结果
M2以胆固醇依赖的方式改变膜曲率
许多蛋白质，包括几种病毒蛋白质，利用两亲性螺旋来改变膜的曲率（综述于安东尼，2006). 为了解决M2两亲性螺旋在病毒出芽中的作用，我们首先评估了两亲性螺旋对膜曲率的影响。M2已被证明能结合胆固醇(Rossman等人，2010年;Schroeder等人，2005年)胆固醇可以改变双亲螺旋诱导膜弯曲的能力(de Meyer和Smit，2009年;Egashira等人，2002年)，我们还试图探讨M2蛋白引起膜曲率的胆固醇依赖性改变的可能性。
野生型（wt）M2蛋白和两亲性螺旋突变体[M2（AH-Mut）]，其中通过将五个大块疏水残基转变为丙氨酸来改变螺旋的疏水面，试图在不破坏其α-螺旋性的情况下破坏螺旋的功能(Rossman等人，2010年)，被纯化并重组为大的单板层囊泡（LUV）。用低温电子显微镜或负染法对用wt M2蛋白重组的LUV进行检查，发现与对照LUV相比，LUV的形态发生了变化(,S2a公司). Wt M2蛋白诱导了许多“扁平”单个LUV的形成，表明M2可能导致负膜曲率(Chernomodik等人，1995年;Russell等人，2001年)在胆固醇存在的情况下(,S2a公司). 此外，发现LUV形态的变化与M2离子通道活性无关，因为与离子通道阻滞剂金刚烷胺孵育没有影响(图S2b，c).
M2以胆固醇依赖的方式改变膜曲率（A） 在存在或不存在100μg纯化的M2或M2（AH-Mut）蛋白的情况下重建LUV或无胆固醇的LUV，并通过冷冻电子显微镜进行分析。比例尺表示100 nm。（B） 如上所述制备的LUV，加上荧光膜染料（以绿色显示），脱水，电铸成GUV并立即成像。（C） 用50μg纯化M2或100μg M2（AH-Mut）蛋白按上述方法制备的GUV用0.5 mg/ml荧光素黄（以蓝色显示）重新悬浮。NC表示LUV不含胆固醇。LC表示含有0.5摩尔%胆固醇的GUV。（D） 如上所述制备的两个含M2的GUV示例，其含有17摩尔%的胆固醇。箭头表示含有荧光黄的ILV。比例尺指示10μm。另请参见图S2、S3和电影S1,S2系列.
缺乏胆固醇的对照LUV看起来“平坦”，类似于在wt M2蛋白存在下重组的含胆固醇的LUV(,S2a公司). 研究表明，胆固醇可以直接改变膜结构，从而解释了在有胆固醇和无胆固醇的情况下，对照LUV的不同形态(de Meyer和Smit，2009年). 当wt M2被重组为缺乏胆固醇的LUV时，M2似乎诱导了正的膜弯曲，并且得到的形态类似于含有胆固醇的对照LUV(,S2a公司). 缺乏胆固醇的含M2的LUV显示出许多小的聚集的“萌芽”LUV的形成，这些LUV在形态上与含胆固醇的对照LUV相似(,S2a公司). 当囊泡在不含胆固醇的情况下用M2（AH-Mut）蛋白重组时，未观察到LUV形态的显著变化，这表明M2两亲螺旋对于不含胆固醇时膜曲率的改变是必要的(,S2a公司).
我们以前的工作表明，表达M2（AH-Mut）蛋白的流感病毒在病毒感染期间，离子通道活性、蛋白表达或蛋白定位没有受到损害(Ma等人，2009年;Rossman等人，2010年). 然而，为了控制在体外膜掺入，我们测定了输入wt和M2（AH-Mut）突变M2蛋白重组成LUV的比例。根据100μg wt M2蛋白的输入，发现75%被纳入LUV中。这一数量不受胆固醇存在或不存在的影响；然而，无论是否存在胆固醇，只有35%的M2（AH-Mut）蛋白被纳入LUV。为了确保在比较重量M2和M2（AH-Mut）时发现的膜曲率差异是由于蛋白质的特定作用，而不是由于蛋白质掺入的差异，使用50μg重量M2蛋白质制造LUV，最终掺入的蛋白质量为31μg，这与M2（AH-Mut）蛋白质获得的35μg水平相当。对这些LUV的检查表明，它们保留了正曲率和负曲率的诱导，与100μg wt M2蛋白产生的LUV没有区别(图S2b，c).
