NRF2缺乏小鼠的年龄相关性视网膜病变

摘要

介绍

AMD是美国老年人严重视力损害的主要原因，估计有175万人患有晚期疾病[1],[2]AMD的一个主要病理特征是年龄依赖性的外视网膜进行性变性，包括RPE、Bruch膜（BrM）和下伏脉络膜[3],[4]AMD的发病机制可能涉及多种遗传、环境和人口因素。尽管近年来AMD的主要遗传变异已被确定[5],[6]，它们的生物功能在很大程度上仍然难以捉摸。与其他复杂的人类疾病类似，小风险等位基因和基因环境与其他风险因素（如高龄和氧化应激）的相互作用的影响，对于确定AMD的发病、进展和治疗反应的个别过程至关重要[7],[8].

NRF2是内源性抗氧化保护的主调节器，通常参与II期解毒酶的转录控制[9]它与小分子Maf蛋白异二聚并结合顺式-II期基因启动子区的作用抗氧化反应元件（ARE）序列[10]NRF2的激活不是依赖于任何单一的抗氧化酶，而是导致在解毒过程的不同步骤中协同上调具有协同功能的保护性蛋白质组。编号2基因敲除小鼠胚胎发育正常，其许多组织中抗氧化状态的基础水平与野生型小鼠没有差异[11]然而编号2^−/−小鼠对多种药理和环境毒物的敏感性增加[12],[13]NRF2也是小胶质细胞功能的重要调节器[14]和慢性神经炎症[15]据报道，NRF2缺乏小鼠表现出更多的星形胶质细胞增生和微胶质细胞增生[16].

通过破坏氧化应激和抗氧化保护之间的平衡，建立了几种AMD小鼠模型。缺乏关键抗氧化酶SOD1或SOD2的小鼠，视网膜发生了年龄依赖性变性，某些表型类似AMD[17],[18]用二十二碳六烯酸（DHA）的氧化片段羧乙基吡咯（CEP）免疫小鼠，导致自身免疫反应和视网膜干性AMD样病变[19]最近的一项研究报告称，白化大鼠暴露于强烈的循环光下，在相对较短的时间内发生光感受器损伤和CNV[20]虽然这些模型可以重现许多AMD样表型，但它们的实验方法主要是通过极高水平的氧化剂信号压倒视网膜抗氧化系统。RPE细胞如何利用其复杂的内源性保护机制来修复和从氧化损伤中恢复常常被忽视。

为了更好地了解参与RPE/脉络膜变性和CNV发展不同阶段的内源性保护机制，我们研究了年龄依赖性视网膜病理编号2击倒老鼠。我们的数据表明编号2^−/−小鼠出现了RPE和脉络膜毛细血管的年龄依赖性变性、自发CNV和RPE下间隙内炎性蛋白沉积。在人类AMD眼睛中观察到这些特征，表明编号2^−/−小鼠可以成为一种有用的工具，用于探索疾病机制的特定方面。

结果

Nrf2年龄相关表型的临床检查^−/−老鼠

酒醉是AMD的标志性病变[4]我们对30例Nrf2进行了眼底镜检查^−/−小鼠（2–18个月）和12只年龄匹配的野生型小鼠视网膜中的核糖样沉积(表1). 野生型小鼠的眼底在所有年龄组均正常(图1A). 编号2^−/−8个月龄前（n=5），小鼠眼底正常，与年龄匹配的野生型小鼠（n=3）无明显区别。8-11个月，Nrf2^−/−5只老鼠（n=5）开始长出小的、圆顶状的硬核，边缘锋利，颜色呈白色(图1C). 在11到18个月之间，基因敲除小鼠（n=20）出现了更多的软质核果状沉积物，具有较大的尺寸、黄色和边界不清，以及视网膜中周的RPE斑点萎缩病变(图1B和1D).

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图1

早期AMD样变性编号2^−/−老鼠。

（A） 12个月大的野生型小鼠的正常眼底照片。（B） 将一只12个月大的敲除小鼠的中央和周边视网膜的照片合并，显示点状和斑片状沉积物（箭头）和RPE斑点（箭头）。（C） 放大后的图片显示了轮廓清晰的斑点和中周边视网膜上的大片斑片状沉积物（箭头所示）。（D） 尺寸较大、边界模糊的软核果状矿床。+10 dB（25 cd·s/m）时的（E和F）Scotopic ERG记录²)闪光强度，显示a波和b波振幅在编号2 ^−/−将小鼠与年龄匹配的野生型小鼠进行比较（每组6只*P（P）<0.05, **P（P）<0.01，学生t检验）。

