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生物化学杂志。2011年6月3日；286(22): 19381–19391.
2011年4月13日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M111.218040
预防性维修识别码：PMC3103316型
PMID：21489989

丝氨酸/苏氨酸激酶17A是一种新的p53靶基因，是睾丸癌细胞顺铂毒性和活性氧的调节剂*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

毛平平,1 玛丽·海弗,1 林恩·尼马斯齐克, 杰西卡·哈格达尔, Esty G.Yanco公司, 达马扬蒂·德赛, 马龙·J·贝鲁西, 乔安娜·S·凯利-哈密尔顿, 莎拉·J·弗里曼特尔,和迈克尔·斯皮内拉2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

以顺铂为基础的治疗可以高度治愈睾丸癌，睾丸癌衍生的人类胚胎癌（EC）细胞对顺铂具有p53显性转录反应。在这项研究中，我们发现丝氨酸/苏氨酸激酶死亡相关蛋白家族的一个特征较差的成员，STK17A型（也称为DRAK1系列)是一个新的p53靶基因。p53 siRNA可阻止EC细胞株NT2/D1中顺铂介导的STK17A诱导。此外，顺铂可在HCT116和MCF10A细胞中诱导STK17A，但在等基因p53抑制细胞中诱导的程度要小得多。一个以顺铂依赖的方式结合内源性p53的功能性p53反应元件被鉴定为第一个编码外显子上游5kbSTK17A。STK17A型不存在于小鼠基因组中，但在小鼠NIH3T3细胞中用顺铂诱导紧密相关基因STK17B，尽管这种诱导是p53独立的。有趣的是，在含有这两者的人类细胞中STK17A型和STK17B型，只有STK17A是由顺铂诱导的。STK17A的敲除使EC细胞对顺铂诱导的生长抑制和凋亡细胞死亡产生抵抗。这与解毒和抗氧化基因的上调有关，包括金属硫蛋白MT1H公司,MT1M公司、和MT1X公司这以前与顺铂耐药有关。此外，STK17A的敲除导致细胞活性氧物种减少，而STK17A的过度表达增加了活性氧物种。总之，我们已经确定STK17A型作为p53的新直接靶点和睾丸癌细胞中顺铂毒性和活性氧的调节剂。

关键词：抗氧化剂、一般转录因子、金属蛋白、p53、肿瘤抑制因子、DNA损伤、DRAK2、睾丸癌、顺铂、活性氧

介绍

p53抑癌基因在预防肿瘤形成中起着关键作用，并在多种细胞应激反应中被诱导，包括主要导致细胞凋亡或细胞周期阻滞的DNA损伤(1). p53的其他公认作用包括调节基因组稳定性、DNA修复、衰老、自噬、活性氧生成和代谢(1,2). p53的作用主要由其对特定靶基因的有效转录调节介导。由于p53在DNA损伤反应期间被高度诱导，因此它在决定癌细胞在细胞毒治疗中是存活还是死亡方面有着重要的作用，但尚未完全被理解。此外，p53调控和下游靶基因激活可能与细胞类型和环境有关，这使得很难解开完整的p53转录网络(三). 识别DNA损伤过程中诱导的新的p53靶基因可能揭示p53肿瘤抑制的新机制，并提供新的治疗机会。

睾丸生殖细胞瘤三即使在疾病高度进展的情况下，以顺铂为基础的联合治疗仍能使患者治愈，治愈率接近90%(4). 这些反应与患者、异种移植物和胚胎癌培养物（TGCT的假定干细胞）中的快速和广泛凋亡有关(5,6). 然而，对化疗过敏的机制尚不清楚。因为第53页基因很少在TGCT患者中发生突变，有人认为p53可能在TGCT发育过程中具有独特的潜伏性，并可能在介导TGCT对DNA损伤剂的超敏反应中发挥特殊作用(5–8). 使用微阵列分析，我们先前发现胚胎癌细胞对顺铂的转录反应主要由p53靶基因的诱导决定(9). 除了许多众所周知的直接p53靶基因外，还有一些以前与p53无关的顺铂诱导基因，包括丝氨酸/苏氨酸激酶17A(STK17A型).

