通过2D红外光谱探测M2质子通道中的潮汐波动

摘要

跨膜（TM）通道是细胞中普遍存在的重要组成部分：它们将离子、水或基本营养物质运输到细胞中，或在细胞之间进行运输(1). 本文重点介绍了这些通道中的水分子。水的许多配置都可以存在，从液状、单列、线状结构到水密度可能会显著降低的各种簇(2). 需要对这些动态结构进行更详细的实验验证。定义传统液态水的三维氢键网络经历飞秒级氢键变化、交换和电荷重排过程。虽然河道水不一定是液态的，但确实发生的水配置的动力学可能仍然是足够瞬态的，因此传统方法可能无法揭示基本特性。然而，运输机制需要了解蛋白质构象和承压水构型的特性。在大多数TM通道中，结构是由水分子与排列在通道内部的极性肽单元相互作用形成的。这种水结构可以通过允许确定作为时间函数的结构特征的方法来定义，例如本报告中使用的二维红外光谱的情况。

超快振动响应

这里使用的超快2D红外光谱是一种独特的方法，用于表征质子通道M2中水的运动特征，这将在下一节中进行描述：它为通道水的结构动力学带来了独特的视角。2D IR光谱创建蛋白质瞬时构象分布和快速动力学的残留水平图像(三–6)通过¹³C=¹⁸螺旋骨架酰胺单元的O标记(7,8)通过测量酰胺-I振动的频率-频率相关函数，作为局部溶剂光谱密度的探针。水分子围绕蛋白质和肽中酰胺基团的运动导致酰胺-I振动频率的波动。通过将光谱变化识别为等待时间延迟的函数，可以从2D IR光谱中获得这些波动的相关性(T型)在非线性实验的第二个和第三个脉冲之间。水溶液中模型酰胺和肽的频率相关性(9–11)已经证明在1ps时间尺度上衰减，类似于液态水中的主频弛豫过程(12–14). 同位素标记策略隔离了肽特定残基的酰胺振动跃迁，而不会引起结构的显著扰动。由于同位素取代的酰胺的振动频率主要取决于它们的局部环境，因此它们充当通道不同区域附近涨落电荷微观结构和动力学的探针。

M2质子通道

M2通道存在于流感病毒中。该通道在低pH值下被激活，以跨膜运输质子，使病毒内部酸化，这一过程对甲型流感病毒的复制至关重要(15,16). 该蛋白是一种同源四聚体，由N末端、TM和细胞质结构域组成。25个残基TM结构域（M2TM），残基22-46，形成四螺旋束，传导质子并结合金刚烷胺，金刚烷烷胺是一种阻断通道孔的抗病毒药物(17,18). 因此，它是一个用于结构分析和理解M2传导机制的生物学相关模型。M2模型基于突变(19)，分子动力学（MD）模拟(20–22)，光谱研究(23–25)，最近来自X射线衍射(26,27)和溶液核磁共振研究(28). TM域中His37残基的质子化激活蛋白质以传导质子(19). 核磁共振和X射线衍射的高分辨率结构表明，M2随着pH值的降低而改变其构象，这种变化与质子跨通道传输的条件有关。建议在较高pH值下，水相比病毒内部更容易接近通道(22). 在His37残基质子化的过程中，平衡朝着更接近病毒内部的构象转移。这个循环必须导致水在两个门控构象中流动和下降。有一种观点认为M2是一个经典的门控通道，His37在低pH值下的质子化打开了一个由单一水线占据的连续孔隙，这有助于质子运输到病毒内部(29,30). 另一位科学家认为，His37在质子传导中起着直接作用，因为每一个穿过通道的质子都先被质子化，然后被去质子化(19,31–33). 有人提出，当组氨酸质子化时，螺旋结构中靠近Gly34的扭结会发生(26,34–36). 这种扭结可能会干扰Gly34羰基与其螺旋结构中相邻N-H的氢键，使C=O有可能与通道水形成氢键。水中的离子首先形成His+态，然后将离子导入病毒的机制仍然是一个谜，其解决方案可以解开涉及水和离子与蛋白质相互作用的广泛过程的关键。