表1

眼底镜、组织学检查结果总结编号2^−/−小鼠（发病率/眼睛检查）。

	编号2−/−老鼠		RPE病理学			Sub-RPE存款		其他
组织学	年龄（月）	动物数量	色素沉着减少	过度色素沉着	真空吸尘器	德鲁森	漫反射高程	视网膜下细胞	CNV公司
	1–7	8	1/11	1/11	0/11	0/11	0/11	2/11	0/11
	11–13	9	5/12	9/12	8/12	2/12	10/12	8/12	1/12
	14–17	三	2/5	3/5	5/5	1/5	4/5	3/5	2/5
眼底检查	年龄（月）	动物数量	RPE斑点			结节状沉积物		片状矿床
	2–7	5	2/9			0/9		0/9
	8–11	5	7/10			7/10		1/10
	11–18	20	30/35			27/35		20/35

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用暗视ERG评价野生型和Nrf2基因敲除小鼠的体内视觉功能。6个月时，Nrf2之间没有观察到显著差异^−/−和对照小鼠（数据未显示）。然而，在12个月大的Nrf2中检测到a波和b波振幅中度但显著降低^−/−老鼠(图1E).

Nrf2中的RPE退化和CNV^−/−老鼠

通过光学显微镜对20只Nrf2基因敲除小鼠和15只年龄匹配的野生型对照小鼠（4-17个月）进行组织病理学检查(表1). 野生型小鼠所有年龄段的视网膜均正常(图2A). 相反，在Nrf2的外视网膜中观察到了年龄依赖性的退行性变化^−/−到第一年年底，老鼠。在甲苯胺蓝染色的玻片上，RPE变性的迹象，包括广泛的空泡化(图2B)，色素沉着(图2B–2D)，色素减退(图2E)以及RPE完全丧失的偶尔区域(图2F)在12个月大的敲除小鼠中发现。12个Nrf2中的11个在RPE下方有明显的连续基底沉积区域^−/−老年小鼠检查(图2C和表1)，但在年龄匹配的野生型对照组中很少检测到（n=1/10，P<0.001，Fisher精确检验）。苏木精和伊红（H&E）染色切片上，发现在BrM和RPE之间有圆顶状的细胞外物质沉积，形成鼓泡(图2H). 在视网膜色素上皮病变附近偶尔可见视网膜下细胞浸润(图2I).

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图2

视网膜色素上皮变性和CNV的组织病理学编号2^−/−老鼠。

（A） 在甲苯胺蓝染色的1µm塑料切片上，一只12个月大的野生型小鼠的正常视网膜。（B–F）12个月大婴儿的典型退行性病理学编号2^−/−小鼠包括RPE空泡化（B，星号）和BrM增厚（B，黑色箭头）色素沉着过度（B到D，开放箭头）、色素沉着不足（E，箭头）、RPE亚沉着（C和F，虚线下）和RPE细胞丢失（F，星号。（G–I）H&E染色石蜡切片，显示（H）圆顶状核果沉积，（I）视网膜下细胞浸润，（G）视网膜下出血伴黑色素细胞（箭头），（J）脉络膜新生血管通过受损的BrM进入视网膜（箭头）。（比例尺：A–I=10µm；J=20µm）

CNV是渗出性AMD的特征性特征。通过组织学检查，我们观察到Nrf2中17只眼中有3只眼出现了自发CNV^−/−11至17个月龄的小鼠(表1). 在CNV部位，可见局灶性RPE增生和上覆光感受器和外核层萎缩(图2J). 视网膜下出血和渗出(图2G)这是CNV的两个可靠的眼科症状[21]，也出现在CNV患者的眼睛中。Nrf2的百分比^−/−发生自发CNV的小鼠与喂食高脂肪饮食的ApoE基因敲除小鼠中的报道类似[22].

通过透射电子显微镜（TEM）检查，野生型小鼠显示出RPE、BrM和脉络膜毛细血管的正常结构，RPE基底内折和内皮开窗发育良好(图3A). 在Nrf2中^−/−小鼠在12个月时RPE出现明显的退行性改变。RPE细胞被膜碎片高度空泡化(图3B). 基底内折区被无定形和均质材料沉积物取代(图3C)与人类AMD眼睛中发现的连续基底层沉积（BlamD）相似[23]一些矿床包括带状构造(图3D)类似于人类AMD BlamD中发现的长间距胶原蛋白[24].

