介绍
S-丙炔半胱氨酸（SPRC）是S-烯丙基半胱氨酸的结构类似物，具有相同的半胱氨酸结构。SAC是老化大蒜提取物中的主要化合物之一，是由S公司-烷基半胱氨酸亚砜（ACS）。这种化合物具有抗肿瘤作用[1]
[2]，抗菌[3]，抗真菌[4]，抗肝毒性[5]，心脏保护性能[6]和凋亡[7]紫杉醇脂质体是抗癌药物紫杉醇的脂质体制剂，已成为治疗难治性卵巢癌、乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌的一线药物。因此，我们调查了在体外和体内SPRC的抗癌作用，并与SAC和紫杉醇脂质体进行比较。
胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）是转硫酶家族的成员，负责催化磷酸吡哆醛依赖的β-二硫键消除反应，从而产生铵、丙酮酸和硫代半胱氨酸。然后，硫胱胺可以与其他硫醇反应生成H2p53肿瘤抑制蛋白在细胞对DNA损伤和其他基因组畸变的反应中起主要作用。激活p53可导致细胞周期阻滞和DNA修复或凋亡。Bax是线粒体应激导致细胞凋亡的关键成分，而Bcl-2通过抑制线粒体细胞色素c的释放，对广泛的凋亡刺激发挥生存功能。在这里，我们首次发现SPRC的抗癌作用与硫化氢（H2S） -介导的途径。SPRC可通过CSE进行β-消除，产生内源性H2S、 其可能上调p53和Bax的基因表达从而抑制细胞增殖和凋亡。因此，我们的研究显示了内源性H的一种新的抗癌作用2S供体SPRC通过诱导新靶点CSE的活性治疗胃癌。我们首次证明SPRC能够抑制胃癌诱导的裸鼠模型中的细胞增殖和迁移以及肿瘤生长，这表明它可能是治疗人类胃癌的潜在药物。我们的结果表明，SPRC的抗癌作用归因于抑制细胞周期和诱导凋亡。此外，我们的结果还表明，SPRC可以调节CSE、Bax和p53的基因表达。我们发现，CSE活性抑制剂PAG可以显著抑制SPRC的抗癌作用。
结果
SPRC对SGC-7901细胞的剂量依赖性、生长抑制及抑制作用检测
SPRC对SGC-7901胃癌细胞的作用1 uM和10 uM SPRC对SGC-7901细胞的活性产生18-25%的抑制作用。20 mM至30 mM SPRC导致约50%的细胞存活抑制。我们还发现，低浓度（1μM和10μM）的SPRC可显著抑制SGC-7901的集落形成和迁移能力；与SAC相比，这些影响更为显著(). CSE抑制剂PAG阻断SPCR对细胞生长的抑制作用(). 这些结果表明，CSE通路参与了SPRC诱导的细胞生长抑制。
SPRC处理对SGC-7901细胞的生长抑制。
答：。SPRC对SGC-7901细胞生长抑制作用的剂量反应研究。B。SPRC、SAC、PAG、PAG+SPRC和紫杉醇脂质体对SGC-7901细胞活性的影响。C、。SPRC、SAC、PAG、PAG+SPRC和紫杉醇脂质体对SGC-7901细胞集落形成的影响。D。SPRC、SAC和紫杉醇脂质体对SGC-7901细胞迁移能力的影响。通过伤口闭合试验检测细胞迁移能力。E.公司。SPRC、SAC和紫杉醇脂质体对伤口闭合速度的影响。数值以控制百分比表示。*代表对照组与SPRC、SAC和紫杉醇脂质体组之间的显著差异（p<0.01）。#表示SPRC组与SPRC+PAG组之间存在显著差异（p<0.01）。
形态学变化、凋亡和细胞周期分析