Gly34残基是M2的TM域中的一个孔衬残基，其构象、动力学和水合作用取决于His37的质子化状态。Gly34和His37残基在所有可传播的流感M2序列中也保守。图1在100K下，可能处于+2状态（四聚体中四个His37残基中的两个被质子化），以1.65-Å分辨率的蛋白质X射线结构显示了Gly34附近的水结构(27). 有序水分子在N之间架起桥梁^δHis37的羰基和来自相邻螺旋的Gly34的羰基。另外一对水桥接His37四分体的对面，形成与N的氢键^ε咪唑类化合物。MD模拟表明该结构在室温下部分保持不变；固态核磁共振（SSNMR）(32,37)磷脂双层中M2的TM结构域的研究表明，在冷冻水中组氨酸-水氢键对四个His37残基的质子化程度高度敏感。组氨酸上方的水（在意义上图1)因此靠近Gly34，与N形成强大的氢键^δHis37在低pH和高pH条件下，而远端N^εHis37只在较低的pH值下与水强烈结合。根据核磁共振波谱中交换展宽的存在，还表明M2的+2态存在低势垒咪唑-咪唑氢键，这种相互作用在+3态中断(25).

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图1。

X射线晶体学实验中M2通道和相关水簇的结构（蛋白质数据库ID 3LBW）。为了清晰起见，只显示了两条螺旋线。水氧以紫色显示，Gly34残基以绿色显示，酰胺氧以红色显示。His37残基以浅蓝色显示，环状氮素(N个^δ和N个^ε)以深蓝色显示。羰基氧和附近的水氧通过黑线连接。

大量证据支持一种质子传导机制，即His37在不同的质子化状态之间交替，很可能在+2和+3形式之间交替。在接近中性pH值时，以双质子化形式为主；病毒外部的pH值（pH_外面的)降低时，质子进入通道并生成+3态，这增加了通道内部的水合作用。增加的水合作用似乎对允许质子从His37移动到通道内部、再生+2状态和启动传导循环中的另一个步骤至关重要。溶液和SSNMR在平衡状态下研究了+3态构象异质性的增加，这表明在微秒到毫秒的时间尺度上动力学增加。然而，考虑到所涉及的动态过程，很难描述构象集成的单个成员。二维红外光谱提供了有关Gly34酰胺的瞬时构象分布和水合作用的信息，非常适合探测该过程。

在这里，我们报告了同位素标记（SSN）的线性和2D IR实验结果²⁴PLVVAASIIG公司^∗34ILH公司³⁷LILWILN公司⁴⁴RL，其中G*表示¹³C=¹⁸Gly34酰胺羰基的O取代）和未标记的M2TM（SSN²⁴PLVVAASIIG公司³⁴ILH公司³⁷LILWILN公司⁴⁴RL）在十二烷基磷酸胆碱（DPC）胶束中作为pH值的函数。因为天冬氨酸羧酸盐与¹³C=¹⁸O骨干同位素标记，消光系数与酰胺-1过渡相似(38)，天冬氨酸²⁴和Asp⁴⁴在该肽中改为Asn。此外，序列中缺少其他可质子化的侧链，这使得我们可以将光谱变化与His37质子化变化联系起来。这两种替代物都出现在蛋白质的天然变体中，突变型D44N的特征已经很好(39)，因为它以甲型流感病毒的罗斯托克形式存在。这种替代增加了通道的整体传导，并增加了激活和传导pK_一约0.5 pK_一单位。

结果

隔离¹³C=¹⁸O Gly34探头振动。

酰胺-1区的线性红外光谱(图2 E类和F类)未标记和标记的肽提供了重要的基线信息，因为它们可以识别M2TM的pH值的显著变化。Gly34同位素标记的酰胺-I跃迁在1580厘米附近几乎无法识别为弱带^-1，在该区域也有精氨酸的背景吸收（参见SI文本). 相反¹³C=¹⁸如下图所示，O标签的清晰度非常显著。

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图2。

标记和未标记M2TM的二维红外和线性FTIR光谱。(一和C类)pH 6.2和pH 8下未标记M2TM的二维红外光谱。(B类和D类)M2TM与C的二维红外光谱¹³=O¹⁸分别在pH 6.2和pH 8下标记Gly34。虚线矩形表示C¹³=O¹⁸同位素过渡区。(E类和F类)在pH 6.2和pH 8下，未标记和标记M2TM的线性FTIR光谱。

二维红外显示M2中pH-相关。

二维红外光谱概述如所示图2 一–D类测量线性光谱中显示的相同宽光谱区域(图2 E类和F类). 信号来自v（v） = 0 → v（v）=1个过渡，显示为红色图2 一–D类，和相反的签名v（v） = 1 → v（v）=2个转换，以蓝色显示。通过信号沿对角线的延伸，相关频率分布的存在在2D IR光谱中立即显而易见。Arg45的酰胺-I 2D IR跃迁在未标记光谱中清晰可见¹³C=¹⁸O编辑的Gly34残留物被概括为1585厘米附近虚线矩形内的弱轮廓水平^-1在里面图2 一–D类。来自这个突出显示区域中标记肽的信号主要由¹³C=¹⁸O酰胺-I跃迁。这些非线性实验中的信噪比使得高亮光谱区域的放大图3显示了蛋白质构象的非常稳健的光谱特征。

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图3。

pH值6.2下三个等待时间的二维红外光谱(左侧)和pH值8(赖特). 对于每套(一–C类)、同位素标记区在等待时间0、1和3ps时的2D IR光谱。斜坡用黑线表示。相应的对角线轨迹绘制于D类–F类.