M2引起膜芽体外试验
由于M2能够改变膜的曲率，我们询问M2蛋白是否能够单独引起膜芽生。我们使用了一个系统来成像巨大单板层小泡（GUV）内的出芽和膜断裂事件，该系统最近被描述用于分析ESCRT III复合物中蛋白质的功能(Wollert等人，2009年). GUV是在含有30或0.5摩尔%胆固醇的情况下形成的，其中包括纯化的重量M2蛋白或M2（AH-Mut）蛋白。含有wt M2蛋白的低胆固醇GUV表现出GUV膜的快速萌芽和许多蛋白内小泡（ILV）的形成(LC+M2，电影S1). 对ILV的分析显示，在GUV内自由移动，与膜断裂完成一致(电影S1). 由于M2蛋白在脂质双层中的随机取向，观察到向内和向外的出芽事件(); 然而，由于膜断裂后快速扩散出成像平面，向外出芽的小泡较少出现。含有M2（AH-Mut）蛋白的低胆固醇GUV与对照GUV相似（参见。LC和LC+M2（AH-Mut），电影S2)这表明M2两亲螺旋对M2介导的膜芽生至关重要。
在存在高胆固醇的情况下，未观察到wt M2蛋白的发芽事件(胆固醇+M2）。此外，对照组GUV在高或低胆固醇摩尔比的情况下重组时没有出现芽变迹象(GUV+胆固醇和LC）。值得注意的是，在高胆固醇LUV中观察到的负曲率的M2依赖性诱导()在高胆固醇GUV中未观察到(). GUV中可能发生M2诱导的负曲率；然而，由此产生的形态变化可能无法通过光学显微镜进行解析，并且囊泡大小的变化可能会在GUV大小的正常背景变化中消失。或者，依赖胆固醇的M2诱导负曲率可能取决于膜曲率的初始程度，不同的LUV和GUV曲率半径影响M2两亲螺旋的膜结合和/或曲率诱导。
通过向GUV再悬浮缓冲液中添加小的水标记荧光素黄，证实了M2诱导的出芽。仅在用wt M2蛋白重建的低胆固醇GUV的管腔内小泡中观察到路西法黄色荧光(和图S3a). 观察到一些荧光素黄色阴性ILV，然而，M2蛋白在GUV形成完成后直接开始发芽，因此，一些ILV可能在向培养基中添加荧光素黄之前完成发芽。此外，为了确认M2（AH-Mut）在并不是因为蛋白质掺入水平较低由加入50μg M2或100μg M2（AH-Mut）的LUV制成，导致这两种蛋白质几乎相等地并入囊泡。M2（AH-Mut）蛋白未观察到出芽，而重量级M2似乎正常出芽(). 由于M2不太可能在细胞内遇到不含胆固醇的脂质环境，我们用全长M2蛋白重建了含有中等浓度胆固醇（17摩尔%）的GUV。在含有17摩尔%胆固醇的情况下，M2引起膜芽生，并形成含荧光素黄的ILV，表明M2能够调节生理相关胆固醇水平的芽生(,3磅).
为了确定M2两亲螺旋是否足以介导GUV出芽，合成了一种与M2双亲螺旋（M2AH）相对应的肽。将M2AH肽添加到含有0.5摩尔%胆固醇的预先形成的GUV中导致从GUV膜快速出芽(LC+Pep M2AH），导致80.8%（n=54）的GUV含有至少一种ILV。在含有30%胆固醇的预先形成的GUV中添加M2AH肽不会导致发芽(胆固醇+Pep M2AH），只有6.2%（n=153）的GUV含有ILV。由于电铸GUV显示含有ILV的囊泡的背景水平[9.7%（n=281）的低胆固醇GUV和3.7%（n=42）的高胆固醇GUVs含有ILV]，我们试图确定在是由肽诱导的膜芽形成引起的。通过向GUV再悬浮缓冲液中添加荧光素黄，确认了肽诱导的出芽。将荧光素黄添加到GUV再悬浮缓冲液中，仅在用M2AH肽处理的低胆固醇GUV中产生荧光[72.5%（n=54）的肽处理的低胆固醇GUVs含有荧光素黄色阳性ILV，而3.5%（n=281）没有肽，0.5%（n=153）用于肽处理的高胆固醇GUV；图S3c]从而证实M2两亲性螺旋能够诱导出芽和周围水介质对ILV的吸收(LC+Pep M2AH）。有趣的是，将M2AH肽添加到低胆固醇GUV中，除了膜出芽外，似乎还导致膜渗漏，如GUV内部以及出芽的蛋白内囊泡中存在水荧光素黄色标记物所示(). M2AH肽可能具有在膜双层中形成孔的能力，如其他几种两亲性肽(Egashira等人，2002年;Lamaziere等人，2007年;Lee等人，2008年). A类两亲性肽Ac-18A-NH2可导致膜渗漏(Venkatachalapathi等人，1993年)L类两亲性肽蜂毒素可导致GUV裂解的孔隙形成邓普西，1990年) (图S4). 然而，在完整M2蛋白的背景下，跨膜结构域和全细胞质尾部可能限制了两亲螺旋穿过双层的能力，如M2 GUV出芽期间没有膜渗漏所示().
