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公共科学图书馆一号。2011; 6（5）：e20038。
2011年5月23日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0020038
预防性维修识别码：PMC3100319型
PMID：21625387

miR-103和miR-107在调节CDK5R1型表达与细胞迁移

西尔维娅·蒙奇尼,1 亚历山德罗·萨尔维,2 保拉·祖科蒂,1 加布里埃拉·维埃罗,三,4 亚历山德罗·夸特龙,三 塞尔吉奥·巴拉蒂,2 朱塞皮娜·德·佩特罗,2 马可·文丘林,1和保拉·里瓦1,*
迈克尔·波利尼斯，编辑器
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摘要

CDK5R1型编码p35，一种丝氨酸/苏氨酸激酶CDK5的特异性激活物，在中枢神经系统的发育和维持中起关键作用。CDK5活性强烈依赖于p35水平，而p35/CDK5失调对正确的中枢神经系统功能有害，这表明对神经系统的调节受到严格控制CDK5R1型CDK5活性正常需要表达。因此，CDK5R1型表达被证明在转录和转录后水平上都受到控制，但通过microRNAs（miRNAs）的可能调控从未被研究过。我们预测CDK5R1型3′UTR多个miRNA靶位点。其中，我们选择了miR-103和miR-107进行功能研究，它们的表达在不同细胞系中与p35水平呈强负相关。显著减少了CDK5R1型用miR-103或miR-107前体（pre-miR-103或pre-miR107）转染SK-N-BE神经母细胞瘤细胞后，观察mRNA和p35水平。相反，转染相应的拮抗剂（抗miR-103或抗miR-107）后，p35水平显著升高。此外CDK5R1型用前miR-107转染后，转录物从多胞体转移到亚多胞体mRNA部分，反之，用抗miR-107基因转染后从亚多胞体内转移到多胞体中，这表明转录物对翻译效率有直接作用。我们通过荧光素酶分析证明，miR-103和miR-107能够直接与CDK5R1型3′-UTR，对应于特定目标站点。最后，miR-103和miR-107过度表达，以及CDK5R1型沉默导致SK-N-BE迁移能力降低，表明这些miRNAs通过调节CDK5R1型表达式。这些发现表明miR-103和miR-107调节CDK5R1型表达，使我们可以假设miRNA-介导的机制可能影响CDK5活性和相关的分子途径。

介绍

人类CDK5R1型(细胞周期蛋白依赖性激酶5,调节亚单位1，GeneID:8851）编码p35，p35是细胞周期素依赖性激酶5的特异激活物(川东北5，GeneID:1774），是一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶。单体CDK5没有酶活性，需要与p35或p39结合才能激活[1]虽然Cdk5在哺乳动物组织中普遍表达，但其激活蛋白主要在有丝分裂后神经元中表达：因此，其活性主要与中枢神经系统（CNS）的发育和功能有关[2],[3].

最具特征的Cdk5的功能主要涉及中枢神经系统的发育和维持，并由其几种底物的磷酸化介导[2],[3].

p35与Cdk5的结合是神经元生存所必需的，并参与神经元分化和功能（如神经突起生长）的许多基本过程[4]，轴突再生[5]，神经元凋亡[6]突触可塑性、学习和记忆[7]神经元突起生长过程中的膜运输[8]，还通过控制细胞骨架动力学在分泌和多巴胺信号传导中发挥作用[9].

此外，Cdk5和p35对哺乳动物大脑皮层形态发生过程中皮层神经元的径向迁移和分层至关重要。镉钾5敲除小鼠表现出严重的皮层分层缺陷和围产期死亡[10]同样，硫化镉5r1KO小鼠表现出严重的皮层分层缺陷，并遭受成年死亡和癫痫发作[11]Cdk5过度激活，与p35的过度表达和p25的产生有关，p25是一种含有p35 C末端部分的蛋白水解片段[12]与一些神经退行性疾病有关，如阿尔茨海默病（OMIM:104300）[13]、帕金森氏病（OMIM:168600）[14]和肌萎缩侧索硬化症（OMIM:105400）[15]。最近，CDK5R1型已被认为是NF1微缺失综合征中精神发育迟滞的候选者（OMIM:162200）[16].

The deleterious effects of川东北5和CDK5R1型生理和病理过程中的失调强烈表明CDK5R1型CDK5的正确激活需要表达。研究表明，p35细胞水平是CDK5激酶活性的主要限制因素[17]但对p35的表达调控知之甚少。关于监管的一些数据CDK5R1型转录本已被报道。TNF-α通过激活ERK1/2通路调节硫化镉5r1PC12细胞中的启动子活性可诱导硫化镉5r1从而增加Cdk5激酶活性[18]此外，发现IL-6影响海马神经元的p35蛋白水平，IFN-γ增加神经母细胞瘤Paju细胞的p35蛋白质水平[19],[20]一些证据表明p35在翻译后水平上受到调节：p35通过泛素化和蛋白酶体降解进行快速转换[21]最近有报道称，PKCδ磷酸化p35，防止其在培养的皮层神经元中降解，并通过稳定p35来调节第II/III层皮层神经元的径向迁移[22].

我们最近证明了CDK5R1型可通过其3′-UTR在转录后水平进一步调节[23].3′-UTR在转录后调控机制中起着关键作用，允许对编码生长相关蛋白的几个神经元基因的表达进行精细的时空调控[24]，细胞骨架元件[25]神经递质生物合成酶和受体[26]以及与神经退行性疾病相关的蛋白质，如淀粉样前体蛋白[27]事实上，转录后调节的紊乱可能导致神经元功能障碍，或者在极端情况下，导致神经元变性[28].

