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细胞死亡不同。2011年1月；18(1): 133–144.
2010年7月9日在线发布。 数字对象标识：10.1038/cdd.2010.82
预防性维修识别码：PMC3131877
PMID：20616807

TSC1和TSC2肿瘤抑制因子是内质网应激反应的必要条件，可保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡

Y J康,1,三，4 M-K路,1,2,三和K-L关1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

结节性硬化综合征（TSC）1和TSC2是抑制细胞生长的肿瘤抑制因子，其中一个基因的突变会导致多个组织中的良性肿瘤。TSC1和TSC2基因产物形成一种功能复合物，该复合物具有GTPase激活蛋白（GAP）对富含脑（Rheb）的Ras同系物的活性，以抑制雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点，雷帕霉素复合体1在TSC突变肿瘤中被组成性激活。我们发现TSC1或TSC2突变的细胞对内质网（ER）应激非常敏感，并发生凋亡。尽管TSC突变细胞显示eIF2升高α磷酸化是一种早期内质网应激反应标记，在基础和诱导条件下，其他内质网胁迫反应标记的诱导受到严重影响，包括ATF4、ATF6和C/EBP同源蛋白（CHOP）。内质网应激反应的缺陷通过猛禽击倒而不是通过雷帕霉素处理在TSC突变细胞中得以恢复，这表明雷帕霉素不敏感的mTORC功能是内质网胁迫反应缺陷的原因。一贯地，Rheb的激活使细胞对内质网应激敏感。我们的数据显示TSC1/TSC2和Rheb在未折叠蛋白反应和细胞存活中起着重要作用。我们推测TSC1/2抑癌剂的一个重要生理功能是保护细胞免受有害条件的影响。这些观察结果表明，使用内质网应激剂选择性杀伤TSC1或TSC2突变细胞用于TSC治疗具有潜在的治疗应用价值。

关键词：TSC、mTOR、Rheb、ER应激、细胞凋亡

结节性硬化综合征（TSC）是一种常染色体显性疾病，其特征是在大脑等多个重要器官中生长良性肿瘤，导致严重的神经系统疾病。1TSC1或TSC2的突变导致mTORC1（雷帕霉素复合物1的哺乳动物靶点）和下游信号级联的组成性激活，导致TSC的形成。TSC1和TSC2蛋白相互作用形成物理和功能复合物，通过抑制脑中富集的Ras同源物（Rheb）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）途径来调节细胞生长。2,三,4,5,6,7mTOR蛋白在两种不同的复合物中起作用，称为mTOR复合物1和2（mTORC1和mTORC2）。已经揭示了一种线性TSC1/2-Rehb-mTORC1途径，其中Rheb是介导TSC1/2控制mTORC1活性的作用的重要分子。8,9,10相反，Rheb不直接刺激mTORC2活性。

未折叠或错误折叠蛋白的过度表达、营养剥夺和钙稳态扰动会导致多种内质网应激状态，这些应激状态可以通过细胞内信号通路感知，统称为未折叠蛋白反应（UPR）或内质网胁迫。11,12该信号级联的启动主要通过激活三个内质网压力传感器来实现。I型跨膜核酸内切酶/蛋白激酶肌醇需要酶1（IRE1）、PKR-like ER kinase（PERK）和一种称为激活转录因子6（ATF6）的II型跨膜蛋白11,12集体感知内质网中的未折叠蛋白并引发细胞反应，包括蛋白质合成的普遍抑制、选择性蛋白质翻译和应激反应基因的诱导。UPR被认为是一种保护细胞免受不利条件影响的机制。然而，不受控制的UPR可导致细胞凋亡。PERK激活导致真核翻译起始因子2磷酸化α（eIF2α)因此，通过抑制翻译起始导致蛋白质合成减少。13,14磷酸化eIF2α也选择性地翻译一些蛋白质，例如ATF4转录因子，它反过来诱导应激反应基因的表达。IRE1核酸酶特异性切割一种称为X-box结合蛋白-1（XBP-1）的转录因子的mRNA；它从XBP-1 mRNA前体中移除26 bp，以产生成熟形式的XBP-1mRNA，从而刺激XBP-1蛋白表达。12,15,16内质网应激还诱导ATF6的位点特异性蛋白水解，ATF6分裂的细胞质域进入细胞核，作为转录因子增加内质网伴侣的转录。17,18此外，内质网应激促进蛋白酶体依赖性蛋白质降解。未能缓解内质网应激诱导的蛋白过载可能导致细胞死亡，这是由促凋亡转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）的大量诱导和caspase级联激活介导的。19

