神经元K-Cl共转运体KCC2影响突触后AMPA受体含量和树突棘的侧向扩散

KCC2抑制后树突状脊柱中的量子大小和GluR1积累减少。

树突状棘形态与突触功能相关，特别是与突触后密度（PSD）大小相关(15)，突触后受体含量(16)和横向扩散(17). 因此，KCC2抑制后脊柱头部体积增加可能与突触后受体数量增加和突触强度增加有关(18). 我们通过记录表达非靶向或KCC2-specific shRNAs的海马神经元的微兴奋性突触后电流（mEPSCs）来验证这一假设(图2一和B类). 令人惊讶的是，与非靶向shRNA相比，表达shRNA对抗KCC2的神经元的mEPSC振幅没有增加，而是减少了（12.4±0.9 pA vs.14.9±0.9 p A；P（P）< 0.05). 另一方面，抑制KCC2对mEPSC频率没有显著影响（14.8±1.9 Hz vs.18.3±2.3 Hz；P（P）=0.2），表明功能性突触的平均数量未受影响(图2B类).

在单独的窗口中打开

图2。

KCC2抑制后量子大小和GluR1突触后聚集减少。(一) (左侧)表达非靶shRNA或shRNA对抗KCC2的神经元中mEPSCs的10秒钟记录。(赖特)相同记录中150 mEPSCs的标度平均值显示起效或衰变动力学没有变化。(B类)mEPSC振幅分布汇总图(左侧)平均振幅和频率(赖特)在表达shNT的神经元中(n个=27）或shKCC2(n个=23）来自五个实验。KCC2表达的抑制使mEPSCs的振幅降低约17%(P（P）<0.001关于分配和P（P）平均值<0.05），不影响其频率(P（P）= 0.2). (C类)具有GFP和GluR1免疫染色的树突代表性切片。箭头表示树突棘。KCC2抑制诱导树突棘中GluR1簇的减少。（比例尺：1μm）(D类) (上部)每簇GluR1染色的归一化荧光强度（shNT，n个= 55; shKCC2、，n个=44）来自三个实验(***P（P）< 0.005). (下部)来自相同样本的携带GluR1免疫阳性簇的棘的比例的量化(P（P）= 0.2).

脊髓增大可能会增加PSD的大小，从而降低释放谷氨酸激活突触后受体的可能性(19). 然而，我们在表达KCC2特异性与非靶性shRNA的神经元中检测到mEPSCs的发病动力学没有差异（0.97±0.03 ms vs.0.95±0.03毫秒；P（P）= 0.8;图2一). 因此，我们通过比较表达shRNA的神经元与表达KCC2的神经元与非靶向shRNA的GluR1的表达，询问抑制KCC2是否影响突触后受体密度(图2C类和D类). GluR1免疫染色显示，主要在树突棘和树突轴上有明显的点状突起(图2C类). 在表达KCC2-specific shRNA的神经元中，树突棘内GluR1簇的相对强度显著降低（-46.9±8.7%；P（P）< 0.005;图2D类). 相反，含有GluR1簇的树突棘的比例未受影响（分别为83.1±3.2%和88.4±2.1%；P（P）=0.2），与KCC2抑制对mEPSC频率无影响一致。这些结果表明，KCC2抑制引起的EPSC量子大小的减小反映了兴奋性突触处突触后AMPA受体密度的降低。

防止KCC2与细胞内伙伴的分子相互作用模拟KCC2抑制。

KCC2抑制可能会增加氯化物浓度(20)从而减少GABA能量信号。这可能随后通过稳态可塑性导致兴奋性突触的缩放(21). 我们使用KCC2特异性拮抗剂VU0240551的长期应用来验证这一假设(22). 与单独使用DMSO治疗相比，使用6μM VU0240551在DMSO中治疗21个DIV神经元72小时以上，可显著增加脊椎头部体积(P（P）< 0.001;表S1). 然而，平均振幅没有明显变化（18.7±1.1 pA vs.16.8±0.8 pA；P（P）=0.2），频率（30.1±3.1 Hz vs.31.3±3.0 Hz；P（P）=1.0），或起始动力学（1.03±0.02 ms vs.1.07±0.02毫秒；P（P）=0.2）mEPSCs(图3一和B类). 与这些观察结果一致，VU0240551在树突棘中未诱导GluR1簇免疫荧光的可检测变化（对照组的+7.3±8.9%；P（P）=0.2）或GluR1-免疫阳性脊柱的比例（84.1±1.0%对82.6±1.2%；P（P）= 0.7;图3C类和D类). 因此，抑制KCC2表达后兴奋性突触效能降低并不是KCC2功能丧失和随后GABA信号减少的结果。

在单独的窗口中打开

图3。

KCC2抑制效果与KCC2功能无关。(一)用6μM VU0240551在DMSO或仅DMSO中治疗>72小时的神经元100 mEPSCs的标度平均值。(B类)mEPSC振幅总结图(左侧)和频率(赖特)用二甲基亚砜处理的神经元(n个=23）或VU0240551(n个=24）来自四个实验。KCC2拮抗剂对mEPSC振幅没有显著影响(P（P）=0.2）或频率(P（P）= 0.8). (C类)DMSO或VU0240551处理的海马神经元的GFP和GluR1免疫染色。箭头表示树突棘。（比例尺：1μm）(D类) (上部)用二甲基亚砜处理的神经元中每簇GluR1染色的正常荧光强度(n个=44个单元格）或VU0240551(n个=40个细胞）(P（P）= 0.2). (下部)同一样品中含有GluR1-免疫阳性簇的脊椎比例的量化(P（P）= 0.7).