这个CDK5R1型该基因显示了一个非常大且高度进化保守的3′-UTR（2725 bp），其中特定的转录后调控元件/效应器，如AU富集区和神经元RNA-结合蛋白ELAV（nELAV），被证明影响转录稳定性[23]然而，其他反式-作用因子预计在3′-UTR介导的CDK5R1型表达，包括一类重要的转录后调节因子，即microRNAs（miRNAs）。miRNAs是短的，平均只有22个核苷酸长的非编码RNA，其作用通常导致mRNA降解或翻译抑制，这取决于其目标转录物3′-UTR的序列互补程度。动物miRNAs与其靶mRNAs通常具有不完全互补性[29]这导致了翻译抑制。靶点预测算法估计，数千种人类基因产物受到miRNA的调节[30]当前的功能研究表明，miRNAs是发育过程的关键调节器，如干细胞的自我更新、肌发生、胚胎发生和细胞分化[31]–[33]许多miRNAs在中枢神经系统中表达，通常在发育、分化和神经元存活过程中以时间和/或空间调节的方式表达，还可能参与神经元可塑性和学习，据报道在神经退行性变中起作用[34],[35].

鉴于维持正确的p35细胞水平的功能必要性，miRNAs也有望参与p35表达的微调。在本研究中，我们报道了两种miRNA，miR-103和miR-107的鉴定，它们调节CDK5R1型/p35表达和减少神经母细胞瘤细胞SK-N-BE的迁移。在几个预测的miRNA结合位点中，我们通过基于荧光素酶分析的功能研究验证了一个miR-107和一个miR103结合位点的活性。

结果

miRNA靶点预测CDK5R1型3′-UTR

为了鉴定潜在调节的miRNACDK5R1型表达，我们首先搜索预测靶向CDK5R1型3′-UTR，使用算法PicTar。我们发现人类的3′-UTRCDK5R1型窝藏20种不同miRNAs的假定靶点(表1). 每个miRNA的预测结合位点数量从1到13不等。此外，每个靶位点可以被1至8个不同的miRNA结合。因为当同一miRNA的多个分子结合其靶点时，miRNA的调节作用通常会增加[36]，我们决定选择6个miRNAs（miR-195、miR-16、miR-15a、miR-15-b、miR-107和miR-103）进行后续研究，这6个miRNA预计与最多数量的靶位点结合（≥10）。

表1

PicTar miRNA靶点预测CDK5R1型3′-UTR。
微小核糖核酸#个网站（共个）自由能（kcal/mol）
has-miR-15b13 (2) (5)−19.2 −22.5 −17.6 −18.6 −16.8 −18.2 −19.7 −18.1 −16.3 −17.1 −22.5 −16.1 −16.0
hsa-miR-19512 (2) (4)−16.9 −17.5 −18.6 −18.7 −17.3 −18.6 −20.6 −17.6 −21.1 −16.4 −17.4 −19.0
has-miR-10711 (7) (3)−25.3 −21.2 −22.2 −19.9 −19.4 −19.4 −24.9 −24.3 −23.5 −24.5 −16.8
has-miR-15a型11 (6) (3)−20.9 −21.0 −20.3 −16.8 −19.4 −23.1 −20.1 −18.6 −19.0 −24.7 −17.9
has-miR-103型10 (7) (2)−25.3 −21.2 −22.2 −19.4 −18.2 −23.5 −23.9 −24.5 −24.2 −16.8
has-miR-16型10 (2) (5)−19.3 −19.1 −18.4 −15.1 −19.5 −23.2 −18.9 −22.8 −17.3 −16.3
has-miR-130b型6 (4) (0)−16.1 −21.5 −24.8 −15.9 −21.9 −24.6
has-miR-130a型6 (2) (1)−16.1 −22.1 −16.4 −15.4 −19.1 −22.4
has-miR-33型6 (1) (1)−16.9 −18.3 −20.0 −11.3 −17.3 −17.3
has-miR-183型4 (4) (0)−20.3 −23.2 −20.1 −20.5
has-miR-27b4 (3) (1)−20.7 −22.6 −18.2 −22.8
has-miR-23a型4 (2) (1)−24.4 −18.7 −24.5 −13.8
has-miR-23b4 (2) (1)−22.4 −18.2 −23.1 −13.8
has-miR-254 (1) (0)−17.2 −22.5 −15.4 −17.9
has-miR-301型3 (2) (0)−21.1 −15.8 −22.0
has-miR-27a型3 (2) (0)−20.7 −17.6 −20.0
has-miR-152型3 (2) (0)−25.0 −15.6 −20.7
has-miR-148a型2 (2) (0)−20.0 −21.4
has-miR-148b型2 (2) (0)−20.7 −23.6
has-miR-101型1 (0) (1)−19.4
在第二列中，数字是：给定miRNA的结合位点数量CDK5R1型3′-UTR，自由能小于-20.0 kcal/mol的结合位点数量，自由能介于-20.0和-18.0 kcal/mol.之间的结合位点的数量。

人类细胞系中miR-103和miR-107的表达与p35水平的负相关

在五种神经元和非神经元人类细胞系（SK-N-BE、SH-SY5Y、HEK-293、DU-145、MCF-7）中对miRNA前体（pre-miRs）进行的初步RT-PCR实验表明，除了一种miRNAs外，所有受试细胞系中的所有miRNA都有表达（数据未显示）。然后，我们试图确定五种表达的miRNAs中哪一种可能是对CDK5R1型通过qRT-PCR评估成熟miRNA在上述人类细胞系中的表达水平(图1A)，并将其与p35的水平进行比较，p35由CDK5R1型Western blot定量(图1B). miR-34a被作为阴性对照纳入本分析，因为它预计不会靶向CDK5R1型mRNA。与非神经元细胞系（HEK-293、DU-145和MCF-7）相比，神经元细胞系（SK-N-BE和SH-SY5Y）显示出显著更低的p35含量(图1B). 每个miRNA在所研究的细胞系中显示一个特定的表达谱(图1A). 由于转录后miRNA-介导的调控通常会导致基因沉默，我们预计五种细胞系中的miRNA和p35水平之间只有那些对miRNAs具有调控作用的miRNA才存在负相关CDK5R1型表达式。然后，我们根据皮尔逊相关系数进行了相关分析，结果表明所有五种miRNAs均呈负相关，相关系数在-0.40到-0.80之间(图1C). 相反，miR-34a没有表现出负相关系数（r=0.66），正如预期的那样，对于没有预测靶位点的miRNACDK5R1型3′-UTR。在三个负相关系数最大的miRNAs中（miR-103:r=-0.80；miR-107：r=−0.75；miR-16:r=−0.71），我们决定将注意力集中在miR-103和miR-107作为CDK5R1型利用其预测结合位点的最低自由能值表示(表1). 值得注意的是，miR-103和miR-107具有相同的序列，但只有一个核苷酸位于所谓的“种子序列”之外，因此，除了一个外，它们共享所有预测的靶位点。