在本研究中，我们研究了TSC突变细胞的内质网应激反应。我们发现TSC1−/−或TSC2−/–细胞对内质网应激诱导的凋亡敏感。我们观察到TSC1或TSC2的损失导致ER应力响应被截断。TSC突变细胞显示eIF2升高α磷酸化，但转录因子如ATF4、ATF6和CHOP的激活显著降低。因此，TSC突变细胞对内质网应激诱导的凋亡更为敏感。对内质网应激的超敏反应不受雷帕霉素治疗的影响，但受到猛禽击倒的抑制，并且可以通过激活Rheb来模拟。这些结果导致了TSC1和TSC2保护细胞免受内质网应激的结论，并提示了使用内质网胁迫剂治疗TSC的可能性。

结果

TSC突变细胞对内质网应激诱导的凋亡敏感

之前我们发现，TSC突变细胞对葡萄糖饥饿敏感，并在长时间葡萄糖剥夺期间发生凋亡。20我们的结论是，这种效应是由于TSC突变细胞在能量饥饿反应中的缺陷所致。然而，葡萄糖饥饿也可能导致内质网应激。21因此，我们研究了内质网应激对TSC突变细胞的影响。Thapsigargin是一种内质网钙ATP酶抑制剂，可诱导内质网应激。我们发现，TSC1−/−MEF细胞而非对照TSC1+/+细胞对thapsigargin治疗非常敏感，并且在治疗的18小时内出现大量细胞死亡(图1a). 衣霉素阻断蛋白质糖基化，也是一种常用的内质网应激诱导剂。Tunicamycin治疗也会导致TSC1−/−中的细胞大量死亡，但在对照细胞中没有(图1a). 知道TSC1−/−细胞对他司加金和衣霉素敏感，我们检测了对MG132的敏感性，MG132是一种蛋白酶体抑制剂，也能诱导UPR。正如预期的那样，MG132在TSC1−/−中诱导了细胞死亡，但在对照细胞中没有(图1a). 为了确定对内质网应激的高度敏感性是否是TSC1失活所特有的，在TSC2−/−LEF细胞和重新表达TSC2（为了方便起见，标记为TSC2+/+）的对照中进行了类似的实验。在TSC2−/−细胞中观察到大量细胞死亡，以响应他帕西精氨酸、膜霉素或MG132处理，而TSC2+/+细胞未被类似处理杀死(图1b). 总之，我们的数据表明，TSC1或TSC2的突变使细胞对内质网应激诱导剂敏感，而TSC突变细胞在内质网胁迫条件下启动凋亡。上述结果表明，TSC1和TSC2通常保护细胞免受内质网应激。

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TSC缺乏细胞对内质网应激诱导的细胞死亡敏感。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)与thapsigargin（TG，1）孵育μM） ，衣霉素（Tm，2μg/ml）或MG 132（MG，10μM） 持续18h，观察细胞死亡情况。本文的所有结果都是2-3个独立实验的代表

众所周知，不受控制的内质网应激会诱导细胞凋亡。12为了检测内质网应激诱导的TSC细胞死亡是否与凋亡有关，我们检测了caspase的激活。原天冬氨酸酶的定点裂解为较小的成熟半胱天冬酶是半胱氨酸酶激活的标志。我们发现MG132处理诱导TSC1−/−细胞中活性（裂解）caspase 12、9和3显著增加(图2a). 相反，在类似处理条件下，在对照TSC1+/+细胞中未观察到caspase激活。这些数据支持MG132诱导TSC1−/−细胞凋亡。我们还测试了他司加金和衣霉素的作用。我们的数据表明，尽管衣霉素的作用不如他巴西加精显著，但两种内质网应激诱导剂都能激活caspase 12、9和3(图2a和b). 与观察到的细胞死亡一致图1内质网应激诱导TSC2−/−细胞中caspase的激活，这由裂解成熟caspase 9和3的出现决定，而内质网胁迫没有诱导对照TSC2+/+细胞中caspase的激活(图2b). Caspase 12与内质网应激诱导的细胞凋亡有关，Caspase 9位于细胞内死亡途径的上游。22,23Caspase 3在Caspase 9的下游起作用，是参与细胞死亡执行的效应器Caspase。24,25我们的数据表明，内质网应激诱导的TSC突变细胞死亡与caspase 12、9和3的激活相关。内质网应激也可诱导自噬。26我们还测试了TSC的缺失是否影响内质网应激介导的自噬诱导，并且我们观察到内质网胁迫在TSC1−/−和野生型MEF中都诱导了自噬（数据未显示）。

