阿尔茨海默病的免疫治疗

主动免疫治疗动物模型的研究

负责含有Aβ肽的蛋白质的基因是淀粉样前体蛋白（APP）。在Glenner及其同事对血管Aβ沉积进行测序之后，APP于20世纪80年代末被克隆[11]. 几年后，发现一些常染色体显性遗传阿尔茨海默病的家族在释放Aβ肽的裂解位点附近的APP发生突变[12]. 这导致了大量开发过度表达人类APP突变形式的转基因小鼠的尝试基本失败[13]. 最后出现了两种模型[14,15]其显示淀粉样蛋白沉积的位置和特征与阿尔茨海默病中发现的相同。尽管有人声称这些APP转基因模型中的某些模型优于其他APP模型，但，值得注意的是，尽管有不同的突变和启动子，但所有模型中的Aβ沉积模式基本相同（大多数APP模型和阿尔茨海默病组织中都存在皮质和海马弥漫性Aβ沉积、致密性神经炎斑块和血管淀粉样蛋白[16]). 这些转基因小鼠是淀粉样蛋白沉积的极好代表。不幸的是，许多作者认为他们是“阿尔茨海默病小鼠”，对小鼠有效的治疗应该对阿尔茨海默氏病患者有效。不幸的是，APP小鼠缺乏阿尔茨海默病的一些关键特征，包括过度磷酸化tau病理学和显著的神经元丢失。充其量，它们类似于疾病的早期临床前阶段，尽管如此，这可能是启动预防疾病治疗的最佳阶段。

阿尔茨海默病免疫治疗领域的开创性论文发表于1999年。Schenk和他在Elan Pharmaceuticals的合作者(尼欧Athena Neuroscience）证明，在形成沉积物之前，在APP小鼠模型中用aβ肽疫苗治疗小鼠，可以有效地阻止淀粉样蛋白随着小鼠年龄的增长而积累。在这篇文章发表后的几周内，我们在佛罗里达州坦帕市的研究小组开始在晚些时候治疗APP小鼠，当时淀粉样蛋白沉积已经变得明显。阿尔茨海默病病理学的一个致病成分被认为是与淀粉样蛋白沉积相关的炎症，我们担心与疫苗相关的免疫激活可能有助于清除淀粉样蛋白斑块，但也可能对周围组织造成破坏性的旁观者效应。我们最近还详细介绍了APP+PS1小鼠模型中出现记忆缺陷的时间进程[17]随着淀粉样蛋白的积累[18]. 经过几个月的反复免疫，我们对小鼠进行了行为缺陷测试，但无论是治疗过的还是未治疗过的小鼠都没有发现行为缺陷。然而，当我们继续治疗到我们预计会出现记忆缺陷的年龄时，我们发现接种疫苗的小鼠可以避免这些缺陷，而接种对照疫苗的小鼠无法学习这项任务[19]. 另一个独立研究小组在不同的小鼠模型中发现了对记忆的类似影响[20]. 在这些模型中，针对Aβ肽的疫苗或抗体可以挽救记忆缺陷的这些观察结果已被广泛复制，在某些情况下，证明可以在治疗后几天内看到挽救（在检测到斑块沉积清除之前[21,22].

重要的是，该疫苗在逆转淀粉样蛋白沉积方面的功效不仅见于转基因小鼠。非人灵长类动物也会像阿尔茨海默病患者一样出现淀粉样沉积和相关的记忆缺陷（尽管与小鼠一样，它们不会出现tau病理学）。[23]. 使用Aβ肽疫苗可以在数月内逆转这些症状[24]. 比格犬也会随着年龄的增长出现弥漫性淀粉样沉积和记忆障碍。两年的主动免疫可以清除这些弥散（未压实）沉积物，但对这些动物的年龄相关记忆损伤没有影响[25]. 重要的是要认识到，大多数哺乳动物都会出现与年龄相关的记忆障碍，大多数哺乳动物缺乏任何类型的淀粉样蛋白沉积。因此，随着年龄增长，记忆力不足并不总是与淀粉样物质沉积有关。