细胞凋亡[21]是程序性细胞死亡，其特征是特定的结构变化，包括细胞收缩、核浓缩和DNA断裂。Hoechst染色观察紫杉醇脂质体、SPRC和SAC处理后细胞的形态学变化。如所示电镜观察显示，经SPRC ed处理24小时后，SGC-7901细胞发生了以凋亡为特征的形态学变化。细胞表现出密集的染色模式，DNA断裂，没有明显的核膜。对照细胞没有表现出类似的形态学变化。流式细胞术检测SPRC诱导细胞凋亡的作用(); 与对照组相比，用10 uM SPRC处理SGC-7901细胞24小时后，凋亡小体显著增加约26%。相比之下，紫杉醇脂质体和SAC处理组的凋亡细胞百分比分别减少约8%和4%。
SGC-7901细胞的形态学分析。
答：。24小时内用SPRC、SAC、PAG、PAG+SPRC和紫杉醇脂质体（10μM）处理，在荧光显微镜下分析凋亡变化。B。流式细胞仪分析凋亡细胞。C、。细胞周期分布。图片上的标记表示：1、控制。2、SPRC 10 uM。SAC 10 uM.4。第10页，上午5点。SPRC+PAG，每个10 uM。紫杉醇脂质体10μM。
通过碘化丙啶染色和流式细胞仪检测，分析SPRC对SGC-7901细胞周期活性的影响。SPRC诱导SGC-7901细胞在G1/S相(). 10 uM SPRC还导致G细胞中24%的细胞积累增加1与对照组相比，细胞周期S期的细胞减少了20%。这表明G中存在阻塞1/S相转变，可能导致细胞生长抑制或凋亡。SPRC的促凋亡作用及其对G期细胞周期阻滞的影响1/PAG对S相也有很大的抑制作用。
SPRC对CSE蛋白表达和活性及H的影响2S级
CSE蛋白在SGC-7901细胞中的表达()裸鼠体内的肿瘤()SPRC治疗显著增加。50 mg/kg和100 mg/kg剂量的SPRC显著增加CSE活性约1.4倍(). SPRC治疗的裸鼠肿瘤中CSE活性高于SAC治疗组的肿瘤组织。H（H）2细胞培养基中的S水平()，裸鼠血浆()进行了测量。H210 uM SPRC处理细胞培养液中的S水平和血浆H250 mg/kg和100 mg/kg SPRC处理裸鼠的S也显著高于对照组（P<0.05）。与SAC处理组小鼠相比，SPRC处理组的H2S水平（P<0.05）。CSE蛋白表达、CSE活性和H水平升高2经PAG治疗后，SPRC治疗组的S均显著降低。因此，这些实验的结果表明，SPRC的抗癌作用是由CSE/H的激活介导的2S通路。
SPRC、SAC、PAG、PAG+SPRC和紫杉醇脂质体对SGC-7901细胞（A、B、C）CSE蛋白表达的影响；裸鼠胃肿瘤（D，E，F）。对于一，车道1，控制组；巷2，紫杉醇脂质体10μM；3号车道，SPRC 1 uM；4号车道，SPRC 10 uM；SAC 10 uM第5车道；6号车道，控制组；7号车道，SPRC 10 uM；第8车道，PAG 10 uM；9号车道，PAG+SPRC 10 uMD类：车道1，控制；巷2，紫杉醇脂质体10 mg/kg；车道3，SPRC 50 mg/kg；车道4，SPRC 100 mg/kg；车道5，SAC 100 mg/kg；车道6，控制；车道7，SPRC 100 mg/kg；车道8，PAG 100 mg/kg；通道9，PAG+SPRC 100 mg/kg。相对强度通过使用密度测定法与GAPDH的强度进行比较来计算（如右图所示）。*对照组与SPRC、SAC和紫杉醇脂质体治疗组之间存在显著差异（p<0.05）。#表示SPRC 10 uM组与SPRC+PAG组之间存在显著差异。图G公司显示所有组胃癌中的CSE活性（µmol/g）。图H（H）显示H2细胞培养基中的S水平（µM）。图我显示血浆H2不同组裸鼠胃肿瘤中的S水平。
SPRC和SAC对Bax、p53和Bcl-2基因表达的影响
评估SPRC对SGC-7901细胞的生长抑制作用，分析其对细胞周期活性和凋亡调节基因Bax、p53和Bcl-2表达的影响。如所示我们发现，24小时SPRC处理显著增加了SGC-7901细胞p53和Bax的mRNA水平（约1.5倍）和蛋白质水平。