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细胞系中p35和miRNAs表达的相关性。

一)实时PCR检测SK-N-BE、SH-SY5Y、HEK-293、DU-145和MCF-7细胞株总RNA成熟miR-195、miR-16、miR-15a、miR-107、miR-103和miR-34a的表达。表达水平根据内源性控制RNU6B的表达进行标准化。RNU6B水平在所有测试样本中具有可比性。B类)Western blot检测来自相同细胞系的蛋白提取物中的p35。β-肌动蛋白的表达正常化。面板顶部显示了一个具有代表性的实验。C类)五种细胞系中每个miRNA与p35蛋白水平的相关分析，r=皮尔逊相关系数。

miR-103和miR-107调制CDK5R1型SK-N-BE细胞中的表达

评估miR-103和miR-107对内源性CDK5R1型表达后，我们用SK-N-BE细胞的前体（前miR-103和前miR-107）或其抑制剂（抗-miR-103和抗-miR107）瞬时转染SK-N-BE细胞。对成熟miRNA的qRT-PCR证实，与未转染的对照相比，相应miRNA前体的转染导致miR-103和miR-107过表达。反之亦然，miRNA抑制剂的转染几乎消除了miR-103和miR-107的表达（数据未显示）。

与GAPDH水平正常化后的未转染对照组相比，miR-107转染前48小时后，p35水平显著降低，50nM时降低42%，100nM时减少51%。同样，miR-103前体的转染导致p35水平降低35%（50 nM）和40%（100 nM）(图2A). 否则，如果转染抗miR-107（50-100 nM），与未转染的对照相比，p35水平分别增加57%和50%。此外，抗miR-103转染后p35水平增加了76%（50 nM）和83%（100 nM）(图2B).

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p35蛋白和CDK5R1型转染和未转染前miR-103/107和抗miR-103/107 SK-N-BE细胞的mRNA表达。

一)转染后48小时，对对照SK-N-BE细胞（第1和第2通道）、50 nM和100 nM前miR-103和前miR-107转染细胞的条件培养基中的p35进行Western blot分析。面板顶部显示了一个具有代表性的实验。(*第页<0.05, **第页<0.01).B类)转染48小时后，对对照SK-N-BE细胞（第1和第2通道）、50 nM和100 nM抗miR-103和抗miR-107转染细胞的条件培养基中的p35进行Western blot分析。面板顶部显示了一个具有代表性的实验。(*第页<0.05).C类)CDK5R1型用100 nM前miR-107、前miR-103、抗miR-107和抗miR-103转染48小时后，通过qRT-PCR测量信使核糖核酸表达水平GAPDH公司成绩单。的级别GAPDH公司在所有测试样本中的表达是可比较的。(*第页<0.05, **第页<0.01).

用100 nM前miR-103、前miR-107、抗miR-103和抗miR-107转染后48小时，从SK-N-BE细胞中提取总mRNA。qRT-PCR显示CDK5R1型用miRNA前体转染后的转录水平和CDK5R1型抗miRNAs处理后的mRNA(图2C). 综上所述，这些结果表明miR-103和miR-107可以影响CDK5R1型SK-N-BE细胞中的表达。

miR-107直接调节CDK5R1型翻译

验证miR-107是否通过影响翻译效率直接调节p35水平CDK5R1型mRNA，SK-N-BE细胞系转染前miR-107或抗miR-107，然后在48小时后，通过蔗糖梯度离心分离多体和亚多体部分的mRNA–核糖体复合物，其中分别含有有效翻译的转录物和未翻译的mRNA。提取RNA后，进行qRT-PCR以量化CDK5R1型mRNA，使我们能够根据ΔCt值确定多染色体和亚多染色体亚区中该转录物的数量。的相对分布CDK5R1型对于每个治疗组和对照组，两个部分中的mRNA表示为根据从两个部分提取的转录物总和计算的百分比(图3). 尽管结果没有达到统计显著性，但显示出一种趋势，即CDK5R1型与对照组相比，经前miR-107转染后，从多胞体到亚多胞体室的mRNA(图3)，表明miR-107直接起到负翻译调节器的作用。另一方面，与对照组相比，抗miR-107转染表明mRNA从亚多胞体转移到多胞体部分(图3)，表示翻译增加。这些结果证实了miR-107在翻译水平上直接调控CDK5R1的表达。

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miR-107对CDK5R1型多体和亚溶体裂解物中的mRNA。

的qRT-PCRCDK5R1型多体和亚多体组分中的mRNA。将100 nM pre-miR-107或anti-miR-107转染SK-N-BE细胞48 h，然后通过蔗糖梯度离心分离mRNA-核糖体复合物。表达式在内务管理上进行规范化铝成绩单。从两个分数中获得的成绩单百分比根据2的总和计算-ΔCt多胞体和亚多胞体的mRNA，用于miR-107前体、miR-107抗体治疗和对照（脂质体）。

miR-103和miR-107与CDK5R1型3′-UTR

验证miR-103和miR-107通过直接与CDK5R1型3′-UTR，我们将pGL4.71P-UTR构建物共转染到SK-N-BE细胞中，该构建物包含全人类CDK5R1型3′-UTR下游雷尼利亚萤光素酶编码序列[23]，含有100 nM的前miR-103或前miR-107。该构建物与前miR-103或前miR-107在SK-N-BE中的联合转染导致荧光素酶活性降低(图4)与仅转染pGL4.71P-UTR的相同细胞中测得的荧光素酶活性相比，表明这两种miRNAs对CDK5R1型通过与其3′-UTR相互作用的转录本。

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miR-103/107和CDK5R1型3′-UTR。

2688 bp的序列CDK5R1型在Renilla荧光素酶基因上游克隆3′-UTR，生成pGL4.71P-UTR结构。用萤火虫荧光素酶报告载体将其共转染到SK-N-BE细胞中，以实现荧光素素酶标准化。细胞单独用转染剂（脂质内酰胺）或用100 nM pre-miR-103或pre-miR107处理。转染前miRNAs 48小时后评估荧光素酶活性(*第页<0.01).