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内质网应激诱导TSC缺乏细胞中caspase活化。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)与MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或突尼斯霉素（Tm）孵育指定时间。使用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12、裂解半胱氨酸蛋白酶9或裂解半胱天冬酶3的特异性抗体通过western blotting分析细胞裂解产物。肌动蛋白水平作为负荷控制进行测量

升高的基底和应力诱导eIF2αTSC突变细胞中的磷酸化

eIF2的磷酸化α是ER应激的最佳表征标记之一。内质网应激的一个关键生理反应是抑制蛋白质合成，这在很大程度上由eIF2的磷酸化依赖性抑制介导αTSC1−/−细胞显示基础eIF2水平显著α即使未经处理也会发生磷酸化(图3)这一观察结果与之前的报告一致，即TSC突变细胞由于不受控制的mTORC1激活导致蛋白质合成过度而处于恒定的内质网应激状态。27,28我们还发现，eIF2不仅α磷酸化增加了MG132，但也显著增加(图3a和b). thapsigargin和tunicamycin都能引起更强的eIF2αwestern blotting测定TSC1−/−细胞中的磷酸化(图3a). 在TSC2−/−细胞中进行了类似的观察(图3b). 我们的数据表明，TSC突变细胞的基础UPR升高，eIF2增强α内质网应激诱导的磷酸化。

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ER应力诱导eIF2αTSC缺乏细胞的磷酸化增加。TSC1+/+或−/−MEF(一)和TSC2+/+或−/−LEF(b条)用MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）处理，并在指定的时间点制备细胞裂解物。eIF2的磷酸化α用抗磷酸化eIF2蛋白免疫印迹法测定α（对eIF2α)抗体。通过用抗eIF2重组膜来分析细胞裂解物的负载α和抗肌动蛋白抗体

TSC突变细胞表现出截短的内质网应激反应

内质网应激反应保护细胞应对不利的应激环境。那么，令人困惑的是，为什么TSC突变细胞一方面对内质网应激诱导的凋亡敏感，而这些细胞也表现出更强的eIF2α另一方面，磷酸化。除了eIF2α通过PERK磷酸化，三个内质网应激传感器的激活也诱导许多内质网胁迫蛋白的表达。我们检测了几种内质网应激标记物，包括ATF4、ATF6、XBP-1和CHOP，它们在内质网正常应激反应中起着关键作用。内质网应激还激活了另外两个内质网压力传感器ATF6和IRE1。IRE1激活导致XBP-1表达，而eIF2α磷酸化诱导ATF4的选择性翻译。此外，ATF4和ATF6这两种转录因子都有助于CHOP的表达。多种内质网应激反应共同保护细胞免受内质网胁迫。用MG132处理TSC1+/+或−/−细胞，并收集细胞核部分。用ATF4特异性抗体进行Western blot分析表明，MG132显著增加了TSC1+/+细胞中ATF4蛋白的水平(图4a和图b). 令人惊讶的是，TSC1−/−细胞中ATF4的诱导显著减弱。接下来，我们检查了MG132对CHOP表达的影响。同样，与TSC1+/+对照细胞相比，TSC1−/−细胞中CHOP诱导显著受损。ATF6和XBP-1也进行了蛋白质印迹。我们观察到，MG132诱导的XBP-1表达在TSC1−/−细胞中降低。相反，在TSC1+/+和TSC1−/−细胞中，ATF6的诱导作用具有可比性。在TSC2−/−细胞中进行了类似的实验，观察到了相同的结果(图4a). 因此，我们的数据表明，包括ATF4、CHOP和XBP-1在内的内质网应激反应的诱导在TSC突变细胞中受到损害。

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TSC缺陷细胞表现出缺陷的内质网应激反应。(一)TSC1+/+或−/−MEF和TSC2+/+或-/−LEF与MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或突尼斯霉素（Tm）孵育，并在指定的时间点制备核提取物（NE）或全细胞裂解物（WCL）。使用特异性抗体通过免疫印迹法检测ATF4、CHOP、ATF6和XBP-1剪接形式的诱导。使用抗U1SnRNP 70（NE）或抗肌动蛋白（WCL）抗体测定等蛋白载量。(b条)内质网应激对TSC1+/+或−/−MEF中ATF4和CHOP的诱导作用。细胞与MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）孵育4h，制备总RNA。使用特定引物进行定量RT-PCR，折叠诱导用肌动蛋白mRNA水平进行标准化