SPRC、SAC和紫杉醇脂质体对SGC-7901细胞Bax、p53和Bcl-2蛋白表达的影响。
答：。巷1，紫杉醇脂质体10μM；车道2，控制；车道3，SPRC 10μM；4号车道，SPRC 1 uM；车道5，SAC 10μM；通道6，SAC 1 uM。相对强度通过使用密度测定法与β-肌动蛋白的强度进行比较来计算（如右图所示）。B。Bax、p53和Bcl-2 mRNA表达的量化。*在p<0.05水平上，对照组与SPRC、SAC和紫杉醇脂质体之间具有显著性差异。
生长抑制[22]SPRC诱导肿瘤细胞凋亡
通过肿瘤体积评估，SPRC每周三次，每隔一天治疗50 mg/kg和100 mg/kg体重，IR为40–75%，可显著降低胃癌的发展(). SPRC治疗组的肿瘤重量也显著减轻()而PAG处理显著降低了SPRC的生长抑制功能。不同组的代表性肿瘤表现出明显的肿瘤大小变化().
腹腔注射SPRC、SAC和紫杉醇脂质体对雄性裸鼠胃癌生长的影响。
答：。平均肿瘤体积变化（mm三).B。不同天数对肿瘤生长的抑制率（IR）。C、。肿瘤重量变化。D。肿瘤大小的变化。E.公司。
体内裸鼠治疗24天后的肿瘤成像。*表示对照组与SPRC、SAC和紫杉醇脂质体治疗组之间存在显著差异（p<0.05）。#表示SPRC 100 mg/kg组与SPRC+PAG组和PAG治疗组之间存在显著差异（p<0.05）。F、。H.E.染色，在右角放大4×10和更大的放大图片（100×10）。G.公司。胃肿瘤凋亡小体隧道染色（100×10）。图片上的数字标记表示：1、对照组；紫杉醇脂质体10mg/kg组；3、SPRC 50mg/kg组；4、SPRC 100mg/kg组；5、SAC 100 mg/kg组。
我们还检查了SPRC对肿瘤生长的抑制是否反映在肿瘤细胞的凋亡中。H&E染色显示()紫杉醇脂质体和SPRC治疗组的肿瘤细胞凋亡更多。TUNEL染色显示，与对照肿瘤相比，SPRC治疗的小鼠肿瘤的凋亡小体数量显著增加(). 肿瘤中细胞凋亡发生率的增加与SPRC对肿瘤生长的抑制作用一致，表明SPRC对肿瘤生长的抑制部分是通过增加肿瘤中的细胞凋亡来实现的。
SPRC和SAC对蛋白和mRNA表达的影响[23]Bax、p53和Bcl-2
通过Bax、p53和Bcl-2进一步评估SPRC对胃癌的抑制作用。SPRC的这种作用也在胃癌诱导的裸鼠中得到证实，如与对照肿瘤相比，SPRC治疗的肿瘤中Bax和p53的蛋白和mRNA水平显著升高，而Bcl-2的蛋白和mRNA水平降低。免疫组化检测这三种蛋白在肿瘤组织中的定位和数量。如所示，对照组未观察到凋亡前蛋白Bax和p53的明显免疫染色，而SPRC和紫杉醇脂质体处理组则观察到强烈的免疫反应信号。在SPRC、紫杉醇脂质体和SAC处理组中检测到抗凋亡蛋白Bcl-2的弱阳性染色这些结果表明，SPRC能够调节Bax、p53和Bcl-2的基因表达，促进细胞凋亡。
SPRC、SAC和紫杉醇脂质体24天治疗对胃癌裸鼠Bax、p53和Bcl-2的影响。
答：。蛋白表达，通道1控制；Lane 2紫杉醇脂质体10 mg/kg；车道3 SPRC 50 mg/kg；车道4，SPRC 100 mg/kg；通道5，SAC 100 mg/kg。通过使用密度测定法与β-肌动蛋白的强度进行比较，计算相对强度。B。mRNA表达*代表对照组与SPRC、SAC和紫杉醇脂质体治疗组之间的统计显著性（p<0.05）。C、。促凋亡蛋白Bax的免疫组织化学染色。D。促凋亡蛋白p53的免疫组织化学染色。E.公司。促凋亡蛋白Bcl-2的免疫组织化学染色。中图片上的数字标记表明：1、对照组；紫杉醇脂质体10 mg/kg；3、SPRC 50 mg/kg；4、SPRC 100 mg/kg；5、SAC 100 mg/kg。