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图3

老年人外视网膜的超微结构变化编号2^−/−老鼠。

（A） 一只12个月大的野生型小鼠的电子显微照片。脉络膜毛细血管（CC）的内皮开窗用箭头标记。（B） 的RPE编号2^−/−12个月龄的小鼠出现大液泡（V），其中含有膜碎片、未消化的POS（箭头所示）和含有黑色素的物质（箭头所指）。BrM因胶原和弹性蛋白纤维的紊乱而增厚（星号）。（C） 基底内折被连续基底沉积物所取代（箭头所示）。（D） 高倍镜显示基底层流沉积和横向带状结构（箭头）。（E） 广泛增厚的外胶原层（OCL）和基底线性沉积物（BlinD）。（F） 老化时BrM厚度增加编号2^−/−老鼠。给出的数据是每组6只小鼠的平均测量值（平均值±SE）（*P<0.01，Student t检验）。

与年龄匹配的野生型对照组相比，Nrf2的BrM显著增厚^−/−12个月大的小鼠(图3A和3B). 敲除小鼠和野生型小鼠的BrM平均厚度分别为0.955±0.065和0.569±0.075µm（平均值±SEM）(图3F)（P<0.01，未配对t检验，每个菌株n=4）。增厚通常呈弥漫型，在BrM的内胶原和弹性蛋白层观察到胶原纤维断裂(图3B)，这也是AMD的特征[24]在某些区域，我们观察到BrM的外胶原层广泛增厚，经常伴有RPE和BrM内的颗粒碎片(图3E). 此外，在RPE基底膜和BrM弹性蛋白层之间发现了电子密度的碎片，类似于人类AMD的基底线性沉积物（BlinD）(图3E).

作为血-视网膜屏障的一部分[25]，野生型视网膜中的脉络膜内皮细胞高度开窗并毗邻BrM(图3A). 然而，在NRF2缺乏小鼠中，随着绒毛膜毛细血管内皮的明显增厚，窗孔明显消失(图3B和3C). 在某些区域，内皮细胞突起突破基底膜并突入BrM(图3B和3C)这可能标志着这些区域血管异常生长的开始[26],[27],[28]综合来看，EM和组织病理学数据表明Nrf2^−/−小鼠在高龄时出现了RPE、BrM和脉络膜毛细血管的AMD样变性，以及自发的CNV。

Nrf2中炎症蛋白的脂褐素积累和亚RPE沉积^-/-老鼠

人类眼睛中脂褐素的年龄依赖性积累和由此产生的自体荧光与RPE萎缩和进展为晚期AMD相关[22],[29],[30],[31],[32]在Nrf2中^−/−小鼠，我们观察到RPE细胞中以年龄依赖的方式积聚自体荧光颗粒(图4). 12个月时，野生型小鼠的眼睛在RPE下只显示出非常微弱的自身荧光物质。在Nrf2中^−/−然而，相同年龄的小鼠，RPE自身荧光更为显著(图4). 值得注意的是，尽管脂褐素样颗粒分散在RPE层中，但容易聚集在完整性受损的细胞周围。

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图4

脂褐素在编号2^−/−老鼠。

在WT（A）和编号2^−/−小鼠（B）12个月龄。（B）中的插入从红框标记的RPE团块区域放大。（比例尺，100µm）

据报道，人类酒糟中含有补体系统和细胞外基质的成分[5],[33],[34]在NRF2缺乏小鼠中，我们观察到RPE和BrM中C3d、血清淀粉样蛋白（SAP）、卵磷脂和免疫球蛋白（IgG）的免疫反应性随年龄增加而增加(图5A). 3-硝基酪氨酸是氧化损伤蛋白质的标记物，其染色也显示RPE和亚RPE空间随年龄增加(图5B). 12个月时，硝化蛋白主要位于RPE的顶端；然而，在14个月时，它们倾向于向BrM重新分配(图5B).