我们进一步分析了塔西加金和衣霉素诱导的内质网应激反应。正如预期的那样，这两种化合物都诱导了对照细胞中ATF4、CHOP和ATF6的表达，尽管诱导作用不如MG132处理(图4a和b). 重要的是，这三个内质网应激反应基因的诱导在TSC1−/−细胞中被消除。在我们的western blotting中，我们没有通过thapsigargin或tunicamycin检测到XBP-1的表达。这可能是由于抗体的低敏感性和两种化合物诱导的内质网应激反应较弱的结合所致。还检测了TSC2−/−细胞中ATF4、CHOP、ATF6和XBP-1的诱导作用，并观察到ER应激反应减弱(图4a)这表明，有缺陷的内质网应激反应对TSC1−/−和TSC2−/–细胞都是常见的。我们的结果表明TSC1和TSC2在全范围内质网应激反应中起着关键作用。此外，截断的内质网应激反应可能有助于内质网高应激诱导TSC突变细胞凋亡。

TSC1敲低时重组TSC2阻滞增加内质网应激诱导的细胞凋亡

为了排除TSC突变细胞对内质网应激的超敏反应可能是由于TSC1或TSC2以外的获得性突变所致，我们接下来在TSC2−/−LEF细胞中重新表达TSC2，并在HeLa细胞中短暂敲除TSC1(图5a和e). western blotting检测内质网应激反应以诱导ATF6活性，western blotting检测裂解caspase 9水平和annexin V/碘化丙啶染色细胞的流式细胞术分析凋亡。如所示图5，TSC2损伤细胞恢复内质网应激反应(图5b)与对照TSC2−/−细胞相比，伴随发生的凋亡较少(图5c和d). 尽管在HeLa细胞中TSC1的敲除降低了由thapsigargin和突尼斯霉素诱导的活性ATF6水平(图5f)ER应激诱导的细胞凋亡增加(图5g和h). 这些结果表明，TSC突变细胞中内质网应激反应的缩短和对凋亡更高的敏感性确实是由TSC1或TSC2的突变引起的，不仅在MEF中，而且在其他细胞类型中，如HeLa细胞中。

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TSC1和TSC2功能是细胞生存应对内质网应激所必需的。(一–d日)TSC2重组阻断内质网应激诱导的细胞凋亡。(一)TSC2抗体免疫印迹证实TSC2过度表达。(b条–d日)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。4或24小时后制备细胞裂解物以检测内质网应激标记物ATF6(b条)或诱导裂解caspase-3(c（c）)通过免疫印迹法。24小时后收集细胞，通过FACS分析测定凋亡诱导(d日). (e（电子）–小时)内质网应激诱导TSC1敲低HeLa细胞凋亡。(e（电子）)用无靶向shRNA（对照）或TSC1感染HeLa细胞，并用抗TSC1抗体进行免疫印迹证实TSC1的敲除。(（f）–小时)用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理细胞，6或24小时后获得细胞裂解物以检测ATF6(（f）)或裂解半胱天冬酶-9(克)通过免疫印迹法。24小时后通过FACS分析测定细胞凋亡诱导(小时). 每个象限中的数字表示人口的平均百分比

雷帕霉素不能保护TSC突变细胞免受内质网应激诱导的凋亡

TSC1或TSC2的突变导致Rheb和mTORC1的结构性激活。我们首先使用雷帕霉素分析了mTORC1的作用，雷帕霉素是一种有效且特异的mTORC抑制剂。已知葡萄糖饥饿可诱导TSC突变细胞凋亡。25雷帕霉素能有效阻断葡萄糖饥饿诱导的细胞凋亡(图6a)与高mTORC1激活在能量缺乏诱导的细胞凋亡中的关键作用一致。为了测试mTORC1的作用，将雷帕霉素与MG132、他培沙金或衣霉素一起添加，以治疗TSC1−/−细胞。我们惊讶地发现雷帕霉素在保护TSC1−/−细胞免受内质网应激诱导的凋亡方面几乎没有作用(图6a). 活性caspase 3的Western blotting支持形态学细胞死亡数据(图6b). 雷帕霉素完全阻断了TSC1−/−细胞中活性caspase 3对葡萄糖饥饿的反应。相反，雷帕霉素并没有阻断MG132、他吡加金或衣霉素引起的caspase 3激活。事实上，雷帕霉素甚至轻微增强了TSC1−/−细胞中活性caspase 3的出现，以应对他吡加金和衣霉素(图6b). 对TSC2−/−细胞进行了平行实验，我们还发现雷帕霉素不能保护内质网应激诱导的凋亡(图6a和b). FACS分析对细胞凋亡的量化进一步支持了这一结论(图6c). 上述观察结果表明，雷帕霉素不敏感的下游信号通路使TSC突变细胞对内质网应激敏感。