然后，我们试图确定在不同的miR-103和miR-107预测靶点中，哪一个在调节CDK5R1型表达式。3′-UTR的生物信息学分析预测miR-103和miR-107分别存在10个和11个靶点（S1-S11）。事实上，PicTar将S5位点识别为miR-107的目标位点，而不是miR-103的目标位点。此外，由于S2和S3位点以及S5和S6位点大多重叠，因此我们将其视为单个位点，分别称为S2/3和S5/6位点。我们将3′-UTR分为7个区域（命名为R1到R7），每个区域包含一个或两个结合位点(图5A). 在克隆pGL4.71P质粒中的每个片段并生成每个位点的种子区域被删除的相应结构后，我们将野生型和删除的结构转染到SK-N-BE细胞中，以研究每个预测结合位点上内源性miR-103和miR-107的活性(图5B). 荧光素酶分析表明，相对于对照pGL4.71P质粒，所有野生型构建物的报告基因活性均降低，该质粒已设置为100。比较每个野生型片段和删除种子区域的相应结构，发现S1和S8缺失后荧光素酶活性显著增加，但其余结合位点没有增加，这表明它们对报告基因的下调有贡献(图5B). S1和S8也从pGL4.71P-UTR中删除，以研究它们对整个3′-UTR的影响(图5C). 只有S1的缺失导致荧光素酶活性显著增加。

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miR-103/107靶位点的功能分析CDK5R1型3′-UTR。

一)miRNA靶点（S1至S11）在CDK5R1型用于生成荧光素酶结构体的3′-UTR和3′-UTR（从R1命名为R7）区域的示意图。B类)SK-N-BE细胞用CDK5R1型3′-UTR-荧光素酶结构体，每个结构体包含一个或两个预测的结合位点，或删除了结合位点的相同结构体（称为ΔS结构体）。转染后24小时，收集细胞，然后评估Renilla荧光素酶活性，并将其归一化为萤火虫荧光素酸酶活性。与野生型构建物相比，S1和S8的缺失导致荧光素酶活性增加。(*第页<0.05, **第页<0.01).C类)用pGL4.71P控制质粒（无UTR）转染SK-N-BE细胞，pGL4.71 P-UTR为野生型（UTR）或S1（UTRΔS1）或S8（UTR△S8）缺失型。与野生型UTR相比，S1缺失导致荧光素酶活性增加。(**第页<0.01).D类)荧光素酶构建物R1含有S1，R4含有S8，在SK-N-BE细胞中瞬时共转染，并分别用100 nM pre-miR-103和pre-miR107处理。Pre-miR-34a被用作控件，因为它无法绑定CDK5R1型3′-UTR。当用前miR-103或前miR-107转染时，R1构建体的萤光素酶活性显著降低。(*第页<0.05, **第页<0.01).

为了研究miR-103和miR-107是否在S1和S8位点上显示活性，将含有S1的结构体R1和含有S8的结构体R4瞬时转染SK-N-BE细胞，并用前miR-103与前miR-107处理。Pre-miR-34a被用作阴性对照，因为它不靶向CDK5R1型3′-UTR。如所示图5D当转染miR-103或miR-107时，R1结构体的荧光素酶活性显著降低，而R4结构体在转染两种miRNAs后不受影响，表明该位点对miR-103和miR-107的表达不敏感。此外，miR-34a的转染并未如预期的那样导致荧光素酶活性的任何变化。这些数据表明miR-103和miR-107对CDK5R1型通过结合S1位点进行调节。值得注意的是，基于PicTar和miR-103，S1位点的杂交自由能最低(表1)和RNA杂交分析(图S1和S2系列).

miR-103、miR-107和CDK5R1型沉默降低SK-N-BE细胞的迁移能力

鉴于p35在神经元迁移中的基本作用以及miR-103和miR-107可以调节内源性p35水平的证据，我们研究了它们的转染是否也影响SK-N-BE细胞迁移能力。如所示图6转染后8小时，50nM pre-miR-103和pre-miR107转染细胞的迁移能力分别显著降低31%和28%；转染24小时后，50 nM pre-miR-103和pre-miR107转染细胞的迁移能力显著降低，分别为42%和46%。转染50 nM对照miRNA后，对细胞迁移能力没有明显影响。将SK-N-BE迁移能力设置为100%，计算抑制百分比。为了支持miR-103和miR-107通过调节p35水平影响SK-N-BE迁移的说法，我们通过CDK5R1型SK-N-BE细胞中的siRNA转染。p35蛋白水平在48小时时下降了41%(图S3，面板A），72小时时为42%(图S3面板B）50 nM和100 nM后CDK5R1型siRNA细胞转染。随后通过划痕试验监测p35敲除细胞的迁移能力。转染后8小时，50 nM的迁移能力CDK5R1型转染siRNA的细胞在转染后24小时显著减少至23%和44%。50 nM对照siRNA的转染不影响细胞迁移。划痕试验也转染了100 nM的每个分子，得到了可比较的结果（数据未显示）。这些结果表明，miR-103和miR-107通过p35抑制参与细胞迁移。

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细胞迁移的测量在体外划痕试验。

将50 nM pre-miR-103、pre-miR107或对照miR（C-miR）和50 nM CDK5R1 siRNA或对照siRNA（C-siRNA）瞬时转染SK-N-BE细胞。从8小时和24小时开始评估迁移能力。一)图中显示了划痕（T0)，8小时（T8)和24小时（T24)擦伤之后。放大倍数为10倍。B类)8小时后（T8)从零开始，在50 nM pre-miR-107转染细胞中，迁移被抑制了25%，在50 n M pre-mi R-103转染细胞上抑制了26%，在50 N M pre-mi-R 103转染的细胞中抑制了23%CDK5R1型与未转染细胞相比，siRNA转染细胞。24小时后（T24)从零开始，在50 nM pre-miR-107 SK-N-BE转染细胞中，迁移受到41%的抑制，在50 N M pre-mi R-103转染细胞上，迁移受到40%的抑制，而在50 N m pre-miR 103转染的细胞上，移动受到42%的抑制CDK5R1型siRNA转染细胞。(*第页<0.01).