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图5

WT和WT视网膜外层切片的免疫荧光染色编号2^−/−老鼠。

从6个月、12个月和14个月大的小鼠中制备冷冻切片，并用指示的抗体进行染色。使用WT和编号2^−/−老鼠。（比例尺，100µm）

Nrf2中的溶酶体依赖性降解途径^−/−老鼠

RPE的主要功能是通过吞噬作用不断清除感光细胞外段（POS）。如所示图6，个^−/−小鼠有未消化的POS积聚(图6A和6C)，表明退化的RPE细胞在溶酶体介导的细胞器转换中效率降低。成人RPE细胞被认为是有丝分裂后的细胞，利用自噬（一种依赖溶酶体的自我更新过程）来清除受损的大分子和细胞器[35],[36].随着老化，Nrf2^−/−RPE显示出自噬失控的迹象。EM很容易检测到自噬的中间结构，如自噬体和自溶体(图6A、6D和6F). 膨胀的线粒体常在自噬空泡附近发现(图6A和6B)表明线粒体自噬异常（线粒体吞噬）[37]也检测到脂褐素增加的区域(图6E). 值得注意的是，在BrM异常部位附近常常存在吞噬和自噬未消化中间产物的积累。电子致密结构让人联想到自噬相关的空泡，似乎具有从RPE到脉络膜毛细血管的定向运动(图6A–C). 因此，随着年龄的增长，多泛素化蛋白聚集体在RPE下面积累(图5C). 这些数据共同表明Nrf2^−/−RPE在溶酶体依赖性降解方面存在缺陷，在通过自噬去除氧化损伤的蛋白质聚集体和细胞器以实现细胞内环境稳定方面效率较低。

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图6

溶酶体依赖性降解途径中间结构的积累编号2^−/−老鼠。

在BrM异常部位，RPE细胞显示自噬体（A、箭头和F）和自溶体（A，D和F，箭头）增加，自噬空泡（A和B）、未消化POS（A和C）和脂褐素（C和E，开放箭头和F。BrM中也检测到非均匀电子致密沉积物（星号）。OCL，外胶原层；m、 线粒体；五、 真空；比例尺：500 nm。

讨论

在目前的研究中，我们证明NRF2缺乏的小鼠表现出人类AMD的许多主要病理特征，包括丘疹沉积(图1)RPE、BrM和脉络膜毛细血管的年龄相关性变性(图2和图3)，RPE自身荧光增强(图4)和自发CNV的发展(图2). 与年龄匹配的野生型小鼠相比，编号2^−/−小鼠ERG上的a波和b波振幅中度下降(图1). 以前在AMD患者中也有类似的杆驱动ERG反应降低的发现[38],[39]IgG和补体途径的成分及其调节因子的沉积(图5)与在人类AMD眼睛中发现的类似[34],[40],[41],[42].的中位寿命编号2据报道，基因敲除小鼠为106周[43]因此，退化的视网膜表型发生在其寿命的最后1/3期间。因为我们没有对整个眼睛标本进行连续切片，CNV和其他局部病变的发生率(表1)可能被低估了。总之，我们的研究结果支持氧化应激在AMD发病机制中的致病作用，并提示编号2^−/−小鼠是AMD的新动物模型。

SOD1和SOD2缺乏小鼠的视网膜氧化损伤和AMD相关病理学已经证实[17],[18]这些动物的整个视网膜发生进行性退化。光感受器细胞的严重丢失发生在视网膜色素上皮变性之前或同时，这种时间进程不是人类AMD的典型特征。除了显示的不同表型外编号2和草地敲除小鼠后，这些蛋白质具有独特的抗氧化功能。虽然SOD负责从正常代谢过程中产生的反应性中间产物的构成性去除，但NRF2主要通过改变细胞巯基/二硫键氧化还原状态的信号机制激活[9]因此SOD1标准^−/−小鼠在更早的时间点发育，并随着年龄的增长而发展[18]相反，NRF2缺乏小鼠的RPE/BrM/脉络膜变性主要发生在其寿命的最后1/3，并随着年龄呈指数增长，这是与年龄相关的退行性疾病的典型特征。未来，研究其他遗传或环境因素是否能与NRF2系统相互作用并改变这些动物的疾病进程将是一件有趣的事情。

自噬空泡增多是自噬失控的最初迹象[44]对NRF2缺乏小鼠老化RPE的EM研究表明，自噬、未消化POS、脂褐素和异常线粒体的中间结构在自噬体和空泡附近积聚(图6). 自噬是一种保守的溶酶体途径，对细胞器的更新和聚集蛋白的清除至关重要[45]在自噬过程中，不需要的蛋白质和细胞器被分类为双膜自噬体(图6F)它们被进一步输送并与溶酶体融合，以降解被隔离的货物，并最终将生成的大分子作为分解代谢底物进行再循环。RPE细胞的一个独特特征是吞噬POS，POS产生反应产物，如A2E（N-亚视黄素亚基-N-亚视黄素乙醇胺），A2E是溶酶体功能的有效抑制剂[46]放松调控的自噬与各种神经退行性疾病如阿尔茨海默病有关[47]，亨廷顿舞蹈症[48]和帕金森氏病[49]自噬也可能是保护RPE免受AMD相关退行性改变的中心机制。