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雷帕霉素不能保护TSC突变细胞免受内质网应激诱导的细胞凋亡。(一)TSC1−/−MEF或TSC2−/–LEF与或不与雷帕霉素（10 nM）孵育1 h，然后用培养基MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）处理，或用无葡萄糖培养基（-葡萄糖）培养，如图所示。18小时后，观察到细胞死亡(一)制备细胞裂解物，用抗裂解caspase-3抗体分析细胞死亡诱导(b条). 通过使用抗肌动蛋白抗体重制膜来测量蛋白质负荷。24小时后收集细胞，通过流式细胞术测量细胞死亡诱导(c（c）)

内质网应激诱导TSC突变细胞高凋亡是Rheb和raptor依赖性的

接下来，我们测试了Rheb GTPase的作用，它是TSC1/TSC2的直接靶点。我们在HeLa细胞中稳定地过度表达钙调素结合蛋白（CBP）表位标记的野生型或组成活性Rheb（S16H）(图7a). 我们无法生成稳定过度表达显性阴性Rheb（S20N）的HeLa细胞，因为我们无法检测潮霉素B选择后显性阴性Rhyb的表达。经Rheb特异性抗体的western blotting证实，也产生了活性Rheb过度表达或Rheb击倒MEF(图7d). 研究了不同内质网应激诱导剂对这些细胞凋亡的诱导作用。在正常培养条件下，Rheb的过度表达或敲除不会诱导细胞凋亡(图7b–d). 然而，当用MG132、thapsigargin或突尼斯霉素处理细胞时，野生型和活性Rheb的表达诱导caspase 9和caspase 3的激活，支持Rheb在内质网应激中的作用(图7b和d)活性Rheb表现出更显著的作用，如通过FACS分析测得的更高水平的裂解半胱天冬酶9和更高比例的细胞死亡(图7b和c). 相反，Rheb的敲除不会使细胞对thapsigargin或突尼斯霉素诱导的凋亡敏感(图7d). 值得注意的是，Rheb敲除确实使细胞对MG132敏感(图7d). 鉴于MG132导致泛素化蛋白的全球积累，MG132的影响可能比内质网应激更广泛。总之，我们的数据表明，高Rheb活性使细胞对内质网应激敏感，支持这样一种观点，即TSC突变体中的高Rheb活性是内质网胁迫诱导的凋亡的原因。

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高Rheb活性使细胞对内质网应激诱导的凋亡敏感。(一)用对照型、野生型或组成活性突变体（S16H）Rheb-编码慢病毒感染HeLa细胞，并用抗CBP-tag抗体进行western blotting证实过表达。(b条,c（c）)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。24小时后，制备细胞裂解物，通过western blot分析检测裂解caspase-9的诱导(b条)，收集细胞，通过FACS分析测量细胞死亡诱导(c（c）). (d日)野生型MEF被慢病毒载体感染，慢病毒载体不表达任何（N）、组成活性Rheb（Act）或靶向Rheb的shRNA（KD）。48 h后，用培养基（无）、MG 132（MG）、thapsigargin（TG）或tunicamycin（Tm）处理细胞18 h，制备细胞裂解物，用特异性抗体通过western blotting分析caspase 9或caspase 3裂解形式的诱导。用抗Rheb抗体测定Rheb的过度表达或敲除，用抗肌动蛋白抗体测定蛋白质负荷

尽管内质网应激诱导的TSC突变细胞凋亡对雷帕霉素不敏感，但仍有可能与mTORC1有关。我们进一步研究了TSC突变细胞中的内质网应激超敏反应是否需要猛禽。我们在TSC1−/−MEF中进行了猛禽敲除，并证实猛禽蛋白敲除和S6K磷酸化降低(图8a). 我们在猛禽敲低和对照TSC1−/−MEFs中测试了用培养基、thapsigargin或衣霉素处理时的内质网应激反应和细胞凋亡。令人惊讶的是，当猛禽被击倒时，TSC突变细胞恢复了内质网应激反应，如TSC1+/+MEF中类似的ATF6激活所示(图4a和8b)同时，TSC突变细胞受到了thapsigargin和tunicamycin诱导的凋亡保护(图8c和d). 总之，我们的数据表明，mTORC的raptor-dependent rapamycin敏感性功能与TSC突变细胞对内质网应激的超敏反应有关。

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TSC1−/−MEF中猛禽基因敲除可恢复内质网应激反应，并保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡。TSC1−/−MEF细胞被无靶向（对照）或猛禽的shRNA-编码慢病毒感染，并且通过western blot分析证实猛禽被击倒。(b条–d日)细胞用培养基（无）、thapsigargin或突尼斯霉素处理。处理4或24小时后制备细胞裂解物，用于检测ATF6(b条)或裂解半胱天冬酶-3(c（c）)通过免疫印迹法。24小时后通过FACS分析测定细胞死亡诱导(d日)

