的突变个体不会有明显的家族史，不需要进行检测。^95,96因此，只有在使用其他更具地方性的指南时，如发病年龄小或三阴性乳腺肿瘤病理学，才能对这些患者进行检测。这些团体可能会从更容易获得的NGS方法中受益。在高级别浆液性卵巢癌中也有类似的情况，大约50%的浆液性肿瘤患者有BRCA1或BRCA2突变，但没有明显的家族史。⁹⁷

此外，如果疾病风险可归因于这些基因的突变，则可以将未经常规检测但与家族性癌症综合征有关的低频基因纳入标准基因筛查。然后，检测的选择标准可以基于特定基因内的变体是否可以用于改善诊所对患者的风险评估，而不是资源限制。另一个积极影响可能是将基因检测的时间从几个月缩短到几周，同时增加潜在的检测量。这将增加BRCA1和BRCA2检测在BRCA1或BRCA2突变携带者试验中的应用，如聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂试验，并有助于手术管理决策。⁹⁸

最近有几篇出版物描述了NGS在家族性癌症基因筛查中的应用。^99–102作为第一个例子，摩根等。使用LR-PCR对一系列细胞系和患者样本中BRCA1、BRCA2和TP53的所有外显子进行扩增并测序。⁹⁹相对较小的目标尺寸使样本池能够在Illumina Genome Analyzer（IIx）流式细胞的单个通道上进行测序。他们发现，可以使用商业软件NextGene（SoftGenetics）或定制开发的分析软件发现所有已知的致病性变体（通过同一样本集中的Sanger测序确定），包括高达16 bp的缺失，且零假阳性。

沃尔什的第二项研究等。使用杂交捕获方法测序21个已知与乳腺癌和卵巢癌易感性相关的基因。¹⁰²他们设计了针对编码区和内含子区的诱饵库，以及每个基因区上游的10Kb，总捕获大小约为1.0Mb。对一组已知点突变、缺失和重复的样本进行测序，平均覆盖率达到1200倍以上，每个目标碱基的覆盖率至少达到20倍。每个已知的致病性变化都是在测试样本中确定的，包括高达100 Kb的缺失，这些缺失可以使用捕获富集和测序的平均深度从推断的拷贝数中确定。这项研究表明，使用杂交捕获可以通过更大的测序深度来克服覆盖率均匀性较低的问题，同时，与基于PCR的方法相比，能够从数据中获得拷贝数信息并对更多基因进行测序是一个明显的优势。然而，杂交捕获的特异性仍有待进一步研究。这在处理分别与结直肠癌、黑色素瘤和乳腺癌相关的具有高度同源假基因的基因（如PMS2、BRAF和CHEK2）的诊断分析时尤其重要，因为这在理论上可能导致突变状态或拷贝数数据的误解。

我们要感谢Peter MacCallum癌症中心的Alison Trainer博士和Alex Dobrovic副教授对手稿的有益评论，并感谢Illumina Australia的Derek Campbell和Brett Kennedy提供了有关Illumina产品的早期发布信息。