与EM观测结果类似编号2^−/−之前的一份报告显示，自噬体样结构在人类AMD眼睛的RPE中积累[50]各种中间形式的自噬空泡和多泡体的积累可能是由于自噬流量增加或溶酶体最终降解减少。在NRF2缺乏的RPE中，当动物衰老时，受损的抗氧化系统可能不足以保护溶酶体免受POS衍生反应中间体造成的损伤。另一方面，最近的一些出版物表明NRF2可以调节p62的表达[51],[52]，是一种受体蛋白，在自噬小泡的初始形成过程中介导货物组装[53]虽然我们在培养的RPE细胞中证实了类似的发现，但没有体内在RPE中发现p62 mRNA的变化编号2^−/−小鼠（数据未显示）。NRF2如何直接调节RPE中的自噬途径仍有待于未来的研究。

有大量证据支持先天性免疫反应在AMD发病机制中起积极作用的假说[5],[54]在我们的模型中，我们观察到补体片段C3d（C3的最终降解产物）以及作为补体途径调节器的卵黄凝集素和血清淀粉样蛋白P的亚RPE沉积。数据表明炎症可能导致编号2^−/−老鼠。免疫反应蛋白在RPE下间隙的沉积可能与自噬有关。溶酶体功能和自噬活性受损的RPE细胞可能通过胞吐在膜包裹的囊泡体内释放细胞代谢废物(图6A至6C). 多泛素化材料在亚RPE空间和BrM中的沉积(图5)可能进一步导致血肿形成，并启动涉及补体激活的先天免疫反应。Wang等人最近的一项研究表明，在人类AMD眼睛中，胞外体标记物CD63和CD81呈阳性染色[50].

根据我们的实验数据和文献报道，我们提出了自噬在AMD中的作用模型(图7). 在正常RPE细胞中，自噬负责清除蛋白酶体无法处理的多泛素化蛋白质聚集物。自噬体内的货物将以溶酶体为目标进行降解，并回收用于分解代谢。在易导致年龄相关性RPE变性的条件下，细胞应激升高将导致蛋白质和细胞器的损伤增加，并增加自噬负担。活性代谢物（如A2E）可以抑制溶酶体介导的翻转，并导致废物积累，最终压倒自噬能力。因此，未消化的蛋白质可以通过胞吐被输出到细胞外空间和BrM中，并促进溶栓形成和局部炎症。

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图7

将氧化应激、自噬和溶酶体功能纳入AMD病因的示意图模型。

RPE细胞暴露于高水平的细胞应激中，当健康时，受损的蛋白质和细胞器会通过自噬迅速清除。在疾病条件下，如抗氧化防御能力下降和溶酶体抑制，自噬的自我更新效率降低。由此产生的细胞废物可以通过胞吐输出，并有助于RPE亚型沉积和鼓泡形成。NRF2可能参与调节抗氧化反应和自噬活性。

NRF2有许多其他记录功能。它可以调节神经炎症。MPTP处理编号2^−/−与接受相同治疗的野生型小鼠相比，小鼠引起的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活更为明显[16].培养编号2^−/−小胶质细胞和星形胶质细胞也表现出较高的促炎基因表达，如IL-6、TNF-α、IL-β和iNOS[16]然而，我们没有观察到GFAP染色异常编号2^−/−并没有发现视网膜IL-6和IL-1β表达的显著差异（数据未显示）。NRF2可调节线粒体抗氧化功能[55]萝卜硫素处理可提高线粒体谷胱甘肽含量以及MnSOD和过氧化氢酶活性[56]NRF2可能参与线粒体通透性转换的氧化还原调节[55]因此，在保护RPE细胞免受氧化剂诱导的细胞凋亡方面可能是重要的。NRF2也可能调节寿命。长寿Snell侏儒小鼠的组织中金属硫蛋白1、血红素氧化酶1、谷氨酸半胱氨酸连接酶和硫氧还蛋白还原酶的表达增加，这些都在NRF2下游起作用[57]另一方面，热量限制不能延长编号2^−/−老鼠[43]老龄化是AMD的主要人口因素。所有这些NRF2介导的信号机制可能有助于NRF2对RPE衰老和年龄相关性变性的保护。

总之，我们的研究表明，NRF2缺乏的小鼠表现出与年龄相关的视网膜病变，如水肿形成、RPE/BrM变性、炎症蛋白亚RPE沉积和自发CNV，所有这些都是人类AMD的主要特征。我们的模型为AMD病因中基因/环境相互作用机制的未来研究提供了一个新的平台；可进一步优化干型和渗出型AMD介入药物的临床前药物筛选。

材料和方法

致谢

脚注

工具书类