讨论

TSC1/TSC2肿瘤抑制复合物作为GTPase激活蛋白（GAP）对Rheb起作用，Rheb是mTORC1的一种有效的直接激活剂。在TSC突变细胞中，mTORC1具有组成活性，因此刺激翻译并促进细胞生长。TSC-Rheb-mTOR通路整合了广泛的细胞内信号，以协调细胞生长与细胞环境。在不利条件下，激活TSC1/TSC2将抑制不需要的细胞生长，从而保护细胞免受有害条件的影响。在本报告中，我们表明TSC1和TSC2是内质网应激反应的全过程所必需的，并且具有保护细胞免受内质网胁迫诱导的凋亡的功能。有趣的是，TSC1/TSC2的这种功能是由Rheb和猛禽介导的，但对雷帕霉素的抑制不敏感。与传统激酶抑制剂不同，雷帕霉素与FKBP12形成复合物，然后与mTOR中的FRB结构域结合，以抑制mTORC1磷酸化下游底物（例如S6K1）的能力。因此，雷帕霉素并不直接抑制固有的mTOR激酶活性。有趣的是，Choo等。29表明，在某些条件下，4EBP1磷酸化需要具有雷帕霉素抗性的mTORC1活性，这表明并非雷帕霉素抑制了mTORC2的所有功能。我们的研究表明，雷帕霉素敏感性mTORC1活性可能与TSC突变细胞对内质网应激的超敏反应有关。

提出了TSC在内质网应激反应中的潜在作用。奥兹坎等。28表明TSC突变细胞具有较高的基础eIF2α内质网应激反应中的磷酸化和高凋亡。这些研究人员得出结论，内质网应激反应升高导致TSC突变细胞的细胞死亡。然而，除了eIF2α未检测其他内质网应激反应标记物的磷酸化。我们的研究表明，TSC突变细胞表现出缺陷的内质网应激反应，如ATF4、ATF6和CHOP的诱导减弱所示，尽管eIF2水平较高α发生磷酸化。我们认为，TSC突变细胞中不完全的内质网应激反应未能保护细胞免受未折叠蛋白应激的影响，并导致内质网胁迫下细胞的高水平凋亡。

CHOP与内质网应激诱导的细胞凋亡有关。令人惊讶的是，我们观察到，在TSC突变细胞中，CHOP诱导被thapasigargin和突尼斯霉素所抑制，但TSC细胞显示出大量凋亡。这些数据表明，内质网应激诱导的细胞凋亡不需要CHOP诱导，至少在TSC突变细胞中是如此。此外，我们的数据表明，ER应激诱导CHOP的正常功能（中度诱导）可能保护而不是杀死细胞。只有当CHOP在非常高的水平表达时，CHOP才可能促进细胞凋亡。CHOP的这种功能类似于p53，其中适度的诱导通过停止细胞周期来保护细胞，而大量的p53诱导则促进细胞凋亡。19,30TSC1或TSC2的细胞保护功能可能与细胞类型无关。例如，TSC1突变神经元对内质网应激也表现出超敏反应。31

我们发现TSC突变细胞表现出截短的内质网应激反应。TSC1−/−或TSC2−/–细胞显示升高的基础和应激诱导的eIF2α磷酸化，这是由PERK催化的。然而，有三种内质网应激传感器，IRE1、ATF6和PERK。在TSC突变细胞中，ATF4、ATF5和CHOP的诱导在内质网胁迫下严重受损。MG132治疗对XBP-1的诱导作用也减弱。这些观察结果表明，TSC突变细胞表现出部分内质网应激反应，eIF2升高表明α磷酸化，但减少其他内质网应激标记物的诱导。高eIF2α磷酸化参与促进选择性mRNA的翻译，如ATF4。然而，尽管eIF2在TSC突变细胞中没有诱导ATF4α磷酸化水平较高，表明TSC突变细胞中早期内质网应激反应和晚期内质网胁迫事件之间可能存在脱钩。MG132抑制蛋白酶体介导的降解，并引起一般性UPR，包括内质网应激反应。TSC突变细胞同样对MG132表现出超敏反应。我们认为TSC突变细胞中不完全的内质网应激反应导致了对内质网胁迫的高度敏感性。