STK17A是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的死亡相关蛋白（DAP）家族的成员，包括原型家族成员DAPK1、DAPK2和DAPK3（拉链相互作用蛋白激酶）(10–12). STK17A（DRAK1）和STK17B（DRAK2）是DAPK家族中亲缘关系较远、特征较少的成员(13). DAPK1与多种细胞死亡相关信号通路有关，包括导致自噬和凋亡细胞死亡的信号通路，DAPK1的表达在多种癌症中受到抑制(10–12). 尽管有许多提议的途径和底物，DAP家族激酶诱导细胞死亡的确切机制，包括磷酸化的关键底物，仍需进一步阐明。

与DAPK1相比，将STK17A和STK17B与凋亡或细胞死亡联系起来的证据要少得多。虽然STK17A和STK17B在催化激酶结构域中具有中等同源性，但都缺乏死亡结构域和Ca2+/DAPK1的钙调素调节域(10–13). 先前的一份报告表明，STK17A在NIH3T3细胞中的过度表达对集落形成产生了负面影响，这意味着STK17A也可能具有生产活性(13). 有趣的是，STK17A型存在于人类和啮齿类动物之间的染色体断裂区附近，而不存在于小鼠或大鼠基因组中(14). 小鼠STK17B基因敲除表明该蛋白负调节T细胞活化，但在这种情况下似乎不直接调节细胞凋亡(15,16).

我们在这里证明了这一点STK17A型是p53的一个新的直接靶基因。STK17A被DNA损伤剂顺铂以p53依赖性的方式上调，p53直接结合在细胞的上游元件上STK17A型基因。STK17A在人类胚胎癌（EC）细胞中的敲除导致顺铂耐药，与解毒和抗氧化基因的表达增加以及活性氧（ROS）水平降低相关，表明STK17A在TGCT顺铂毒性的介导中发挥作用。

实验程序

细胞培养和药物治疗

NT2/D1、U2OS、293T和NIH3T3（美国组织培养标本馆（ATCC））在添加了谷氨酰胺和抗生素的10%胎牛血清的DMEM中培养。NT2/D1耐药细胞系NT2/D1-R1的衍生过程如前所述(17). HCT116结肠癌细胞系p53+/+和p53−/−是B.Vogelstein博士（约翰·霍普金斯大学）的礼物，并在DMEM中培养。MCF10A永生化乳腺上皮细胞和稳定转染p53 shRNA的MCF10A/Δp53细胞系如前所述，由A.Eastman博士（达特茅斯医学院）慷慨提供，并在补充有10%FBS、8μg/ml胰岛素、29 ng/ml表皮生长因子和500 ng/ml氢化可的松的DMEM/F-12中培养(18). ED1细胞是由E.Dmitrovsky博士（达特茅斯医学院）善意提供的小鼠肺癌细胞系，在含有10%血清的RPMI 1640培养基中培养(19). 胶质母细胞瘤细胞株A172在DMEM和5%的血清中培养，这是M.Israel博士（达特茅斯医学院）赠送的礼物。顺铂（Bristol Laboratories Ltd.）在指定的浓度和时间点进行治疗。

实时PCR和免疫印迹分析

使用TaqMan RT试剂盒（Applied Biosystems）对1μg RNA进行反转录。cDNA（20 ng）与SYBR Green（Applied Biosystems）一起用于实时定量PCR分析，使用ΔΔC类t吨方法标准化为GAPDH和ABI棱镜序列检测系统7700。底漆提供于补充表S1为了进行Western分析，细胞在放射免疫沉淀缓冲液中进行裂解，并用SDS-PAGE进行分离，如前所述(9). 使用STK17A（IMG-157-1，Imgenex）、p53（DO-1，sc0126，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和肌动蛋白（C-11，sc01615，Santa Cruz Bietechnologies，Inc.）抗体。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

简言之，1×107细胞/15cm培养皿用2.0μ米顺铂，10小时后用1%甲醛在37°C下固定10分钟。细胞在存在蛋白酶抑制剂的ChIP裂解缓冲液中进行裂解，并在Vibra细胞声波仪（Danbury，CT）上以20%振幅在冰上超声11×15-s脉冲。稀释样品与预先结合到G蛋白偶联Dynabeads（Invitrogen）的p53 DO-1或小鼠IgG控制抗体（sc2025，Santa Cruz Biotechnology，Inc.）孵育过夜。洗涤步骤后，洗脱抗体复合物并在65°C下孵育过夜，然后使用QIAquick PCR扩增试剂盒（Qiagen）纯化DNA。使用标准化为10%输入的实时PCR对目标序列进行富集。底漆提供于补充表S1.