H（H）2S对SGC-7901细胞和裸鼠胃癌模型显示促凋亡和抗增殖作用
我们发现SPRC增加了CSE活性，导致H升高2S水平，进而调节Bax、p53和Bcl2的基因表达。Bax通过增加Mt表达和减少Bcl-2表达直接诱导线粒体驱动的凋亡。p53抑癌蛋白在细胞对DNA损伤和其他基因组畸变的反应中起主要作用。激活p53可通过Bax蛋白抑制细胞增殖和DNA损伤或凋亡这些结果表明，SPRC通过CSE/H发挥抗癌作用的新机制2S通过p53/Bax途径诱导细胞生长抑制和凋亡。
H（H）2S对SGC-7901细胞和裸鼠胃癌模型显示促凋亡和抗增殖作用：SPRC增加CSE活性，导致H升高2S级。H2S水平的增加反过来调节了Bax、p53和Bcl2蛋白和mRNA的表达。Bax通过Mt和Bcl-2的表达诱导细胞凋亡。p53通过Bax蛋白导致细胞增殖和DNA损伤的抑制或细胞凋亡。
讨论
在这项研究中，我们证明了SPRC对胃癌的一种新的抗癌作用，并为其可能的机制提供了数据。我们的研究产生了几个新的观点。首先，我们证明SPRC能够显著降低细胞生长能力，并抑制SGC-7901细胞的迁移。其次，我们发现SPRC能够增加凋亡相关的形态学变化，并诱导凋亡细胞百分比的大幅增加，同时在G1/S相。综上所述，这两项发现支持SPRC对SGC-7901细胞具有抑制作用的证据。第三，我们进一步证明，每隔一天腹腔注射50和100 mg/kg体重的SPRC，每周三次，可以有效抑制裸鼠胃肿瘤的生长。第四，我们发现SPRC可以增加CSE活性及其蛋白表达，导致H升高2裸鼠细胞培养液和血浆中的S水平。第五，我们发现作为CSE抑制剂的PAG可以在很大程度上抑制SPRC的上述功能。第六，我们发现SPRC治疗导致Bax和p53的mRNA和蛋白表达明显升高。
据报道，H2S公司[24]
[25]
[26]可由吡哆醇-5-磷酸依赖酶CSE在胃癌细胞中生成，L-半胱氨酸是其底物。CSE公司[27]能催化磷酸吡哆醛依赖的β-二硫化物和消除反应，导致铵、丙酮酸和硫代半胱氨酸的形成。硫胱胺然后与其他硫醇反应形成H2S.PAG已用于多项研究，以测试抑制内源性H的生物效应2S生产[28]SAC的类似物SPRC具有含半胱氨酸的结构，可以进行β-消除，并作为CSE的底物。SPRC中的关键炔丙基可能与CSE的活性位点结合以增加CSE活性。在我们的研究中，SPRC治疗组胃癌细胞和裸鼠肿瘤中CSE蛋白表达明显增加；这可以解释为产生H的“补偿性效应”2以应对癌细胞的凋亡。H处理人肺成纤维细胞2S供体NaHS表现出DNA损伤、细胞周期阻滞和p53稳定增加，以及下游蛋白如p21、Bax和细胞色素c的诱导[29]据报道，H2S已被证明可诱导凋亡，其原因是caspase 3的激活、Bcl-2蛋白水平的降低和Bax表达的激活。H（H）2S还通过激活p38 MAPK增强内质网应激诱导胰岛素分泌β细胞凋亡[30]据报道，p53通过增加Bax等促凋亡基因的转录活性或抑制Bcl-2家族抗凋亡基因的活性来诱导凋亡[31]
[32]Bax还可诱导线粒体驱动的凋亡。这里我们还发现CSE的激活和H的增加2SPRC治疗后的S水平与胃细胞和肿瘤中p53和Bax表达升高相结合。这些结果提示了SPRC通过CSE/H发挥抗癌作用的新机制2S通过p53/Bax途径诱导细胞生长抑制和凋亡。
总之，我们的在体外和体内实验结果表明，硫化氢供体SPRC对胃癌具有明显的抑制和促凋亡作用。SPRC可增加CSE活性，导致H水平升高2S、 进而调节Bax、p53和Bcl2的基因表达。