针对Aβ肽的新型疫苗策略和佐剂的开发一直是一个极具创造力的领域。在大多数情况下，目标是发展B细胞活化和抗体生成，同时尽量减少T细胞的参与（至少针对Aβ），因为在针对Aβ的疫苗的人体试验中发现了不良事件（见下文）。这些令人印象深刻的方法在最近的一次审查中得到了仔细的描述[26]、和不在本审查范围内。然而，长期来看，假设免疫治疗对阿尔茨海默病的病理学是成功的，这些可能成为预防该病的标准方法。

免疫治疗减少Aβ沉积的作用机制

考虑到大脑是一个免疫器官，免疫监视极少的信条，脑疾病免疫治疗方法的成功让许多研究人员感到惊讶。尽管如此，脑脊液IgG的正常范围（5–50 mg/l）约为血浆IgG浓度的0.1%，平均浓度为0.1μM。对带有碘化抗Aβ抗体的啮齿动物的研究证实，0.11%的循环抗体进入中枢神经系统[27]. 这导致了一些与抗Aβ免疫治疗相关的Aβ沉积减少相关的拟议机制。

第一种提出的机制依赖于抗体调节抗原的传统作用，从而导致巨噬细胞吞噬和补体激活[28] (图1). 这种方法假设有足够的抗体进入大脑并与淀粉样蛋白结合，从而触发常驻小胶质细胞或浸润单核细胞/巨噬细胞的吞噬细胞作用。当然，我们自己的工作和其他人的工作已经证明了系统性注射抗淀粉样抗体后淀粉样沉积物的修饰[29]. 这种机制的一个优点是，Aβ抗体的化学计量比可以大大小于1:1，并且仍然对沉积产生有意义的影响。这也可以解释为什么对一种形式的Aβ有选择性的抗体可以清除其他形式的抗体，假设存在含有这些不同形式的异源纤维[30,31].

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图1

Opsonization和吞噬作用。抗-Aβ抗体与中枢神经系统内的Aβ聚集体结合。然后，免疫复合物通过携带Fc-γ受体的巨噬细胞刺激吞噬作用。摄入的Aβ随后被消化和/或从中枢神经系统输出。转载自Ugen，K.和Morgan，D。DNA与细胞生物学20:677–678

第二种提出的机制假设抗体渗透到中枢神经系统不是一个关键步骤，循环抗体的存在会产生一个“外周汇”，由于血液中游离Aβ浓度降低，该“外周汇”会改变血脑屏障中Aβ的平衡，有利于外排[32] (图2). 当然，许多对Aβ具有高亲和力的抗体确实会显著提高循环浓度。似乎也存在循环Aβ进入中枢神经系统的机制，随着游离Aβ的下降，这种机制预计会下降[33]. 然而，也有人认为，抗体注射导致循环中Aβ增加的主要原因是血液清除率降低[34]. 这种想法的一个变种是脑室液中的抗体可能结合Aβ，并在中枢神经系统中充当汇。

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图2

外围接收器。循环中的抗Aβ抗体结合血液中的游离Aβ，增加Aβ沿其浓度梯度的流出，和/或阻止Aβ从循环流入大脑。转载自Ugen，K.和Morgan，D。DNA与细胞生物学20:677–678

第三种选择是抗体起催化作用，将Aβ单体的二级结构修饰成构象，这种构象不太可能形成与低聚物或纤维形式相关的聚集体(图3). 这是Beka Solomon及其同事在体内证明抗体影响Aβ能力之前首次提出的[35,36]. 她已经证明，低至1:10的抗体的化学计量学有效地阻止了体外Aβ原纤维的形成。我们已经证实了这一点，并将结果扩展到表明，Aβ抗体的化学计量学低至1:1000可以特异性地修饰Aβ的二级结构，并使用ATR-FTIR和原子力显微镜阻止纤维的形成[37]. 显然，这种催化修饰假说得益于在低化学计量下的活性，并且在没有巨噬细胞激活的情况下可能会有效，这种情况可能仍然会导致不利的旁观者效应。