报告人分析

一个包含STK17Ap53RE1的350-bp片段，位于人类转录起始位点上游5.0kb处STK17A型利用NT2/D1细胞基因组DNA和引物5′-TTGCTCTTATCTCTCCTTA和5′-GATGGAGTCTCTGTTGAGA通过PCR产生。将该产物克隆到pCR2.1-TOPO（Invitrogen）中，然后插入TK Luc的BamHI和XhoI位点（由达特茅斯医学院的J.DiRenzo博士提供）以产生STK TK Luc。使用QuikChange定点突变（Stratagene）构建STK-TK-Luc的一个版本，其中p53RE1从GGGCATGCTCAGGCAAGTCC突变为GGGaATaCTCAGGaAAaTCC（小写字母表示突变）。所有结构均经序列确认。细胞在1.5×10的条件下培养56孔板的细胞/孔。使用0.6μg报告基因、0.2μg雷尼利亚TK和0.5μg p53表达质粒，显性阴性p53（DN-p53）(17)或空矢量控制。转染后24小时收集细胞，进行双荧光素酶报告分析（Promega）。荧光素酶活性根据雷尼利亚活动。

RNAi淘汰

靶向人类STK17A的慢病毒沉默shRNAs（TRCN0976，STK17Ash1和TRCN0975，STK117Ash2）与pLKO.1对照品一起从Open Biosystems购买。如前所述，慢病毒载体由293T细胞产生(20). 用慢病毒株培养NT2/D1细胞24小时，用1.0μg/ml嘌呤霉素选择稳定池。设计了两个独立的siRNA，分别靶向NT2/D1细胞中人类p53的AAGACUCCAGGGGGUAAUCUAC和CGGCAUGAACCGGCCCAU序列，以及NIH3T3细胞（Dharmacon）中小鼠p53的GAAUGAGGCCUUAGAGUUAUAUU和UAACUAAGGCCUCUU序列。最终浓度为120 n米如前所述，使用寡效胺试剂（Invitrogen）转染siRNA(21). 使用的siRNA双链控制是Scramble-II序列（Dharmacon）。

细胞增殖、凋亡和活性氧测定

用Cell-Titer-Glo（Promega）评估细胞增殖和存活率。细胞在5×10的条件下培养4/6孔板，第二天用指定剂量的顺铂治疗3天。对于急性治疗，用顺铂处理细胞6小时，然后在3天后进行分析。用于细胞周期分析，7×105次日用顺铂处理细胞/10-cm培养皿6h，24h后检测。连续处理，5×105用顺铂处理细胞3天。在BD Biosciences FACScan流式细胞仪上进行分析之前，将粘附细胞和漂浮细胞固定在70%乙醇中，并用碘化丙啶染色4h。含有亚G的细胞百分比1使用CellQuest软件测定DNA。

为了检测ROS，将细胞与10μ米2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（分子探针）在添加10%血清的Opti-MEM（Invitrogen）中于37°C下放置30分钟。培养后，用PBS清洗细胞，胰酶化，并在PBS中重新悬浮；使用BD Biosciences FACScan测量荧光；并用CellQuest软件进行数据分析。人类STK17A cDNA购自Origene（SC323411）并亚克隆到pcDNA3.1中。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将表达载体转染293T细胞，24小时后检测ROS生成情况，如上所述。

微阵列分析技术

用TRI试剂分离总RNA。根据Illumina指南，使用Illumina HumanHT-12 v4表达珠芯片阵列进行杂交，该阵列覆盖了人类转录组中超过47000个转录物和已知的剪接变体。将NT2-PLK和NT2-STK17Ash2细胞进行生物复制杂交。利用GenomeStudio软件，使用分位数方法对原始数据进行标准化。比较重复标准化强度值的平均值，得出126个转录物上调1.5倍或更高（范围为1.5–3.7倍），209个转录物下调1.5倍或更多（范围为1.5-3.4倍）。基因在表1从126个上调基因中选出。可根据要求提供基因列表。

表1

STK17A敲低诱导NT2/D1细胞基因表达

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统计

当提供统计显著性值时t吨进行了假设方差不相等的检验。

结果

STK17A以p53依赖性方式诱导对顺铂的反应

即使是高度转移的睾丸癌患者，也可以通过以顺铂为基础的化疗治愈(4). 先前的研究表明，用顺铂急性治疗睾丸癌衍生的人类EC细胞系NT2/D1可介导由已知p53靶基因上调主导的转录反应(9). 一个在筛选中上调但之前未知为p53靶基因的基因是特征较差的DAP家族激酶STK17A型.

因为有人认为p53可能是睾丸癌和其他肿瘤类型化疗毒性的重要介体，并且因为DAPK家族成员以前曾与凋亡相关，所以研究是否STK17A型是EC和其他肿瘤细胞中p53的直接靶点。顺铂在NT2/D1细胞中以剂量依赖性方式诱导STK17A，但在顺铂耐药衍生物NT2/D1-R1中未诱导STK117A，此前已证明其在p53信号传导方面存在缺陷(图1一) (17). 此外，顺铂不会在NT2/D1细胞中诱导STK17A同源物STK17B(图1一). 重要的是，在人骨肉瘤U20S和人胶质母细胞瘤A172细胞中也诱导了STK17A而不是STK17B(图1,B类和1C类).STK17A型在小鼠和大鼠基因组中缺失，可能是因为它位于进化染色体重排中(14). 有趣的是，在小鼠NIH3T3和小鼠ED1细胞中，顺铂显著诱导STK17B(图1,D类和E类). 重要的是，顺铂对STK17A蛋白的诱导也发生在NT2/D1和A172细胞中(图1F类). 此外，STK17A也被DNA损伤剂长春碱、阿霉素和依托泊苷诱导(补充图S1). 这些数据表明，STK17A可在多种细胞环境中的遗传毒性应激中诱导，并表明DNA损伤介导的STK17B诱导可能弥补小鼠细胞中STK17A的缺失。