方法
所有动物实验方案均符合地方当局的《动物管理规则》和复旦大学实验动物中心的《实验动物的护理和使用》。
伦理委员会批准研究的详细信息
动物资质证书编号：SCXK沪（上海）2009-0019
研究批准文号：复旦大学实验动物研究部，批准文号SYXK-hu（上海）2009-0082
提名评审委员会：主席：朱一准教授复旦大学药学院院长。副主席：卢维岳教授、吴伟教授、孙勋教授、周文江教授
成员：张云毅教授、李聪教授、姜晨教授、尹耿利教授、洪美吉教授、李旭阳教授。
秘书：陶林林
化学制品
通过L-半胱氨酸与炔丙基溴反应合成了SPRC。通过乙醇-水重结晶纯化产物。最终产物经1H核磁共振波谱验证。SAC是从东京Kasei（日本东京）购买的。紫杉醇脂质体是新加坡绿野制药集团有限公司赠送的礼物。丙炔甘氨酸（PAG）购自中国上海银正化工有限公司。MTT（二甲基噻唑基四唑溴化铵）购自美国AMRESCO公司。Hoechst染色、细胞周期和凋亡分析试剂盒购自中国Beyotime。RPMI 1640培养基购自美国GIBCO™Invitrogen。Bax、P53和Bcl2的兔多克隆抗体购自美国Cell Signaling，CSE的山羊多克隆抗体来自美国Santa Cruz。SuperScript II RT试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix购自日本Takara。隧道染色试剂盒购自德国CALBIOCHEM。
细胞系和培养
人胃癌（SGC-7901）细胞取自中国上海生物科学研究所细胞库，在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养，培养瓶温度37°C，加湿5%CO2孵化器。细胞被喂入直至汇合，并通过胰蛋白酶化进行扩张，然后在新的培养瓶中进行低数量的亚培养。
MTT分析
采用Arumugam等人的方法进行了MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）测定。[8]稍作修改。简单地说，将含有约8000至10000个细胞的悬浮细胞添加到96 well培养板的每个孔中，并在37°C的95%空气和5%CO的湿润环境中培养24小时2将SPRC、SAC和紫杉醇脂质体溶解在培养基中，并添加到96个平板中的细胞中。将10种最终浓度的SPRC（1μM、10μM、100μM、1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM和30 mM）、SAC（1 uM和10μM）和紫杉醇脂质体（10 uM）添加到细胞中，以研究它们对细胞活力的影响。还研究了10uM SPRC和10uM PAG联合治疗的效果。24小时后，将100µL的1 mg/ml MTT溶液添加到每个孔中，然后重新培养4小时。去除MTT溶液后，添加100µL二甲基亚砜，摇晃平板10分钟。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）阅读器测量96周培养板的光密度。使用以下公式将处理井的光密度转换为对照组活细胞的百分比（“细胞存活率”）：
集落形成分析
根据Wang等人（1998年、2003年）的方法进行菌落形成实验[9]
[10]制备单细胞悬浮液，并以每孔150个细胞的密度在12孔板中培养。种植24小时后，添加2种浓度的SPRC（10 uM，1 uM）和SAC（10 uM，1 uM）。还进行了10uM SPRC和10uM PAG联合处理的实验研究。细胞孵育6天。然后将细胞固定在70%乙醇中，并用1%吉姆萨蓝染色。对由>50个细胞组成的菌落进行评分，并与正常对照组进行比较。每个实验重复三次。