讨论

p35，由编码CDK5R1型是一种短命蛋白质，其在细胞中的水平的精细调节对CDK5活性至关重要[21]最近报道了PKCδ对p35稳定性的调节[22]以及CDK5R1型还研究了3′-UTR对其表达的转录后控制[23]，即使对CDK5R1型/作为一类重要的转录后调节因子，miRNAs的p35水平从未被研究过。

miRNAs参与了多种细胞过程，如增殖、分化和凋亡，并且考虑到哺乳动物大脑的高度复杂性，miRNA成为调节中枢神经系统特定功能（如神经元迁移、分化和突触可塑性）的重要因素[37].

这里我们已经证明miR-103和miR-107影响SK-N-BE神经母细胞瘤细胞中p35的表达，并且它们的过度表达减少了细胞迁移。功能研究表明两种miRNAs对CDK5R1型3′-UTR，允许我们识别功能性结合位点。

分析CDK5R1型PicTar的3′-UTR允许选择6个miRNAs，以在其中存在10个以上的结合位点CDK5R1型3′-UTR，有趣地属于同一家族，称为miR-15/107家族[38]。这些miRNAs表达一种自动增益控制motif位于成熟miRNA的关键5′端附近，已知可调节参与细胞分裂、代谢、应激反应和血管生成的基因的表达。miR-15/107组也与人类癌症、心血管疾病和神经变性疾病有关[38].

在所选择的miRNA中，miR-103和miR-107的表达水平与p35水平相比显示出最负的皮尔逊相关系数。此外，预计它们还可以结合7个自由能<-20 kcal/mol的靶位点(图1,表1). miR-103和miR-107的成熟序列只有一个碱基不同，因此被称为同源miRNAs，并被预测结合相同的靶位点，除了一个外CDK5R1型3′-UTR。miR-103由两个不同的基因编码，MIR103-1型（基因ID:406895）和MIR103-2型（GeneID:406896），居住在PANK3系列（GeneID:79646；染色体5q34）和PANK2系列（GeneID:80025；染色体20p13）基因，分别产生相同的成熟miRNA。相反，miR-107的主要转录物(2007年3月GeneID:406901）与PANK1系列（GeneID:53354），一个定位于10号染色体的编码基因。miR-103和miR-107基因在所有已知脊椎动物中都是完全保守的。研究表明，它们在许多人体器官中表达，在脑组织中浓度最高，特别是在大脑皮层上层和白质中大量表达，在人类前额叶皮层具有层流特异性[39],[40]这两种miRNAs在多种环境中表达不同，包括发育[41],[42]，肿瘤发生[43]、神经变性[38]，缺氧[44]以及冷应激和热应激[45],[46]。目前只有少数miR-103和miR-107靶点得到验证：β-位淀粉样前体蛋白剥离酶1(BACE1公司，基因ID:933）[47],细胞周期素依赖性激酶6(川东北6，基因ID:1777）[48],颗粒蛋白(GRN公司，基因ID:4601）[49]和DICER1标准(DRCE1号机组，基因ID:17098）[50]，而脑源性神经营养因子(BDNF公司，GeneID:1033）表示为潜在目标[51].

miR-103和miR-107对p35表达的影响与其对两者的直接作用一致CDK5R1型通过qRT-PCR对总RNA和CDK5R1型mRNA翻译效率，根据多体和亚多体部分的qRT-PCR确定。众所周知，BDNF可以稳定p35，其转录物也是miR-103和miR-107的可能靶点[22],[51]，我们不能排除BDNF作用可能会增强对p35表达的影响，因为p35和BDNF均受两个研究的miRNAs调节。通过过度表达miR-103和/或miR-107以及通过CDK5R1型沉默导致SK-N-BE细胞迁移能力降低。这些发现表明，miR-103和/或miR-107对细胞迁移的影响通过p35下调发挥作用。该机制与神经细胞迁移障碍相一致硫化镉5r1KO小鼠，通过观察大脑皮层倒置分层推断[11]这一证据表明，这两种miRNAs可以在细胞迁移的调节中发挥作用，迄今为止，这一功能仅被证明适用于少数miRNAs[52].

相应地，miR-103和miR-107可以被纳入7个可能参与神经元迁移的miRNAs（miR-30a-5p、miR-30b、c、d、miR-103/107、miR-191、miR-195）组，通过调节细胞内的BDNF公司人类皮层的表达[51]有趣的是，BDNF激活PKCδ，进而稳定p35，增加CDK5的激活。PKCδ被证明可以调节第II/III层皮层神经元的径向迁移，并且在培养的新生皮层神经元中，PKCδ和p35都是BDNF刺激迁移所必需的[22]此外，正确的神经元迁移和皮层层压在很大程度上取决于p35通过调节参与细胞运动的运动蛋白和细胞骨架成分来激活CDK5[53]众所周知，p35蛋白以泛素和蛋白酶体依赖的方式进行快速转换[21]其水平是CDK5活性的速率限制[17]因此，迁移神经元中适当CDK5活性的维持在很大程度上取决于p35的水平，因此需要精确调节p35。硫化镉5r1KO小鼠由于异常的神经元迁移而表现出大脑皮层层的倒置分层，可能损害了正常认知系统的发育。CDK5R1型单倍体不足被认为是NF1微缺失患者精神发育迟滞的可能病因之一[16]该基因的一些变体与孤立的精神发育迟滞有关[54].

维持适当p35水平的重要性可能涉及不同的分子机制，旨在通过蛋白质稳定和通过转录后调节因子（如miRNAs）的作用调节mRNA稳定性或翻译效率来微调其表达。神经系统和神经退行性疾病中也有miRNA调节异常的报道，这使得miRNA功能障碍是否同时是疾病的原因和/或后果的问题悬而未决[55].