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在多种细胞系中用顺铂诱导STK17A。 一STK17A在顺铂敏感的人NT2/D1细胞中由顺铂诱导，但在顺铂耐药的NT2/D1-R1细胞中不诱导。对顺铂治疗6小时后24小时采集的RNA进行实时PCR分析。B类和C类，STK17A而非STK17B是由顺铂在人U2OS骨肉瘤和A172人胶质母细胞瘤细胞中诱导的，顺铂治疗后的细胞与一表达通过实时PCR测定。D类和E类STK17B由顺铂在小鼠NIH3T3和小鼠肺癌ED1细胞中诱导。对顺铂治疗6小时后24小时采集的RNA进行实时PCR分析。F类Western分析显示，顺铂在NT2/D1和A172细胞中诱导STK17A蛋白。代表STK17A的条带位于两个非特异性条带的正下方。所有数据点代表生物三倍体的平均值。误差线是S.D.*，第页< 0.01; **,第页< 0.05. 数据代表至少两个独立实验。

为了研究顺铂介导的STK17A和STK17B诱导的p53依赖性，我们使用了几个p53抑制的等基因系统。在用两个独立的p53 siRNA处理的NT2/D1细胞中，STK17A的顺铂诱导受到实质性抑制，其程度与已知的p53靶基因p21相似(图2一). 顺铂诱导HCT116p53+/+细胞STK17A表达；然而，p53缺失细胞系HCT116p53−/−的诱导作用显著减弱，与p21表达模式相似(图2B类). 在表达野生型p53或稳定表达shRNA至p53（MCF10A/Δp53）的MCF10A细胞中也获得了类似的结果，表明STK17A的诱导依赖于p53(补充图S2). 与STK17A的情况相反，顺铂对HCT116p53+/+和HCT116p53−/-细胞中STK17B的表达均无影响(图2B类). 此外，有效抑制p21诱导的p53 siRNA处理不影响NIH3T3细胞中小鼠STK17B的顺铂诱导(图2C类). 因此，与在NIH3T3细胞中诱导小鼠STK17B相比，顺铂诱导STK17A在多种细胞环境中依赖p53。

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顺铂以p53依赖性方式诱导STK17A。 一p53 siRNA敲除抑制了顺铂对NT2/D1细胞中STK17A的诱导。p53的表达分析(顶部面板)，STK17A(中间面板)，或第21页(底部面板)在NT2/D1细胞中模拟转染或转染对照siRNA(scbl公司)或两个以p53为靶点的独立siRNA，然后用顺铂治疗6小时，24小时后进行实时PCR分析。*，第页与相同处理的对照细胞相比，<0.01。B类，STK17A在顺铂后上调(顺铂)野生型HCT116细胞（HCT116p53+/+）的处理，但在等基因p53缺失系（HCT116p53−/−）中的程度要小得多，而STK17B不被顺铂诱导，在HCT116p53−/−细胞中也不被抑制。用顺铂处理细胞，并按一用于STK17A的实时PCR分析(顶部)，STK17B(中间的)，和p21(底部). *,第页< 0.02; **,第页与无顺铂治疗相比，<0.05。C类在NIH3T3细胞中，STK17B与顺铂以p53依赖性方式上调。p53的表达(顶部面板)，STK17B(中间面板)，或第21页(底部面板)在NIH3T3细胞中模拟转染或转染对照siRNA(scbl公司)或以小鼠p53为靶点的两个独立siRNA，然后用顺铂治疗6小时，24小时后进行实时PCR分析。*，第页与相同处理的模拟控件相比，<0.02。所有数据点代表生物三倍体的平均值。误差线是S.D.数据代表了至少两个独立的实验。

STK17A是p53的直接转录靶点

p53MH算法用于搜索人类体内的p53结合位点STK17A型基因(22). 总共查询了62 kb的序列，包括所有STK17A型5′-和3′-非翻译序列的外显子和内含子以及12和5kb。在转录起始位点上游5.0 kb处发现100%一致匹配的p53反应元件（STK17A-p53RE1）STK17A型(图3一和​和44B类). 重要的是，该位点在两个p53结合半位点之间没有间隙，这是通过全基因组p53 ChIP测序分析发现的绝大多数p53位点的情况(23). 此外，还发现了四个较弱的内含子共有位点(图3一和补充表S2). 有趣的是，STK17A-p53RE1位于根据H3K4Me1组蛋白标记的存在预测为增强子的区域内(图3一). 此外，STK17A-p53RE1位于Wei确定的地点内等。(23)使用p53 ChIP然后测序(图3一). 虽然ChIP-PET在STK17A-p53RE2中为～2 kb，但我们在该研究中唯一的其他预测的p53 ChIP-PET中找不到p53一致性结合序列(图3一).