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图3

构象的催化修饰。抗体结合Aβ并将二级结构修改为一级结构，从而最大限度地减少聚集物的形成。转载自Ugen，K.和Morgan，D。DNA与细胞生物学20:677–678

第四种机制被认为至少对脑内注射的抗体有效。即新生儿Fc受体（FcRn）抗体-抗原复合物药物流出血脑屏障[38]. 这种机制被证明是饱和的，并被Fc片段所抑制。一个可能的结果是，过量的抗体可能会通过增加无结合抗原的抗体运输而导致这种外排机制中的竞争。我们自己和其他人的研究发现，全身注射过量的抗Aβ单克隆抗体可以抑制淀粉样斑块的清除[39,40].

至关重要的是，这些机制都不是相互排斥的。此外，不同的抗体可能在不同程度上利用不同的机制。例如，不结合纤维淀粉样蛋白的抗体可能不太能够诱导吞噬作用，但作为外周汇的功能异常。一些结合Aβ的抗体可能不会改变二级结构，但仍会激活巨噬细胞和FcRn介导的转运。不同抗体利用不同机制的程度也可能为每种抗体提供不同的不良事件概况。

主动免疫（疫苗）临床试验

鉴于在动物模型中接种疫苗取得了显著的成功，并且没有针对阿尔茨海默病的任何替代性疾病改良疗法，Elan与惠氏合作，在阿尔茨海默氏病患者中发起了针对Aβ肽的主动免疫试验。该疫苗由全长肽组成，其中包含B和T细胞表位，聚集成纤维。最初约有60名患者接受了一剂或多剂疫苗的治疗，并在第一阶段安全性试验中对这些病例进行了监测。最初的观察结果之一是可变抗体反应，许多患者未能检测到针对抗原的滴度。试验进行到一半时，QS-21佐剂发生了变化，试图增强这种反应。在I期研究的试验部分没有发现不良反应[41].

这导致Elan和惠氏公司对含QS-21佐剂的AN1792配方进行了2a期试验。目的是通过多次接种使患者免疫到预设的抗体滴度。然而，在开始试验的短时间内，由于一部分患者出现无菌性脑膜脑病，即中枢神经系统的炎症反应，免疫停止，在大多数情况下，类固醇治疗效果良好。随后，一期试验中的一例患者也出现了这些CNS炎症症状，不久后死于肺栓塞[42]. 还收集了2a期研究的第二个病例[43]. 在这两例患者中，CNS的T细胞浸润明显，有脑膜炎的迹象。T细胞似乎没有直接作用于淀粉样沉积物，抗体滴度与不良事件发生率之间没有关系，但可以得出结论，这种反应是疫苗引起的自身免疫反应[44].

尽管试验中断，但一些病例确实产生了显著的抗体滴度。在苏黎世评估的队列中，在不打破盲法的情况下，使用脑淀粉样蛋白组织学分析（TAPIR）测量这些滴度[45]. 该队列（共35名）的认知功能测试表明，在接下来的一年中，滴度最高的患者的下降幅度小于未检测到抗体滴度的患者。其中一些病例在最初治疗后数年内保持稳定。虽然无可否认，这些观察结果表明，尽管观察到不良事件，但免疫治疗方法可能有益处。

在疫苗接种后4-5年，对截断的2a期疫苗接种试验中研究的患者队列进行了更完整的随访。这项研究检查了25例对免疫有反应的原始病例（滴度达到1:2200）的认知测试表现，共有129例病例。在初始应答者中发现痴呆症残疾评估（日常生活活动测量）和依赖性量表存在显著差异，表明该治疗有益处。虽然通过MRI或认知性能观察到脑萎缩率没有差异，但这些结果令人鼓舞，因为在达到预期治疗持续时间之前暂停的试验可以获得一些益处。