研究表明，mTORC1的过度激活导致TSC突变细胞中的许多异常。雷帕霉素作为mTORC1的有效抑制剂，被认为是治疗TSC的潜在药物。32有趣的是，雷帕霉素不能保护TSC突变细胞免受内质网应激诱导的凋亡。相反，雷帕霉素能有效保护TSC突变细胞免受葡萄糖饥饿诱导的凋亡。然而，TSC突变细胞对内质网应激的高敏感性是Rheb和猛禽依赖性的，这表明mTORC1在内质网应激诱导的细胞死亡中具有雷帕霉素不敏感的活性。最近的研究表明，雷帕霉素可能抑制部分但不是全部mTORC1功能。29,33雷帕霉素-FKBP12复合物可能干扰一些但不是所有mTORC1底物的磷酸化。因此，研究猛禽在内质网应激反应中的作用以及mTORC1的新底物是很有意思的。Rheb在内质网应激反应中的作用得到了以下观察结果的明确支持：Rheb活性的增加会使细胞对内质网胁迫敏感，而Rheb的敲除则会消除thapsigargin和tunicamycin诱导的细胞凋亡。未来研究阐明TSC1/TSC2下游Rheb和mTORC1依赖性功能在细胞调节中的机制，将为TSC1和TSC2在正常细胞生长调节、应激反应和肿瘤发生中的机制提供新的见解。

我们的研究进一步支持TSC1和TSC2抑癌基因在协调细胞生长与细胞外和细胞内信号的关键功能。TSC1和TSC2的一个关键生理功能是在不利条件下为细胞提供保护机制。由于TSC突变细胞对内质网应激高度敏感，内质网胁迫剂可选择性杀伤TSC细胞，可用于TSC治疗。Velcade是一种蛋白酶体抑制剂，被FDA批准为抗癌药物。我们推测Velcade可能对TSC也有好处。我们一直观察到，在TSC1组织特异性敲除小鼠模型中，注射Velcade可诱导TSC1−/−肝细胞凋亡（数据未显示）。雷帕霉素主要具有抑制TSC肿瘤生长的细胞抑制作用。鉴于雷帕霉素不能抑制内质网应激诱导的TSC突变细胞凋亡，因此可以考虑将雷帕霉素（抑制TSC细胞生长）和Velcade（诱导TSC细胞凋亡）联合用于TSC治疗。此外，我们的研究还表明，Velcade可能对TSC1或TSC2活性较低的癌症更有效，例如那些具有抑制TSC2的活化PI3K-AKT的癌症。

材料和方法

试剂和抗体

蛋白酶体抑制剂MG132、ER应激诱导剂thapsigargin和tunicamycin，以及α-微管蛋白抗体购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。雷帕霉素来自Calbiochem（美国加利福尼亚州圣地亚哥）。胱天蛋白酶-12、裂解胱天蛋白酶-3（Asp175）、裂解胱天蛋白酶-9（Asp353）、磷酸化-eIF2α，eIF2α、猛禽、TSC1和磷酸化p70 S6激酶（Thr389）抗体购自Cell Signaling（美国马萨诸塞州贝弗利）。抗ATF4、CHOP、XBP-1、肌动蛋白、U1 SnRNP 50、GAPDH、猛禽和TSC2的抗体来自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。抗-ATF6抗体购自IMGENEX（加利福尼亚州圣地亚哥，美国），抗Rheb抗体购自ProSci（加利福尼亚州波韦，美国）。CBP表位标签抗体购自Millipore（美国马萨诸塞州Billerica）。含有短发夹RNA（shRNAs）的质粒靶向鼠猛禽信使RNA（pLKO鼠shRNA1猛禽）和干扰对照shRNA质粒，从Addgene，Inc.（马萨诸塞州剑桥市，美国）获得。

慢病毒过度表达与shRNA质粒

用PCR方法扩增组成活性Rheb（RhebL64）并克隆到慢病毒过表达载体pCDH1-puro中。将Rheb靶向寡核苷酸克隆到pLKO.1慢病毒质粒中，生成Rheb shRNA。寡核苷酸序列如下：Rheb意义，5′-CCGGTAGGAAGGTGAGTCATACTCGAGTATACCTTTCCCACTAGTCATCATGACTAGTGGAAGGTATAAAAAAGTTAA-3′Rheb反义，5′-AATTGAAAAAATATGGAGTCATCAGTCATCACTCACTCATCATA-3′。慢病毒质粒在Stbl2活性细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中增殖并纯化，并与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G共同转染到HEK293T细胞中，用于病毒生产。已描述TSC1 shRNA序列。34TSC1靶向寡核苷酸被克隆到年龄我和生态pLKO.1慢病毒载体的RI位点。寡核苷酸序列如下：TSC1 shRNA义：5′-CCGGGGAGGTCAACGACTCTATAAAGCTTTAATAGAGCGTACCTCTTTTC-3′TSC1 shRNA-反义：5’-AATTGAAAAGGGGTCACGAGCTCTATAAGCTATAGAGCTCGTGTTGAC CTCCC-3′。将慢病毒质粒与psPAX2和pMD2.G共转染到HEK293细胞中进行病毒生产。编码小鼠猛禽shRNA或干扰shRNA的慢病毒被用于感染TSC1−/−MEF细胞。用编码TSC1 shRNA或干扰shRNA的慢病毒感染HeLa细胞。用嘌呤霉素筛选TSC1−/−MEF或HeLa的稳定shRNA表达池。