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p53结合体内STK17A中内源性p53RE。 一，人类的基因组组织STK17A型基因。描述了预测的p53反应元件（RE1–RE5）相对于转录起始位点的位置(箭头)，外显子(实心盒子)、和内含子(实线)第页，共页STK17A型H3K4Me1和H3K4Me3修饰的位置富集，p53 ChIP PET（PET区域用H（H）)2006年3月，从UCSC基因组浏览器组件（NCBI36/hg18）下载了CpG岛。B类用2.0μ米顺铂6h，10h后收获。一种p53抗体，但不是IgG，以顺铂依赖的方式富集DNA片段，包含STK17A-p53RE1和特征良好的p21 p53结合位点，但不包含GAPDH公司启动子或区域STK17A型转录起始位点上游30kb基因。对每次沉淀进行实时PCR扩增，每个位点周围的引物对来自输入DNA的信号进行标准化。C类，一个独立的ChIP实验，条件与B类将引物设置为STK17A-p53RE1到STK17A-p53RE5，表明p53只与STK17A-p53REl有效结合，这与p53与先前表征的p53RE在PLK2号机组基因。请注意，由于STK17A-p53RE4和STK17A-p53RE5非常接近，因此使用了相同的引物集来检测它们。另外两个ChIP实验以生物复制的形式进行，证明p53与STK17A-p53RE1结合的富集程度超过20倍。

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STK17A包含一个功能性p53响应元素。 一、用TK-Luc对照报告人或STK17A型报告者（STK-TK-Luc；包含围绕STK17A-p53RE1的350-bp片段的TK-Lub）和控制载体或DN-p53。B类，转染STK-TK-Luc或STK-TK-Luc-Mut（STK-TK-Luc，其中每个半位点的核心C和G发生突变）和对照载体或DN-p53的NT2/D1细胞的报告活性。C类，将含有突变p53的U251细胞系转染TK-Luc对照报告子或STK-TK-Luc/STK-TK-Luc-Mut报告子以及对照载体或p53表达载体。所有数据点均为生物三重转染的平均值。误差线是S.D.*，第页< 0.02. 数据代表至少两个独立实验。

利用p53抗体进行的ChIP分析表明，与非53靶基因GAPDH相比，内源性p53结合STK17A-p53RE1的量增加了3倍。在顺铂存在的情况下，这种结合富集倍数增加到45倍(图3B类). 未使用对照IgG抗体获得STK17A-p53RE1片段的富集，并且在该基因上游30 kb的区域未检测到p53结合STK17A型基因(图3B类). 已知的p53靶基因p21被用作阳性对照，与STK17A-p53RE1相比，显示出更多的p53结合。然而，由于p53与p21增强子紧密结合，许多其他p53靶基因也存在ChIP信号的差异(23). 在STK17A-p53RE的直接比较中，p53仅与STK17A-p53RE1结合，这种结合在程度上与p53与直接p53靶基因先前特征化的p53RE结合相似PLK2号机组(图3C类) (23). 两个基因沙漠地区被用作额外的阴性对照。

我们在驱动荧光素酶表达的基础胸腺嘧啶激酶启动子前克隆了一个包含STK17A-p53RE1的350-bp区域。用对照报告基因（TK Luc）或STK17A报告基因构建体（STK TK Luc）转染HCT116p53+/+和HCT116p53−/-细胞。只有在HCT116p53+/+细胞中，STK-TK-Luc的活性才明显高于对照报告者，并且随着DN-p53的添加，该活性受到了显著抑制(图4一). STK17A-TK-Luc在p53野生型NT2/D1细胞中也有活性，而DN-p53再次抑制了该活性。突变STK17A-RE1的p53结合基序中的四个碱基可消除这种活性(图4B类). 此外，在携带突变型p53的人胶质母细胞瘤细胞中，STK17A-Luc表现出与TK Luc对照和STK17A-Luc-Mut报告基因类似的活性，并且野生型p53的转染仅在用完整的STK17-p53RE1报告基因转染的细胞中增加活性。报告数据和上述ChIP结果确定STK17A-p53RE1是一种功能性p53反应元件STK17A型STK17A是一个新的、直接的p53靶基因。