CDK5的主要功能之一是稳定微管的蛋白质磷酸化，如Tau[56]Tau的异常磷酸化也依赖于CDK5的过度激活，似乎是神经纤维变性中最有害的步骤，导致与阿尔茨海默病相关的神经纤维缠结的形成[57]有趣的是，miR-107已被证明在阿尔茨海默病及其靶点中显著下调，BACE1公司发现，增加了[47]因此，p35水平升高可能是由BDNF增加蛋白质稳定性和/或miR-107下调后上调引起的，导致阿尔茨海默病患者CDK5过度激活。有趣的是，miR-107在p35表达调控中的作用表明BDNF公司和BACE1公司可能与共同监管CDK5R1型在CNS中。

miR-103和miR-107与CDK5R1型使用荧光素酶构建物和整体的功能研究已证明3′-UTRCDK5R1型3′-UTR或其一部分包括一个或在少数情况下包括两个结合位点。S1和S8结合位点缺失的结构体中荧光素酶活性增加表明其具有破坏稳定的功能。出乎意料的是，我们发现S5/6和S10位点的缺失分别降低了R3和R6结构体的荧光素酶活性。即使我们验证了突变并没有产生miRNA靶位点或可识别的顺式-通过使用不同的生物信息学工具，我们不能排除未知因素顺式-调控元件或miRNA靶位点或破坏mRNA稳定的二级结构可能是通过我们的操作产生的。将含有S1或S8位点的构建物与miR-103或miR-107联合转染，使我们能够验证两种miRNA对S1靶点的直接作用。这一结果可以用S1的miR-103和miR-107的杂交自由能较低来解释，根据PicTar和RNAhybrid工具，S1在所有预测的miRNA靶位点中杂交自由能最低。我们必须考虑到，相对于对照pGL4.71P质粒，所有野生型结构的荧光素酶活性都降低了，这是因为存在一些转录后调控元件，这些元件一直对基因表达具有抑制作用CDK5R1型3′-UTR[23]这一特征使得检测荧光素酶活性进一步降低更加困难。此外，值得注意的是，S1对miR-103和miR-107具有特异性，而S8也可以被miR-15a和miR-195靶向，其作用可能解释了S8结合位点缺失的结构体中荧光素酶活性的增加。

保护CDK5R1型进化过程中的3′-UTR序列，不同调控区域的识别[23]以及对几个具有低结合自由能的miRNA结合位点的预测，明确了该区域在转录后调控中的功能复杂性。我们在这里已经证明了这一点CDK5R1型/p35的表达可以被miR-103和miR-107调节，我们发现miR-103与miR-107可以调节细胞迁移，因此在以前的研究中，它们的作用被归因于其靶向BDNF和p35[11],[51]了解到CDK5活性水平取决于p35的数量，我们推测p35水平可以通过涉及BDNF的蛋白质稳定机制以及涉及miR-103和miR-107的转录后表达调控进行精细控制，后者反过来共同调节p35及其稳定因子BDNF水平。

为识别miRNAs靶点提供新见解的研究可能会导致对特定分子通路的阐明，并确定其在特定细胞功能中的意义。监管场所的识别CDK5R1型mRNA及其结合因子除了有助于理解该基因转录后调控的作用外，还可能用于研究神经疾病的新发病机制。

材料和方法

miRNA靶位点预测

使用PicTar算法预测miRNA靶位点(http://pictar.mdc-berlin.de/). 使用RNA杂交分析miRNAs和预测靶位点之间的杂交自由能(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahidd/).

细胞培养物

将人神经母细胞瘤SK-N-BE（2）细胞（ATTC代码CRL-2271）培养在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素-链霉素、0.01 mM L-谷氨酰胺、11 g/L丙酮酸钠和4.5 g/L葡萄糖的RPMI-1640培养基中在含有10%FBS、100 U/ml青霉素-链霉素和0.01 mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中保存。人前列腺癌DU-145细胞（ATTC代码HTB-81）在含有10%FCS、100 U/ml青霉素-链霉素、0.01 mM L-谷氨酰胺和10 mM HEPES的RPMI-1640培养基中培养。人类乳腺癌MCF-7细胞（ATTC代码HTB-22）在含有10%FCS、100 U/ml青霉素-链霉素和0.01 mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基中培养（所有培养基成分均来自意大利Euroclone）。培养物保持在37°C的5%CO2培养箱中。

蛋白质印迹

在标准条件下进行分析。简而言之，在Bio-Rad（CA，USA）Trans-blot仪器中，在100 V下，用12%SDS-PAGE分析等量的蛋白质，并将其印在硝化纤维素膜Hybond增强化学发光（ECL；Amersham Biosciences UK，Ltd.，Buckinghamshire，UK）上90分钟。按照供应商（Amersham Biosciences）的指示，使用ECL Plus检测试剂盒处理印迹。用兔抗p35（C-19）多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.，CA，USA）和兔抗β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，CO，USA。所有实验都进行了三次。

Pre-miRs、anti-miRs和siRNA转染

模拟内源性成熟miRNAs（hsa-miR-103：5′-AGCAGCAUGUACAGGCUAUGA-3′和hsa-miR-107：5′-AGCAGCAUGUACAGGCUAUCA-3′)Pre-miR™miRNA前体分子-阴性对照#1和单链抗miR-103/107 miR抑制剂（寡核苷酸），旨在抑制内源性hsa-miR-103/107，购自Ambion（美国德克萨斯州奥斯汀）。siRNA ON TARGET PLUS智能池CDK5R1或非靶向池购自Dharmacon（Lafayette，CO，USA）。按照Salvi的描述进行转染实验[58]简单地说，SK-N-BE细胞接种在完全培养基中，在24孔Costar（5×104每个孔的细胞数）。将细胞转染到无血清RPMI中，接种24小时后，在50和100 nM的双链hsa-miR-103/107或单链抗miR-103/107 miRNA抑制剂或50 nM和100 nM的条件下转染CDK5R1型siRNA，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Burlington，ON）转染试剂。转染后通过qRT-PCR测量成熟miRNA分子水平证明，转染具有非常高的效率（数据未显示）。24小时后，用添加10%胎牛血清的RPMI替换转染培养基。在转染48和72小时后，制备条件培养基和细胞提取物进行分析。