赫斯特染色法
细胞凋亡[11]
[12]使用Hoechst染色试剂盒（Beyotime）测定。用SPRC（10 uM）、SAC（10 uM）、紫杉醇脂质体（10 uM）以及SPRC和PAG联合用药（各10 uM，共24小时）处理SGC-7901细胞。将细胞在PBS中冲洗两次，然后在4°C下固定10分钟，然后用亲核染料Hoechst 33258染色5分钟。在PBS中进行最后冲洗后，将细胞安装在防褪色剂moiwol中，并在紫外线下用荧光显微镜观察。因为这种染料同时染色凋亡细胞和非凋亡细胞，所以凋亡细胞被鉴定为染色质凝聚和核碎裂的细胞。
流式细胞术分析细胞周期相分布和检测凋亡
所有细胞首先以2.5×10的密度进行电镀56孔板中的细胞/孔。与SPRC、SAC、紫杉醇脂质体孵育24小时后，分离细胞并收集到流式细胞仪管中，以1000 rpm离心5分钟，获得细胞颗粒。
细胞凋亡测定
根据制造商的说明，使用细胞凋亡检测试剂盒（Beyotime）对细胞进行染色。用PBS洗涤细胞颗粒两次。将1×结合缓冲液添加到1×106细胞/ml，然后在黑暗中添加PI。在黑暗中培养30分钟后，立即使用Cyan流式细胞仪（BD-FACSCalibur）和ModFit软件对细胞进行分析。
细胞周期分析
通过Herman-Antosiewicz等人的方法进行细胞周期分析[13]简单地说，细胞在37°C下单独在培养基和含有SPRC、SAC和紫杉醇脂质体（10 uM）的培养基中培养24小时。细胞用冷PBS清洗，固定在70%乙醇中，并在4°C下保存，以进行后续的细胞周期分析。用PBS清洗固定细胞一次，然后将其重新悬浮在1mL PI染色试剂中（50mg/mL碘化丙啶和1ml柠檬酸钠缓冲液中1mg/mL RNA酶，pH 7.4）。在细胞周期分析之前，样品在黑暗中培养30分钟。使用Cyan流式细胞仪（BD-FACSCalibur）分析系统测量细胞在细胞周期中的分布，并使用Multi-cycle Software（ModFit软件）定量细胞周期分布。计算G1、S和G2期细胞的百分比。
伤口愈合分析
将细胞接种到6孔培养板中，并允许其生长到90%的汇合处。使用无菌移液管尖端将类似大小的伤口导入单层细胞。用PBS冲洗受伤的单层细胞3次，以清除细胞碎片；然后以两种浓度（1μM，10μM）和紫杉醇脂质体（10 uM）添加SPRC和SAC。12小时和24小时后，对伤口闭合速度进行监测和拍照。用以下公式计算处理细胞与对照细胞伤口闭合的比较速度：（0小时处理细胞的伤口宽度-24小时伤口宽度）/（0小时对照细胞的伤口宽-24小时的伤口宽度）×100。
定量实时PCR
使用SuperScript II RT试剂盒（日本塔卡拉）用寡核苷酸（dT）引物逆转录总RNA。采用实时PCR和Step One PCR系统（Applied Biosystems）检测Bcl2、Bax和P53 mRNA的表达。将2 ul反转录cDNA产物添加到包含10 ul SYBR Premix EX Taq（2×）、0.4 ul ROX参考染料（50×）、0.4uM正向引物和0.4uM奖励引物的20 ul反应混合物中。循环条件如下：在95°C下预孵育30 s，然后在95°C40个循环变性5 s，在60°C下退火和延伸31 s。循环完成后，进行熔融曲线分析以确定PCR产物的特异性。相对定量值用ΔΔC表示T型方法。对照组用作参考样品，β-肌动蛋白用作内源性对照。每个实验重复进行三次。