STK17A敲除导致NT2/D1细胞对顺铂敏感性降低，并伴有凋亡减少

EC细胞对与睾丸癌可治愈性相关的DNA损伤剂过敏(24). 为了评估STK17A在EC细胞对顺铂反应中的重要性，我们生成了具有稳定shRNA敲除STK17A的NT2/D1细胞。STK17Ash2有效地抑制了基础和顺铂诱导的STK17A表达，而STK17Ash1则起到了中间作用，在蛋白表达水平上更为明显(图5,一和B类). STK17A敲低导致NT2/D1细胞对顺铂的敏感性降低，如STK17Ash2细胞与对照细胞相比增殖和存活增加所示，STK17Ash1细胞表现出中间表型(图5C类). STK17Ash2细胞中的细胞数量在连续（3天）两种情况下都有所增加(图5C类)和急性（6小时）顺铂治疗（数据未显示），并利用三种分别衍生的STK17Ash慢病毒细胞进行了重复证明。

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STK17A敲除导致NT2/D1细胞对顺铂的敏感性降低。 一实时PCR分析STK17A在对照NT2/D1细胞和用两种独立的STK17A-shRNA慢病毒转导的细胞中的表达。NT2公司表示模拟转导的细胞，以及PLK公司表示用空pLKO.1载体转导的细胞。*，第页与相同处理的NT2/D1对照细胞相比，<0.01。B类Western分析用pLKO.1和STK17A shRNA慢病毒稳定转导的NT2/D1细胞中STK17A的表达。STK17A的带直接位于两个非特异性带的下方。C类模拟转导的NT2/D1细胞或转染对照或STK17A shRNA慢病毒的细胞经顺铂治疗3天后的剂量反应。细胞增殖和存活率通过Cell-Titer-Glo分析测定，第页< 0.05; **,第页与相同处理的NT2/D1对照细胞相比，<0.01。数据点是生物三倍体的平均值。误差线是S.D.数据是三个独立实验的代表。

很明显，顺铂增加STK17Ash2细胞中的细胞数量在很大程度上是由于培养基中漂浮细胞减少导致细胞死亡。与对照组相比，顺铂治疗后STK17Ash2细胞的凋亡显著减少，这是通过亚G细胞水平评估的1DNA含量(图6,一和B类). 在连续（3天）和急性（6小时）顺铂治疗下，STK17Ash2细胞的凋亡减少(图6,一和B类). 此外，G2顺铂治疗后STK17Ash2细胞和对照细胞的阻滞情况相似，这表明STK17A的敲除不会显著改变NT2/D1细胞中DNA损伤激活的细胞周期检查点(图6B类).

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STK17A敲除导致顺铂介导的凋亡细胞死亡减少。 一，NT2/D1对照、NT2-PLK和NT2-STK17A-sh2细胞的细胞周期分析表明凋亡的亚G1顺铂作用下的细胞(Cispl公司)STK17A敲除细胞的处理与对照细胞相比，但细胞周期相分布相似。B类，中的数据图一以及额外的顺铂剂量。Tx（发送）、治疗；Cont（续），控制。

STK17A调节ROS

除了STK17A在NIH3T3细胞中过度表达时与集落形成减少有关外，对其生物学功能知之甚少(13). 为了进一步了解STK17A敲除细胞中的顺铂耐药性，比较了NT2/D1-PLK对照细胞和NT2/D1-STK17Ash2细胞中全基因组基因的表达。取生物重复样品的平均值，与对照细胞相比，NT2/D1-STK17Ash2细胞中126个转录物的表达增加，209个转录物的表达降低。STK17A敲除上调的126个转录物中的许多在癌症治疗的保护性解毒和抗氧化反应中具有已知作用(表1)包括金属硫蛋白基因家族的三个成员。金属硫蛋白表达增加是顺铂耐药的一种常见机制，有三种金属硫蛋白在STK17A敲除细胞中过度表达(图7一) (25). 这与STK17A敲除后无变化的促凋亡和抗凋亡介体BCL2家族成员水平形成对比(补充图S3).