动物被动免疫治疗的研究

对疫苗的低反应性，以及T细胞依赖性不良事件的出现与主动免疫相结合，使多个组迅速评估单克隆抗体治疗以清除大脑淀粉样蛋白沉积。该方法成功的第一份出版物[28]，很快被其他人跟踪[32]. 我们与旧金山一家小型生物技术初创公司Rinat Neurosciences的合作促进了我们在这一领域的工作。Rinat与我们分享了他们针对特定Aβ表位开发的抗体，然后我们在我们的淀粉样蛋白沉积小鼠模型中进行了测试（使用NIA/NIH的研究支持）。我们的第一项研究检测了脑内应用抗体的效果，并详细描述了淀粉样蛋白沉积和小胶质细胞激活的快速变化过程。在一系列的论文中，我们发现弥漫性淀粉样蛋白在1天内被清除，而与小胶质细胞活化相关的嗜胶粒沉积在3天内被清理。一周后，注入抗体的区域基本上清除了沉积物，也没有抗体[46,47]. 我们进一步发现，对老年淀粉样蛋白沉积APP小鼠（18-22个月；类似于65-75岁的老年人）进行系统性抗体注射，可对预先存在的沉积物进行时间依赖性清除，3个月后，与给予对照抗体的小鼠相比，亲合性致密斑块减少了90%[29]. 然而，之前的一份简要报告表明，被动免疫治疗导致老年淀粉样蛋白沉积小鼠出现微出血[48]. 当我们对切片进行含铁血黄素染色时，我们发现与抗体介导的实质淀粉样沉积物清除相关的微出血数量随时间增加[49]. 此外，我们是第一个报告血管淀粉样蛋白沉积数量增加，以及出血与这些沉积的相关性的人。然而，值得注意的是，这些老年小鼠的大脑中有一半以上的时间存在淀粉样蛋白，并经历了微出血，但通过抗体治疗，它们仍然获得了恢复记忆能力的益处。随后，其他人证实，在开始治疗（治疗性而非预防性模型）时，对已经有沉积物的老年小鼠进行抗Aβ抗体治疗会导致微出血的发生[50,51].

在确认了Rinat抗体导致微出血的观察结果后，我们谨慎地建议他们注意这一重要问题。这导致他们修改抗体，以尽量减少与效应蛋白（如Fc-γ受体和补体蛋白）的相互作用（通过酶解糖基化）。当我们用颅内注射法检测这种抗体时，它能够清除淀粉样沉积物，而不会引起小胶质细胞的激活[52]. 使用全身给药的进一步测试表明，修饰抗体显著减少了微出血的形成，血管淀粉样蛋白沉积量略有增加。虽然淀粉样蛋白清除率略有下降，但两种改良的天然抗体都挽救了老年淀粉样蛋白沉积转基因小鼠的记忆缺陷[53].

微出血增加的一个潜在解释是，能够结合血管中淀粉样纤维的抗体可以引起局部炎症反应。最终，这可能会削弱内皮细胞屏障并导致血管渗漏。第二种可能性是，对实质Aβ沉积物的调理作用导致巨噬细胞吞噬，然后吞噬物质重新分配到血管系统。Fiala及其同事使用体外血脑屏障证明，淀粉样蛋白吞噬的巨噬细胞在试图通过内皮细胞屏障时死亡[54]. 这导致他们吞噬的淀粉样物质局部沉积。通过减少效应蛋白的激活，我们小鼠工作中使用的脱糖抗体可以通过减少小胶质细胞/巨噬细胞的激活和吞噬作用，减少血管沉积和微出血的形成。然而，由外周汇介导的效应和Aβ的催化修饰将被保留。我们使用Rinat改良抗体的结果导致辉瑞公司获得了它们。这种抗体的人源化版本目前正在进行第二阶段临床测试（ponezumab；表一)