多体RNA提取

SK-N-BE电池（4×106)如上所述转染后，在37°C下用0.01 mg/ml环己酰亚胺培养3分钟，然后将平板放在冰上。取出培养基，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）+环己酰亚胺0.01 mg/ml冲洗细胞两次。用300µl冷裂解缓冲液[10 mM NaCl，10 mM MgCl直接在平板上裂解细胞2，10 mM Tris–HCl，pH 7.5，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.2 U/µl核糖核酸酶抑制剂（加利福尼亚州伯灵顿的发酵剂），1 mM二硫苏糖醇和0.01 mg/ml环己酰亚胺]，刮取并转移到Eppendorf管中。将提取物在4°C下12000 g离心5分钟。将上清液冷冻在液氮中，并在−80°C下储存，或直接加载到含有30 mM Tris–HCl、pH 7.5、100 mM NaCl和10 mM MgCl的15–50%线性蔗糖梯度上2，并在180000下在SW41转子中离心100分钟克收集组分（多胞体和亚多胞体），监测254nm处的吸光度，并在37°C下直接用0.1 mg/ml蛋白酶K处理2小时。在苯酚-氯仿萃取和异丙醇沉淀后，将多体和亚多体RNA重新悬浮在30µl不含RNA酶的水中，然后使用RNeasy试剂盒进行再验证（德国希尔顿市齐根）。

实时PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）分离转染细胞和非转染细胞的总RNA。使用纳米滴分光光度计测量RNA的纯度（A260/A280值为1.8–2.1）和浓度。

为了定量分析成熟miR，使用从Applied Biosystems（美国加利福尼亚州福斯特）获得的引物和探针，进行了两步Taq-Man实时PCR分析。使用逆转录酶和miR-15a（ID000389）、miR-16（ID000391RNU6B系列TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）中所含的（应用生物系统推荐的内源性控制；ID001093）。通过将样品在16°C下培养30分钟、42°C培养30分钟和85°C培养5分钟来执行逆转录酶反应。PCR反应（20µl）包含1.3µl逆转录酶产物、10µl Taq-Man 2×Universal PCR Master Mix和1µl适当的TaqMan MicroRNA分析（20×）包含相关miR的引物和探针。PCR混合物在95°C下培养10 min，然后进行40个95°C循环15 s和60°C循环60 s。miRs的表达基于DCT方法，使用RNU6B作为内源性对照。

用于测量CDK5R1型使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）合成来自总RNA或来自多体/亚溶体级分的转录物、总cDNA。使用Kapa SYBR快速qPCR主混合（美国马萨诸塞州沃本市Kapa Biosystems）和引物进行实时PCRCDK5R1型飞行重量：TGAGCGGTCTAGTGGAAAG公司，CDK5R1版次：AGCAGCAGAGAGAGTGTAG公司，GAPDH fw:TGCACCACACTGCTAGC公司，GAPDH版本：ggcatggactggtcatgag,铝飞行重量：GAGGCTGAGAGAGAGAATCG公司和Alu公司版次：GTCGCCCAGGCTGGAGTG公司PCR反应（10µl）包含1µl逆转录酶产物、5µl TaqMan 2×Universal PCR Master Mix和0.2µl每个引物。PCR混合物在95°C下孵育3 min，然后进行40个95°C周期10 s、60°C周期20 s和72°C周期10sCDK5R1型基于DDCT方法，使用GAPDH公司或铝作为内部控制。所有PCR均使用iQ5实时PCR检测系统（Bio-Rad）进行三次。

体外划痕试验

将320000个SK-N-BE细胞接种在直径30mm的完全培养基中的皮氏培养皿中，CDK5R1型如前所述，siRNA和50/100 nM阴性对照siRNA和miR。24小时后，用新鲜培养基替换转染培养基。当细胞达到100%汇合时，用无菌微移液管尖端划破细胞层。用PBS洗涤后，添加无血清培养基。划伤后立即拍摄受伤区域的图像（T0)8小时和24小时后（T8和T24)监测细胞向受伤区域的迁移。迁移能力通过使用ImagePro Plus 4.5软件测量划伤区域的面积来量化。实验进行了两次。

3′-UTR构造

整个人类CDK5R1型使用具有校对活性的PFU-Taq聚合酶（美国加利福尼亚州圣地亚哥Promega）和含有侧翼XbaI识别序列的引物，从PAC144O22中扩增出3′-UTR或其片段(表2).

表2

用于产生人类3′-UTR荧光素酶结构的寡核苷酸CDK5R1型基因。
碎片大小（bp）顺序PCR退火温度（°C）
UTR公司2688转发：5′GCTCTAGA公司ATCGGTGAGCACTGCGCTG 3′ 62
版次：5′GCTCTAGA公司GAATCAGCACAGTACAAAAAAAAAAT 3′
第1层662传真：5′GCTCTAGA公司ATCGGTGAGCACTGCGCTG 3′ 62
版次：5′气相色谱TCTAGA公司AGCAGCAGAGAGAGGTAG 3′
第2层357转发：5′GCTCTAGA公司TGAGCGGTCTAGTGGAAAG 3′ 58
版次：5′GCTCTAGA公司GTATGGCATCCCTCACCTTG 3′
Fr3级365转发：5′GCTCTAGA公司CAAGGTGAGGATGCATAC 3′ 56
版次：5′GC坦桑尼亚联合共和国GAAAGAAAATCAATAAAGTACAC 3′
4楼320转发：5′GCTCTAGA公司TGCTGGAATAGGGACCTGG 3′ 56
版次：5′GCTCTAGA公司GTGCTGTGAAGTCTGTG 3′
周五346转发：5′GCTCTAGA公司GGGACTGTCAGATAAATCGGTG 3′ 60
版次：5′GCTCTAGA公司tccaggtttacaagaaaaagagaa3′
6楼159转发：5′GC坦桑尼亚联合共和国GGCTTACACTGAGAGAACTA 3′ 58
版次：5′GCTCTAGA公司GTAGGTTTTTTTTTATTGTGATC 3′
7楼213转发：5′GCTCTAGA公司TTTAGATCAACAATAAAAAAAAC 3′ 54
版次：5′气相色谱TCTAGA公司TCCAGGTTTACAAAAAAGAGAA 3′
XbaI识别站点序列以粗体显示。

PCR产物连接在pGL4.71载体（Promega）Renilla荧光素酶编码区下游的XbaI限制位点，其中先前克隆了pGL3-启动子载体（Promega）的SV40启动子区域，以获得pGL4.71P质粒。通过使用Big DyeTM Terminator Cycle Ready Reaction Kit和3130XL ABI Prism Genetic Analyzer（Applied Biosystem）直接测序验证插入物的正确方向。