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STK17A调节ROS。 一，NT2-STK17Ash2细胞表达较高水平的金属硫蛋白基因MT1M公司,MT1H公司、和MT1X公司与实时PCR测定的NT2-PLK对照细胞进行比较。数据点是生物三倍体的平均值。误差线是S.D.*，第页< 0.02.B类，NT2/D1细胞稳定表达STK17A shRNAs(第1页和第2页)与对照细胞相比，基础和顺铂诱导的活性氧水平较低(PLK公司)用2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯法测定。细胞孵育有或没有1μ米如“实验程序”所述，在测定活性氧之前，顺铂放置18小时。显示了NT2-STK17A-sh1、NT2-STK17A-sh2和NT2-PLK细胞中代表性基础活性氧测定的追踪结果。酒吧是两个生物复制的平均值，以及误差线是两个值的范围。实验重复进行，结果相似。C类STK17A过表达的293T细胞基础活性氧水平较高。用空载体或STK17A表达质粒模拟转染或转染细胞，24小时后测定ROS水平。代表性跟踪位于左边。酒吧表示生物三重转染的平均值，以及误差线是S.D.*，第页与模拟或矢量控制相比<0.005。这个插入是STK17A过表达的蛋白质印迹。实验重复进行，结果相似。米，模拟；V（V），向量。

此外，与STK17A敲除相关的抗氧化基因表达谱与基础和顺铂诱导的细胞内ROS水平降低相关(图7B类)而STK17A在293T细胞中的短暂过表达导致ROS水平升高(图7C类). STK17A调制的ROS水平变化程度与其他系统中ROS水平的类似变化相当(26–29). 这些数据表明，STK17A可能通过抑制解毒和抗氧化相关基因的表达，在增强活性氧方面发挥作用。总之，本研究确定STK17A型作为一种新的p53靶基因，为其参与顺铂介导的EC细胞凋亡反应提供了分子生物学证据。

讨论

TGCT是少数晚期通过常规化疗治愈的实体瘤之一(4). 虽然有一种机制与TGCT中野生型p53的高水平相关，但其潜在机制尚不清楚(5–8). 这里我们已经确定STK17A型STK17A是TGCT-derived EC细胞中一个新的p53靶基因，表明STK17A是EC细胞中细胞毒性顺铂反应的调节剂。证据表明STK17A型是一个直接的p53靶基因，包括在多种等基因细胞模型中，STK17A对顺铂的反应具有p53依赖性上调，以及内源性p53与上游p53RE结合的证据STK17A型基因。此外，STK17A-p53RE1与异源报告基因融合时能够驱动p53依赖性转录。

我们之前通过微阵列分析表明，EC细胞对顺铂的转录反应主要由p53靶基因控制(9). 在最初的筛选中，使用严格的截止值来汇编EC细胞中顺铂上调的46个基因的列表。在这些基因中，有20个是已知的p53直接靶基因，通过基因特异性和全局p53 siRNA分析提供的证据表明，其余许多基因可能是新的p53靶基因(9). 值得注意的是，自从这篇文章发表以来，最初46个基因中的另外9个基因，DRAM1（DRAM1）(FLJ11259型),87加仑/加仑,PHLDA3公司,GLS2级,TIGAR公司(第12页，共5页),RPS27升,PAI1号机组,CAV1型，现在STK17A型已被证实为新的直接p53靶基因(21,28–37). 这些发现表明，EC细胞中p53的过度活性可能反映了其生殖细胞起源。很容易推测，EC中p53的过度活性以及TGCT的可治愈性可能是保护生殖系免受有害突变的保护机制的副产品。

我们的数据表明，STK17A在介导顺铂诱导的NT2/D1细胞凋亡中发挥作用。STK17A敲低使NT2/D1细胞对顺铂的敏感性可重复但适度降低（约2倍）。之前的几项研究表明，TGCT系与其他癌症类型相比，具有相当适度的2-4倍的顺铂敏感性，这被认为是在肿瘤负担较大的临床环境中治愈与失败之间的差异的原因，这表明即使是敏感性的微小变化也可能具有临床相关性（有关综述，请参阅参考文献。38). 此外，STK17A敲除NT2/D1细胞中的耐药水平与我们之前报道的NT2/D2细胞中p53自身被敲除时的耐药水平相似（～3倍的耐药）(9). 对DNA损伤剂的反应和抗癌药物耐药性的机制是复杂和多因素的。STK17A可能是TGCT细胞顺铂反应的几种介质之一。我们无法生成稳定的STK17A-过表达NT2/D1细胞，这可能与之前关于STK17A在NIH3T3细胞中过表达时毒性的报道有关(13). 然而，值得注意的是，顺铂耐药NT2/D1株NT2/D1-R1未能上调STK17A对顺铂的反应(图1一). 此外，STK17A的下调与结肠癌细胞对奥沙利铂的耐药性和黑色素瘤细胞对依托泊苷的耐药性密切相关(39,40).