KCC2的C末端结构域与4.1N蛋白相互作用(11)，一种神经元FERM域蛋白(12)结合肌动蛋白和AMPA受体的GluR1亚单位(23). 因为突触AMPA受体的稳定严重依赖于肌动蛋白细胞骨架(24)AMPA受体、肌动蛋白和KCC2之间的直接或间接相互作用可能影响突触AMPA受体的维持。因此，我们旨在通过过度表达KCC2-CTD来防止KCC2-4.1N相互作用而不影响KCC2功能(11). 我们首先通过比较GABA电流（E_GABA公司)笼状GABA的局部光解在体细胞和远端树突诱导(11). 在我们的条件下，E_GABA公司RuBi-GABA（Ascent Scientific）光解到海马神经元胞体的诱发电位为-51.3±1.6 mV(n个= 25;图4一)，接近Cl的平衡电位⁻（-52.3毫伏）。在仅表达GFP的神经元中，我们测量到体细胞和树突状细胞E之间的梯度为7.3±1.6 mV/100μM_GABA公司(图4一和B类). 在过度表达KCC2-CTD的神经元中，这种梯度没有显著差异（7.2±2.3 mV/100μM；P（P）= 0.6). 相反，表达针对KCC2的shRNA的神经元与非靶向shRNA相比显著减少（1.7±1.1 mV对6.6±1.5 mV/100μM；P（P）<0.05），并且在暴露于KCC2拮抗剂VU0240551的细胞中与单独的DMSO相比（每100μM 2.5±0.5 mV与6.4±0.7 mV；P（P）< 0.005). 因此，海马神经元中KCC2-CTD的过度表达并不影响其氯离子的表观挤压能力，这表明KCC2转运是有功能的。

在单独的窗口中打开

图4。

KCC2-CTD的过度表达模拟了KCC2抑制的效果。(一) (左侧)RuBi-GABA在体细胞全细胞斑贴神经元胞体或远端树突上的局部光解所诱发的电流。(赖特)电压阶跃范围为−95至−35 mV的代表性电流，具有相应的标准化电流/电压关系。注意树突电流/电压关系与体细胞GABA电流的左移。(B类)总结数据显示，表达GFP的神经元与表达KCC2-CTD的神经元发生了类似的变化(P（P）=0.6），但在表达KCC2特异性与非靶性shRNA的神经元中没有(*P（P）<0.05）或VU0240551（6μM）与DMSO单独治疗的神经元(**P（P）< 0.005).n个=每种情况下10–12个单元格。(C类)表达GFP或KCC2-CTD和GFP的神经元记录的100 mEPSCs的标度平均值。(D类)平均mEPSC振幅(左侧)和频率(赖特)图表。过度表达KCC2-CTD显著降低mEPSC振幅约19%(*P（P）<0.05），但不包括频率(P（P）= 0.2).n个=22个KCC2-CTD细胞和20个GFP细胞。(E类)具有GFP和GluR1免疫染色的树突代表性切片。箭头显示树突棘。（比例尺：1μm）(F类)每簇GluR1染色的归一化荧光强度(上部, **P（P）<0.005）和GluR1-免疫阳性脊髓的比例(下部,P（P）=0.4）在表达GFP的神经元中(n个=28）或KCC2-CTD和GFP(n个=30）在两个独立实验中。

KCC2-CTD的过度表达并未导致树突棘的形态发生任何显著变化(表S1)但mEPSC振幅降低的程度与RNAi抑制KCC2表达的程度相似（10.6±0.3 pA vs.13.1±0.9 pA；P（P）< 0.05;图4C类和D). KCC2-CTD的作用与mEPSC频率的显著变化无关（15.8±1.6 Hz vs.14.3±3.0 Hz；P（P）=0.2）或上升时间（0.88±0.04 ms vs.0.93±0.0.3 ms；P（P）= 0.1). 相应地，GluR1免疫染色显示，表达KCC2-CTD的神经元树突状棘中的簇密度降低，而仅表达GFP的神经元树突棘中簇密度降低（-22.3±8.1%；P（P）<0.005），而GluR1-免疫阳性脊髓的比例未受影响（90.1±1.6%对85.7±3.1%；P（P）= 0.4;图4E类和F类). 因此，抑制KCC2的表达或干扰KCC2与细胞质伴侣的相互作用而不影响其转运功能会降低兴奋性突触的强度。这种效应可能反映了树突棘中含有GluR1的AMPA受体的聚集减少。