图3显示了(¹³C=¹⁸O） Gly34四聚体在两个pH值和三个选定的等待时间下带出。pH值和等待时间的差异很大：pH值为6.2时，G34标签上明显有两条带，而pH值为8时只有一条优势带。下部（1581 cm）的比例^-1)到更高（1591厘米^-1)pH 6.2时的频率峰值高度为1.8±0.2。pH值为8时，色带的中心位置为1585厘米^-1与低H谱中的谱带不同，表明它们共同代表了Gly34被修饰的三种不同构象或配置。pH值为8时标记肽的2D IR光谱显示，随着等待时间的增加，形状变化可以忽略不计图3然而，对于较低的pH值，2D光谱形状在皮秒时间尺度上发生了明显的演变，如图3二维红外光谱中标记残留物的皮秒时间相关光谱变化很可能是由其周围水的运动引起的酰胺-I模式频率的波动引起的。

光谱动力学的半定量度量是斜率，S公司(T型)分离2D红外光谱正负贡献的节点线(40)绘制为图4具有ω_t吨作为纵坐标。（有关坡度测量的更多详细信息，请参见SI文本.）最稳健的衡量标准S公司(T型)pH值为6.2时，构象的振动频率峰值较低（1581厘米^-1)上面提到的双倍。图4显示了S公司^-1(T型)带有T型对于这两个pH值。[对2D光谱的分析没有得出可靠的估计S公司(T型)用于1591cm处的高频跃迁^-1pH值为6.2。（请参见SI文本]在pH值6.2时观察到快速光谱动力学。相反，对于pH值8S公司^-1在等待时间高达3ps时实际上是恒定的。这一结果证明了pH值引起的构象的显著变化。

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图4。

反向斜率vs。T型适用于pH值为6.2（蓝色圆圈）和pH值为8（黑色圆圈）的M2TM G34*。pH值6.2数据的拟合以虚线表示。

讨论

水动力学的pH依赖性：Gly34的Ebb和Flow。

对于非简谐振子，斜率倒数的衰减S公司(T型)是频率-频率相关函数皮秒衰减的度量(三,40). 它的衰减跟踪那些衰减速度比红外跃迁的反向带宽慢得多的频率相关性。随着等待时间的增加，光谱变得更加垂直(S公司当初始的不均匀分布经历光谱扩散时。均匀和非均匀加宽分量对光谱的相对贡献也是斜率动力学的一个重要组成部分，纯均匀跃迁的斜率为零。逆斜率随等待时间的变化T型在单位和零之间，预期测量振动频率的相干度和检测时间测量值之间相关性的衰减(44,45).

1581厘米的二维红外光谱形状^-1pH值为6.2时M2的峰值明显依赖于等待时间T型如中所示图3这表明Gly34酰胺单元感应到的电场中的形式电荷和部分电荷在这些实验的时间尺度上是可移动的。为了获得这些光谱动力学的半定量测量，我们绘制了图4这个T型二维红外光谱反比斜率的依赖性。