使用wt质粒作为模板，并使用两个携带所需突变的互补特异性30 nt引物，生成删除miR靶点的构建物(表3). 我们验证了miRNA位点的缺失并没有为所选的miRNA创造新的结合位点，并且使用UTRscan在http://itbtools.ba.itb.cnr.it/utrscan和RegRNA网址：http://rechna.mbc.nctu.edu.tw/将含有10×缓冲液和1.25 U Pfu Turbo DNA聚合酶（美国加利福尼亚州斯特拉赫内）、62.5 ng每个引物、0.4 mM dNTPs和5–50 ng模板质粒的混合物在95℃下培养30 s，然后在95℃培养30 s、55℃培养1 min和68℃培养2 min，每个Kb质粒长度培养18个周期。然后使用5U DpnI酶（Fermentas，St.Leon-Rot，Germany）在37°C下降解模板质粒5小时，模板质粒因细菌来源而甲基化。

表3

用于删除miR-103/107靶位点的寡核苷酸。
姓名顺序
德尔站点1转发：5′GGTCAGGGGTAGGCACCTGTAGGAGCT 3′
版次：5′AGCTCCATACGTGTGCCTACCCTGCACC 3′
delSite2/3（删除站点2/3）转发：5′GCCCCCCTACCCCCCCCAGCGCGTGT 3′
版次：5′ACCAACGTGGCTGGGAGGGGGTAGGGC3′
delSite4转发：5′agggctaaggctctctcacatg3′
版次：5′ACAAAATGTCATGTGCAGGCCTTAGCCT 3′
delSite5/6转发：5′ctacaactgatcattttggtttccacctt3′
版次：5′AAGGTGGAAACCAAAATGATCAGTTGAG3′
delSite7转发：5′GGAGGACATCTGCCTCCTGGCCCAGCAGCAG 3′
版次：5′CTGCTGGGCCTCAGGAGGCAGATGTTCTCC 3′
delSite8转发：5′GCGGTGGAAGGAGCCGACAGACTTCACA 3′
版次：5′TGTGAAGTCTGTGCCGGCTCTCCACCGC 3′
德尔站点9转发：5′CAGCCTGTCTCAGAGCTGGCACAGAGG 3′
版次：5′CCTCTGGTCGCACGCTGTAAGACAGGCTG 3′
德尔站点10转发：5′AGAACCATTTGCCAATGACACTACTTTTT 3′
版次：5′AAAAGTAGTCTTCATTGGCAAATGGTTCT 3′
delSite11转发：5′CCTTATTCTTAATTTTACGGTGATATTG 3′
版次：5′CCAATATACACCGTAAAAATTAAAAAAAAGG 3′

荧光素酶检测

荧光素酶活性测定，1.3×105转染前24小时，将每孔SK-N-BE细胞接种在12孔培养皿中的1 ml培养基中。使用2µl Lipofectamine 2000（Invitrogen）和150 ng含有不同CDK5R1 3′-UTR片段的pGL4.71P构建物在60-70%的合流处转染细胞。转染GFP表达质粒后，通过细胞计数测定，转染效率>90%。为了使转染后Renilla荧光素酶活性对转染效率和细胞存活率的值正常化，共转染了pGL3-启动子萤火虫荧光素酶报告基因（150 ng）。转染细胞用PBS洗涤并用被动裂解缓冲液（Promega）裂解24 h后，使用单通道光度计中的双球荧光素酶测定系统（Promeca）测量Renilla和Firefly荧光素酶活性。

用前miRs和荧光素酶构建物瞬时转染SK-N-BE细胞，3.5×105细胞接种在6孔板中，然后在接种后24 h用100 nm双链hsa-miRs转染，并在接种后48 h用荧光素酶报告体（300 ng）转染，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000转染试剂。播种后72h，按上述方法测定荧光素酶活性。每个实验至少进行三次。

统计分析

直方图表示平均值，条形表示平均值的标准偏差。使用Student t检验确定结果的统计学显著性，当第页<0.05. 使用三个实验的平均值，使用皮尔逊相关系数计算miRNAs和p35表达之间的线性关系程度。

支持信息

图S1

miR-103靶点的保存和杂交分析 CDK5R1型 3′-UTR。人类3′-UTR中预测的miR-103靶位点的保守性CDK5R1型（参考序列号NM_003885）比较五种不同物种（hs，智人; pt、，黑猩猩; 毫米，小家鼠; rt；褐家鼠; 囊性纤维变性，家族犬)以及通过RNAhybrid程序评估的microRNA/目标双工体的最小自由能杂交（mfe）预测。

（文件）

图S2

miR-107靶点的保存和杂交分析 CDK5R1型 3′-UTR。人类3′-UTR中预测的miR-107靶点的保守性CDK5R1型（参考序列号NM_003885）比较五种不同物种（hs，智人; pt、，黑猩猩; 毫米，小家鼠; rt；褐家鼠; 囊性纤维变性，家族犬)以及通过RNAhybrid程序评估的microRNA/目标双工体的最小自由能杂交（mfe）预测。

（文件）

图S3

p35静音 CDK5R1型 小干扰RNA。western blot检测p35数量CDK5R1型siRNA，阴性对照（C−siRNA）和未转染的SK-N-BE细胞。一)p35蛋白水平下降41%(**第页<0.01）和38%(*第页与未转染细胞相比，转染后48 h，分别转染50 nM和100 nM siRNA p35的SK-N-BE细胞中的p35表达量为<0.05）。B类)p35蛋白水平下降了42%和35%(**第页<0.01）在转染50 nM和100 nM的SK-N-BE中CDK5R1型siRNA分别在转染72小时后与未转染细胞进行比较。

（畅通节能法）

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：本研究得到了意大利大学和研究部的以下资助：国家利益研究项目（PRN合同编号2007MWCEAL_003 to PR，网址：http://prin.mur.it/)，意大利基础研究基金会（FIRB合同编号RBFR0895DC至MV，网址：http://firb.miur.it/)以及布雷西亚大学的当地MIUR基金（对GDP）。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。

工具书类

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