KCC2抑制后树突状脊柱中GluR1亚单位的侧向扩散增加。

突触AMPA受体的含量受与锚定蛋白的相互作用、胞吐、内吞和质膜中的横向受体扩散的影响(25,26). KCC2可能通过与4.1N和肌动蛋白细胞骨架的相互作用，促进AMPA受体在树突棘中的扩散限制(17). 我们通过基于量子点（QD）的单粒子追踪监测AMPA受体的横向扩散来验证这一假设(27). 将神经元与表达重组GluR1-GFP的载体共转染，该载体在其细胞外N末端标记，并与非靶向或KCC2特异性shRNA构建物共转染。QD结合的重组GluR1和天然AMPA受体在树突棘和树干中表现出异质扩散行为(28). 在树突状棘中，位于脊椎头部的一些受体扩散缓慢，仅探测到一个受限的膜区（例如图5B类). 其他虽然局限于脊柱头部，但在更大的膜区扩散更快（灰色轨迹图5C类). 这些不同的行为可能反映了内吞区受体的不同突触锚定或捕获(28,29). 因此，我们缓慢地进行区分(D类≤ 1.5 × 10⁻²●微米²●秒⁻¹]并且迅速(D类> 1.5 × 10⁻²●微米²●秒⁻¹)扩散受体，其中D类表示扩散系数。与树突棘中GluR1的优先突触锚定一致(29)脊髓慢QD的比例大于树突干慢QD（46.5%比34.3%；n个=43和n个分别=137个QD）。

在单独的窗口中打开

图5。

KCC2抑制增加了GluR1在树突棘中的侧向扩散。(一)慢速图像序列（24秒）(上部行)而且速度很快(较低的行)表达shNT或shKCC2的神经元树突棘中QD标记的GluR1s。QD图像（绿色）与轮廓脊柱膜（红色）重叠。QD（绿色）的表面探测在最大强度投影上可视化。（比例尺：1μm。）箭头显示脊椎头部的QD，箭头显示脊柱颈部的QD和交叉箭头显示树突轴的QD。(B类和C类) (左侧)慢的时间平均均方位移（MSD）函数(B类)而且速度很快(C类)GluR1如所示一显示了转染shNT（灰色）或shKCC2（黑色）的神经元中GluR1的扩散。(插图)重建慢速（shNT，479帧；shKCC2，633帧）和快速（shNT，427帧；shKCC2，266帧）量子点的轨迹。(赖特)20（shNT，慢速）、17（shKCC2，慢速。扩散系数(D类)和限制域(E类)对于表达shNT（灰色）或shKCC2（黑色）的神经元中缓慢与快速GluR1。KCC2消光增加了快速扩散系数和限制域(*P（P）两个参数均<0.05），但速度不慢(P（P）=0.6和P（P）分别=0.1）脊椎中的GluR1。

KCC2的消失并不影响脊髓慢受体的探索行为或限制(图5一和C类). 在表达KCC2-specific和non-target shRNA的神经元中，它们的平均扩散系数和限制域没有显著差异(D类= 0.82 ± 0.01 × 10⁻²●微米²●秒⁻¹与0.85±0.07×10相比⁻²●微米²●秒⁻¹,P（P）= 0.6;L（左）=97±6纳米与111±7纳米，P（P）=0.1），其中L（左）表示限制域。相反，在表达KCC2特异性shRNA的神经元中，树突棘中快速QD结合的GluR1的扩散系数增加了两倍，限制域增加了1.7倍(D类= 12.05 ± 2.45 × 10⁻²●微米²●秒⁻¹对比5.99±1.40×10⁻²●微米²●秒⁻¹,P（P）< 0.05;L（左）分别=611±13 nm和366±5 nm，P（P）< 0.05;图5D类和E类). 这一影响也反映在两种情况下由轨迹导出的均方位移函数的陡峭斜率上(图5C类). 因此，KCC2明显直接或间接地抑制树突棘中快速含GluR1的AMPA受体的横向运动。这种效应似乎与脊柱头部直径的变化无关，因为对照实验表明GluR1的侧向扩散与脊柱大小无关(图S2). 与其对GluR1在脊椎中扩散的影响相反，KCC2抑制并没有显著改变树突轴上的扩散。因此，在表达KCC2-specific和non-target shRNA的神经元中，缓慢和快速QD结合GluR1的平均扩散系数和限制域没有显著差异(图S3). 我们得出结论，KCC2抑制GluR1在树突棘中的横向扩散，但在树突轴上没有。这种限制主要影响快速扩散的GluR1，表明不同的分子相互作用限制了缓慢GluR1-AMPA受体的扩散。

我们感谢J.Nabekura构建大鼠KCC2-IRES-GFP；GluR1-GFP的J.A.Esteban；R.Miles、J.A.Esteban、C.Bernard和E.Petrini对手稿早期版本的批判性阅读；鸡NCAM构建物和抗体的R.M.Mège；和M.Dahan共享单粒子跟踪分析软件。这项工作得到了国家圣母院医学研究所（Avenir项目资助J.C.P.）、巴黎市研究资助（资助J.C.P）、塞尔沃河畔Recherche联合会、费森基金会和医学基金会的支持。G.G.是法国Neuropole-Ile de France和Recherche Medicale基金会研究金的获得者。