对于低H，反向斜率的衰减要快得多₁₅₈₁这些结果表明，在低pH值下，大量的流动水处于Gly34羰基的氢键范围内，而pH值₁₅₈₅乐队并没有揭示任何水的运动。

在图4，将pH 6数据拟合（虚线）到模型频率相关函数：

在T型=0，模型相关性设置为0.74，这意味着存在均匀的退相贡献。实验中观察到75-fs和1.26-ps的弛豫时间，因为它们没有动态变窄。弛豫过程的贡献比实验中获得的时间长得多，在斜率测量中也可以清楚地看到。pH值为6.2时的1.25-ps衰减与在水中观察到的酰胺和小肽的氢键生成和断裂弛豫时间非常相似(9). 实验中更快的成分（实际上是一个估计值）是典型的多肽骨架带电侧链的小运动和附近水分子的振动的贡献，这些水分子可能直接或不直接与Gly34的C=O结合。在pH值为8时，相关性衰减得慢得多，在3 ps的等待时间内几乎没有发生光谱动力学。pH依赖性和水波动引起的超快松弛表明，与pH 8相比，pH 6时通道中的水分子数量显著增加。最近的自旋扩散核磁共振结果(37)表明Val27和Gly34之间的残留物在低pH下比在高pH下更容易被水吸收，并且在高pH条件下，水的流动性（毫秒级）更低。这些观察结果与2D IR结果一致。推导出的Gly34附近水的pH依赖性性质变化，对M2的质子导电性质提供了一些见解。质子在TM通道中传输的一个关键因素被认为是质子被嵌入或限制在通道中的水溶解(46). 对于低pH值下的M2，通道孔充分水合以稳定离子，而在高pH值下，水密度下降，我们看到任何剩余水结构的核运动在10-ps时间尺度上冻结。事实上，Gly34在pH值为8的His2+状态下的频率弛豫速度减慢至10 ps以上，其Gly34酰胺-I振动频率从pH值开始蓝移₁₅₈₁乐队。这些动力学表明，在高pH值下，Gly34附近不存在块状水，但它以活化的低H形式存在。水分子已通过衍射鉴定(27)和SSNMR实验(47). 这种水的固定结构可能不允许通道进行质子扩散到His34和Trp41以外所需的运动，从而在生成低氢构象之前阻止质子流动。

结论

综上所述，2D光谱能够唯一地揭示环境温度下M2质子通道构象的不同结构性质，并且通道中的水的特性强烈依赖于pH值，如图所示图5.Gly34探针在pH值为6但pH值为8时感应不到可移动的散装水。在pH值为8时确定的单一构象很可能对应于通道的静止状态。在这种状态下，Gly34没有表现出任何低于10ps的光谱动力学，这表明不存在可以在与液态水相当的时间尺度上参与氢键的形成和断裂的水。Gly34残留物感应到的任何剩余水必须固定在约。10-ps时间刻度。然而，这一发现在任何方面都与更坚硬的水结构的可能性相矛盾，水结构可能在质子向His37的传输中发挥作用，特别是在与质子通过M2传输相关的长时间尺度（毫秒）上。将pH值降低到6.2导致形成两个新特征，表明它们代表不同的、更高质子化的物种。低频振荡器（低pH₁₅₈₁)显示了在水溶液中酰胺模式的时间尺度上的振动动力学。这些发现与之前的SSNMR、MD和结晶学研究非常一致，这些研究表明细胞内部附近的通道扩张和/或低pH下的水合作用增加。这两种变化都有助于调节Gly34附近的更多水分子。快速振动动力学的出现证实了水流入渠道的开放状态。因此，出现的情况是蛋白质在低质子化水平时处于相对刚性的状态，能够以高亲和力结合一个或多个多余的质子。然而，一旦高亲和力位点饱和并产生+3状态，蛋白质就会形成新的构象，其组成的孔隙水变得更液态，从而允许扩散穿过守门的His37/Trp41对，并增加质子向病毒内部的扩散速度。虽然我们在这项工作中重点关注平衡测量，但在质子传导实验中遇到的电学和化学梯度通常是适度的（一到几个k个_B类T型)这表明，在光谱研究中在平衡状态下观察到的这些相同的状态和过程很可能适用于矢量质子转移，如质子通过M2传导的基于结构的模型的成功所示(28,43).

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图5。

2D IR显示M2的功能模型。蛋白质数据库结构2RLF和3C9J分别用于表示闭合和开放状态。残基Gly34、His37和Trp41分别以红色、蓝色和绿色显示。

材料和方法

采用标准固相合成法制备具有序列SSNPLVVAASIIGILHILWILNRL的改性M2TM肽。Fmoc-保护氨基酸和冰酰胺树脂从NovaBiochem获得。¹³C同位素标记甘氨酸，H₂O（运行）¹⁸和D₂O是从剑桥同位素公司购买的。Fmoc保护¹³C类¹⁸O-Gly是按照公布的程序制备的(48). 肽用TFA裂解，在Varian HPLC系统上用Vydac制备柱纯化，在Agilent分析HPLC系统上使用Vydac-分析柱测试其纯度。将纯肽冻干并作为干粉储存。在每次实验之前，制备肽的新鲜乙醇储备液。其浓度由Trp吸光度测定。DPC从Avanti Lipids中获得，并作为乙醇原料制备。甲醇-D4是从Isocec中获得的。

补充材料

致谢。

脚注

工具书类