引物序列和预期产物大小如下：人类β-肌动蛋白：正向，5′-CGTGGACATCCGCAAAG-3′和反向，5′-tggaagggtggaagcga-3′（201个基点）；人体Bax：向前，5′-ATGCGCCACAAGAAGC-3′和反向，5′-GTCACGGCGGCAATCA-3′（95个基点）；人类bcl2：正向，5′-AACTGGGGGAGGATTGTG-3′和反向，5′-AGGTGCCGGTTCAGGTAC-3′（128个基点）；人类p53：正向，5′-ACCACCACTACACTA-3′和反向，5′-AAAACACGCACTCTAAGC-3′（136个基点）。
蛋白质印迹分析
细胞被镀到培养皿中，并用SPRC（1 uM，10 uM）、SAC（1 uM，10 uM）和紫杉醇脂质体（10 uM”）处理24小时。处理24小时后，用冷PBS清洗细胞两次。将每个样品中的细胞溶解在RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1%NP40、0.1%SDS、10 mM脱氧胆酸钠、1 mM苯甲基磺酰基氟化物）中，并在冰上保存30分钟。细胞裂解物在4°C下以10000 g离心10分钟，上清液在−70°C下保存，直到检测。蛋白质浓度用Bradford法测量。25微升每组蛋白质混合5微升用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离负载缓冲液并转移到聚偏氟乙烯膜上[14]在室温下，将膜在含0.05%吐温20（TBST）的Tris-buffer盐水中的5%脱脂奶粉中封闭2小时。然后用多克隆CHT（胱硫醚γ-裂解酶）/CSE Ab（1∶500，美国Santa Cruz）、多克隆Bcl-2 Ab（1:1000，美国Cell Signaling）、多cloal Bax Ab（1:1000，美国Cell-Signaling）和多克隆p53 Ab（1:2500，美国Cel Signaling）在4°C下过夜，对所得的印迹进行检测。在室温下（1∶2000，加利福尼亚州圣克鲁斯），用TBST清洗膜三次，每次10分钟，然后用抗兔（针对Bax、p53和Bcl-2 Ab）和抗羊（针对CSE Ab）二级抗体培养2小时，然后再用TBST清洗三次，每个10分钟。根据制造商的说明，使用ECL Western blotting检测系统（美国阿尔法成像公司）检测免疫反应蛋白。为了测量每个基因的表达，通过使用密度测定法比较β-肌动蛋白（对于Bax、p53和Bcl-2）和GAPDH（对于CSE）的强度来计算相对强度。
人和小鼠血浆H的测定2S浓度
测量H2S浓度，每组500µL培养基（n=6，1×106向含有乙酸锌（1%w/v；250µL）的微管中添加75µL裸鼠血浆（n=6）、75µL胃癌患者血浆（n=3）和425µL蒸馏水。随后，N、 N个-二甲基-第页-在7.2 M HCl中添加硫酸苯二胺（NNDPD，20µM；133µL），然后添加氯化铁三（30µM；133µL）在1.2 M盐酸中的溶液。然后使用三氯乙酸（TCA，10%w/v；250µL）参与任何蛋白质。使用96-well微孔板阅读器（Tecan Systems Inc.，瑞士）在670 nm处测量所得溶液的光学吸光度。
裸鼠人胃癌模型的建立
雄性裸鼠，年龄3–4周，体重18–20 g，购自动物实验中心（中国上海生物科学研究所），在特定的无病原（SPF）条件下繁殖，饲养在网箱中，温度（23±3°C）和相对湿度（50±20%）可控条件下，每小时换气10-15次，每天照明12小时。动物们可以获得食物和纯净水即兴演奏.