阿尔茨海默病患者的被动免疫

鉴于主动免疫的相关问题，一些公司已开始使用抗Aβ肽的单克隆抗体进行临床试验。到目前为止，其中最先进的是来自Elan-Wyeth的N末端特异性抗体，称为bapineuzimab（目前由Wyeth-Pfizer和Janssen开发）。该抗体的第一阶段试验使用了0.5、1.5或5 mg/kg抗体的单次给药[55]. 给药前和16周后对患者进行认知测试。就安全性而言，最高剂量的10名患者中有3名出现了MRI血管源性水肿。一名患者出现了间歇性MRI高信号，在治疗前没有出现，12个月后仍然存在。这被解释为微出血。虽然不是为了测量疗效而设计的，但探索性分析发现，MMSE值在0.5和1.5 mg/kg剂量下有所改善，而在最高剂量下没有发现任何益处。这与我们上面提到的剂量-反应数据类似，抗体浓度为3和10 mg/kg时对APP小鼠有益，而抗体浓度为30 mg/kg时则无益处[39]. 这些非典型剂量反应的原因尚不清楚，尽管FcRn转运饱和是一种选择。以前也曾以抽象形式报道过类似的高剂量不活动[40].

bapineuzimab的二期临床试验也已完成。该研究包括230名患者和4个剂量的药物（0.15、0.5、1或2mg/kg），每13周注射6次[56]. 大约10%的使用巴皮奈单抗治疗的患者出现血管性水肿，其中一半是有症状的。血管源性水肿在高剂量组和载脂蛋白E4携带者中更常见。意向治疗分析未能确定巴匹尼单抗（所有剂量组的联合用药）的显著认知益处，但在完成所有6种抗体输注的患者和非载脂蛋白E4的患者中有显著益处。因此，尽管没有剂量反应效应，目前仍在进行III期试验，对E4携带者和非携带者进行单独分析。值得注意的是，先前的研究也发现，他克林对载脂蛋白E4携带者的治疗效果较差[57]或罗格列酮[58].

接种疫苗患者的病理分析

自第一批患者接种抗Aβ疫苗以来，大约8年过去了。其中一些病例现已进行尸检。由詹姆斯·尼科尔（James Nicoll）领导的南安普敦小组从一期试验中的许多患者（目前多达12名）收集了组织，并发布了多份关于这些样本分析的报告[59–62]. 根据疫苗接种后的时间，他们描述了他们所拥有的小患者群体中的以下事件序列。在相对较短的时间间隔内（不到1年），他们观察到存在不规则的“蚕食”淀粉样蛋白沉积，以及存在摄入免疫阳性淀粉样蛋白的小胶质细胞。免疫后1至3年内，他们报告淀粉样蛋白沉积部分清除（与未参与研究的年龄匹配的阿尔茨海默病样本相比），血管淀粉样蛋白沉积物数量增加，微出血增加。免疫后4-6年，他们发现两例淀粉样蛋白沉积（包括血管沉积）几乎完全清除，且无残留微出血迹象。然而，tau病理学没有得到解决。也许最令人不安的是，在这些晚期病例中，淀粉样蛋白清除并没有对认知产生任何益处[59]. 这意味着a）淀粉样蛋白对人类的认知状态没有直接影响，b）这些患者开始患有其他形式的痴呆症，或c）随着时间的推移，损伤范围如此广泛，以至于认知症状明显，抢救不可行。无论如何，如果这两个病例具有代表性，这对已经患有该病的患者进行任何抗淀粉样蛋白治疗都不是一个好兆头。值得注意的是，即使在MCI阶段，在明显的临床痴呆之前，神经元和突触的大量丢失也是显而易见的[10].

这项工作得到了NIH拨款AG-04418、AG15490和AG18478的支持。我们感谢Karen Ashe和Karen Duff尽早获得淀粉样蛋白沉积的转基因小鼠模型。