细胞培养

TSC1+/+和TSC1−/−MEF，以及TSC2+/+和TSC2−/−LEF细胞在补充10%FBS的DMEM中维持。为了产生Rheb过表达或敲低的细胞系，用慢病毒感染细胞2天，并在5μ培养基中的嘌呤霉素（g/ml）。

细胞系的产生

将pPGS-TSC2逆转录病毒质粒、pPGS载体、pQCXIH-Rheb野生型、pQCXIH-Rheb-S16H或pQCXIH逆转录病毒载体转染HEK293P细胞，制备逆转录病毒。使用编码TSC2或空pPGS载体的逆转录病毒感染TSC2−/−LEF细胞。用编码Rheb野生型、S16H或pQCXIH载体的逆转录病毒感染HeLa细胞。感染后48小时，用G418或潮霉素B筛选细胞。

细胞裂解物和核提取物的制备

为了制备细胞裂解物，用冰镇PBS清洗细胞两次，然后用裂解缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0，137 mM NaCl，1%Nonide P40，10%甘油，1 mM Na3VO4，1 mM-苯甲基磺酰基氟化物和蛋白酶抑制剂混合物）进行裂解（美国印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）。通过在4°C下离心10分钟制备细胞裂解物，并通过Bradford方法测定总蛋白浓度。

核提取物的制备如下：；细胞用冰镇PBS洗涤两次，然后在1.500×克10分钟后，颗粒在160分钟内再次悬浮μl缓冲液A（10 mM HEPES，pH 7.9，10 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM-EGTA，1 mM二硫苏糖醇和0.5 mM苯甲基磺酰氟）和细胞在冰上膨胀15分钟，之后40分钟μ加入2.5%的Nonide P-40中的l，并将试管剧烈旋转10秒。匀浆在12000下离心克持续5分钟。40分钟后，核芯块再次悬浮μl缓冲液C（20 mM HEPES，pH 7.9，0.4 M NaCl，1 mM EDTA，1 mM二硫苏糖醇和1 mM苯基甲基磺酰氟），并将管剧烈涡旋20分钟并以12000×克在4°C下冷冻5分钟，上清液在−70°C的等分溶液中冷冻。蛋白质浓度采用Bradford法测定。

蛋白质印迹分析

使用特定抗体和SuperSignal West Femto系统（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）通过SDS-PAGE和western blot分析解析细胞裂解物或核提取物进行检测。

RNA分离和实时逆转录PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen）从野生型或敲除细胞中分离总RNA，并使用SuperScript III逆转录酶（Invit罗gen）合成cDNA。使用带有Sybr Green（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）的TaqMan基因表达系统，通过实时PCR定量ATF4和CHOP的诱导。引物序列如下：ATF4正义，5′-CCTAGCTGGCTGAGAGG-3′ATF4反义，5’-CTGCTCC TTCTCATGC-3′CHOP正义，5'-TGAAACCATGGTTCC-3′CHOP反义，5'-GTGTCACAGTGTCA-3′肌动蛋白正义，5-TACACCACAGC-3′肌动蛋白反义，5-AAGAGC-3′AAGGAAGC-3’肌动蛋白反义。将所有值归一化为肌动蛋白mRNA水平，并根据ΔΔCT型方法：ΔΔCT型=ΔC采样速率-ΔC塔克汀.

细胞凋亡的流式细胞术分析

细胞用培养基、thapsigargin或tunicamycin处理24 h，收获并用PBS洗涤。细胞用annexin V-FITC和PI染色15 min（凋亡检测试剂盒，eBioscience，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国），并进行FACS分析。

致谢

这项工作得到了NIH（GM51586，CA108941）和DOD（KLG）的资助。我们感谢Joungmok Kim提供pQCXIH-野生型Rheb、pQCXIH-Rheb S16H质粒。

词汇表

间隙GTPase激活蛋白
TSC公司结节性硬化综合征
mTOR公司雷帕霉素的哺乳动物靶点
上调未折叠蛋白反应
CHOP公司C/EBP同源蛋白

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

Wafik El-Deiry编辑

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