注入200µL（1×107将每个部位的SGC-7901细胞制成裸鼠侧翼，以建立荷瘤小鼠模型[15]
[16]植入后约25天，取出轴承肿瘤。在切除标本的坏死组织和非癌组织后，剩余的癌组织被切成约1毫米的小块三尺寸。将肿瘤块直接植入裸鼠两侧建立胃肿瘤模型。植入后7天，当肿瘤直径达到约0.3–0.5 cm时，将荷瘤裸鼠分为对照组（n=5）、紫杉醇脂质体（10 mg/kg）治疗组（n=5）、SPRC（50 mg/kg和100 mg/kg）处理组（各n=8）、SAC（50 mg/kg和100 mg/kg）处理小组（各n=8） SPRC（100mg/kg）+PAG（100mg/kg）联合治疗组（n=8）。所有小鼠每隔一天腹腔注射100 ul不同治疗组的相应药物，而对照组注射无菌水。
一般观察和肿瘤测量
每天观察小鼠的一般情况。每7天对裸鼠称重并测量肿瘤大小。首先测量每个肿瘤的长度（L）和宽度（W）；然后使用公式V=W计算体积2×L×0.5，其中L为最长直径，W为最短宽度。根据肿瘤体积计算肿瘤生长抑制率（IR）：IR（%）=（1−治疗组体积/对照组体积）×100%。在治疗24天后，终止实验，用断头处死小鼠。尸检时采集的肿瘤[17]称重并切片，用铝箔包裹新鲜组织样品，并立即在液氮中冷冻[18].所有动物程序均按照标准方案和正确护理和使用实验动物的标准建议进行。
H.E和TUNEL染色
H.E和Tunnel染色检测细胞凋亡和坏死。将胃肿瘤生长的冷冻样品切成5µm厚的切片，贴在经3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APES）处理的载玻片上。用4%多聚甲醛溶液固定载玻片。通过Olympus DP72显微镜相机对载玻片进行观察和成像，并通过Image Pro 7软件进行分析。
实时PCR、western blot和免疫组化分析
我们分析了肿瘤组织中CSE、Bax、p53和BCL-2的蛋白水平（western blot方法[19]如协议1所述）。对于免疫组织化学染色，将肿瘤组织载玻片在室温下用ass血清封闭1h，并与兔抗Bax、抗p53和抗Bcl2（1∶1000，细胞信号）在4°C下孵育过夜，然后与抗兔二级抗原在室温下孵育1h并染色。在每一步之间，用PBS将载玻片冲洗3倍。用奥林巴斯DP72显微相机对载玻片进行观察和成像，并用Image Pro 7软件进行分析。Bax、p53和Bcl-2的mRNA水平也通过实时PCR进行评估（方法、引物序列和预期产物大小与方案1相同）。
CSE活动的测量
如前所述，对CSE活性进行分析。简单地说，将0.1 g肿瘤组织（每组6个）在冰上解冻，并在2 mL 100 mM冰镇磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中均质。组织匀浆在4°C下以12000 g离心10分钟，然后使用上清液进行分析。反应混合物包含20µL 10 mM L-半胱氨酸、20µL2 mM吡哆醇-5-磷酸盐、30µL PBS和430µL组织匀浆。通过将反应混合物从冰中转移到37°C水浴中30分钟来启动催化反应。然后使用注射器将250µL 1%乙酸锌添加到试管中，以捕获释放的H2接下来，添加250µL 10%TCA以淬火酶反应。最后，在7.2 M HCl和133µL FeCl中加入133μL NNDPD三添加1.2 M HCl。使用96-well微孔板阅读器（瑞士帝肯系统公司）在670 nm处测量最终反应混合物的吸光度。所有样品均进行了两次化验，H2使用NaHS（3.125µM−250µM）根据校准曲线计算每个样品的S浓度。结果以µmol/g表示。蛋白质含量是使用BCA检测试剂盒（Beytime Biotechnology，中国）测定的。
统计分析
所有值均表示为平均值和标准偏差。采用单因素方差分析（ANOVA）检查各组之间的统计比较。使用双尾Student’st吨-测试[20]。概率值<0.05表示统计显著性。所有分析均使用SPSS 12.0进行。