关于STK17A功能的可用信息很少。STK17A仅与原型DAP激酶DAPK1有远缘关系(41–45). DAPK1是一种细胞溶质肌动蛋白丝相关的钙/钙调素依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，可促进细胞凋亡以应对各种刺激，包括FAS、γ干扰素和TNF-α(10). DAPK1可以通过激活p53抑制转化，在多种癌症中DAPK1的表达受到启动子甲基化的抑制(41–45). 有趣的是，之前的一项研究表明STK17A型,DAPK1型是一个p53靶基因(46). DAP家族在其催化域中具有同源性(10). 然而，它们的体外催化域和生物特性有显著差异(10). 例如，STK17A缺乏DAPK1的死亡和钙/钙调蛋白调节域，而DAPK1位于细胞核中(13). 此外，DAP激酶家族的关键直接上游和下游效应器在很大程度上尚不清楚。虽然我们的数据强烈表明，抑制ROS生成与STK17A敲除细胞对顺铂敏感性降低有关，但这是如何发生的，以及其他机制是否发挥作用，还需要进一步研究。STK17A不调节BCL2家族表达（参见补充图S3). 此外，STK17A似乎不像DAPK1那样在p53通路的反馈调节中起作用(42)因为STK17A的敲除和过度表达并没有明显改变p53诱导、p53靶基因激活或基于p53的报告活性（数据未显示）。

有趣的是，STK17A型不存在于小鼠或大鼠基因组中(14). 然而，密切相关的基因STK17B型在小鼠细胞系中用顺铂诱导，但在含有两者的几个人类细胞系中没有诱导STK17A型和STK17B型这些数据表明STK17A或STK17B对DNA损伤的诱导具有重要意义，并表明STK117A和STK17B在DNA损伤反应下游可能具有重叠的物种和/或上下文特定的作用。顺铂诱导小鼠细胞STK17B的机制以及p53在这一诱导中的潜在作用需要进一步研究。在小鼠中，STK17B富含淋巴细胞，在维持T细胞存活的同时提高了T细胞活化的阈值，但在这种情况下似乎对细胞凋亡没有直接作用(15,16). 然而，其他研究表明STK17B在凋亡中起作用，包括紫外线辐射诱导的大鼠肾脏和大鼠结肠癌细胞凋亡(47,48). 总之，这些结果和目前的研究结果表明，STK17B在癌症治疗过程中可能在细胞凋亡和细胞存活中发挥作用，值得进一步研究。

我们的数据表明，核激酶STK17A的敲除诱导NT2/D1细胞中几个抗氧化和解毒基因的表达，包括一些金属硫蛋白。这种反应很容易解释STK17A敲低细胞对顺铂敏感性降低的原因，因为ROS的产生被认为是顺铂抗肿瘤作用的主要机制，而金属硫蛋白的上调是顺铂耐药性的一种常见机制(25,49). 由于特定下游靶点的激活，p53已被证明具有促氧化和抗氧化活性，包括TIGAR公司,GLS2级,彪马,FDXR公司、和PIG3接口(28–30,50,51). 激活哪个程序的决定可能与细胞环境和基因毒性应激的程度有关(2). 有趣的是，此前已有研究表明，p53通过抑制NRF2抑制典型抗氧化基因的表达，NRF2是与抗氧化反应元件结合以激活抗氧化基因的主要转录调节因子(52). 相反，在之前的研究中，DAPK家族并未参与ROS调节。我们的数据表明，STK17A的敲低或过表达分别导致ROS水平降低和增加，因此首次将DAPK家族的一个成员与ROS调节联系起来。未来将有兴趣确定抗氧化基因和ROS的调节是STK17A敲除的直接还是间接后果，以及这些作用是否由其他DAPK家族成员共享。

总之，我们首次表明STK17A型是一种DNA损伤诱导的直接p53靶基因，在调节细胞存活、凋亡和ROS积累方面发挥作用。数据表明，STK17A的放松调节可能对癌症治疗的疗效具有临床意义。与p53类似，研究STK17A在癌症治疗过程中是否对细胞生存和凋亡具有细胞上下文依赖性影响将很有意义。

补充材料

补充数据：

鸣谢

我们感谢Alan Eastman博士、Ethan Dmitrovsky博士、Mark Israel博士（达特茅斯医学院）和Bert Vogelstein博士（约翰霍普金斯大学）提供的细胞系，以及James Direnzo博士（达特茅斯医学校）提供的TK-luciferase报告构建。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R21-CA124817的全部或部分支持。这项工作还得到了美国国防部研究员启动研究奖PR093629和诺里斯棉花癌症中心Prouty发展奖的支持。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充表S1和S2以及图S1-S3.

三使用的缩写如下：

TGCT公司
睾丸生殖细胞肿瘤
目的地交货
死亡相关蛋白
欧盟委员会
胚胎癌
重新
响应元件
玫瑰红
活性氧物种
STK公司
丝氨酸/苏氨酸激酶
DAPK（DAPK）
死亡相关蛋白激酶
吕克
荧光素酶
TK公司
胸苷激酶
直径
主导负向
宠物
成对的结束标记。

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来自的文章生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会