M2双相螺旋导致膜萌芽在体外（A） 用30或0.5摩尔%胆固醇电铸的GUV用10μM所示肽处理，并在1小时内成像。（B）如上所述制备和处理GUV，不同之处在于向再悬浮缓冲液中加入0.5 mg/ml的萤光黄（显示为蓝色）。（C） 按照上述方法制备的GUV用M2AH肽在指定浓度下处理1 h并成像。（D） 用10μM M2AH肽处理如上所示胆固醇摩尔%制备的GUV 1小时并成像。17%的胆固醇LY-后切表明17%的胆固醇GUV在用10μM M2AH肽治疗1小时后添加荧光素黄。（E） 按照上述方法制备的GUV（M2AH-TMR处理的样品除外，对于该样品，荧光素黄已从再悬浮缓冲液中删除），用10μM所示肽进行处理，并在1小时内成像。M2AH-WSN肽对应于A/WSN/33、M2AH-SOIV至A/California/05/2009的M2两亲螺旋，M2AH-Sc到M2AH肽的乱序序列，M2AH-TMR到罗丹明标记的M2AH肽类。LC表示GUV含有0.5摩尔%的胆固醇。比例尺指示10μm。另请参见图S3、S4和电影S3.
诱导芽变所需的肽浓度滴定在5μM时没有效果，10μM时向内芽变强劲，50μM时转向向外芽变导致GUV变形，100μM时向外芽变强劲导致GUV溶解(和电影S3)，表明膜曲率存在剂量依赖性变化。双亲螺旋改变膜曲率并引起芽生的能力已经得到了很好的证实（在德林和安东尼，2010年)并显示为两亲性肽RW16(Lamaziere等人，2007年) (图S4). 此外，几种两亲性螺旋已被证明可根据肽浓度诱导向内和向外出芽(Lamaziere等人，2007年)可能是由于膜中肽取向的浓度依赖性变化。M2两亲性螺旋肽可能会发生类似的活性，导致在.
由于全长M2蛋白能够在中等胆固醇水平的情况下引发GUV出芽，我们滴定了M2AH肽使GUV发芽所需的胆固醇量。M2AH肽在胆固醇水平达到或低于17摩尔%时诱导GUV萌芽()，这一水平可能与体质膜的许多区域相当，并与全长M2蛋白的胆固醇依赖性相一致。有趣的是，使用M2AH肽治疗含有17摩尔%胆固醇的GUV，可以在没有膜渗漏的情况下萌芽(); 进一步表明，在与M2蛋白的发芽活性无关。为了进一步证实M2介导的切断的完成，将含有17摩尔%胆固醇的GUV用M2AH肽处理1小时，然后将荧光素黄添加到成像缓冲液中。在GUV或ILV中未发现路西法黄，这表明大多数ILV在1小时处理内已完成切割，且外部缓冲液不再可评估(17%Ch LY-剪断后）。
与M2（AH-Mut）两亲性螺旋的氨基酸序列相对应的合成肽在低胆固醇的情况下不会导致GUV发芽(LC+Pep M2AH-Mut），也没有包含M2AH肽序列的扰乱版本的肽(LC+Pep M2AH-Sc）。在低胆固醇GUV中，M2AH肽诱导的出芽进一步被观察到，一种荧光标记的M2AH多肽与出芽ILV共定位(LC+Pep M2AH-TMR）和高胆固醇水平下的GUV膜(Chol+Pep M2AH-TMR）。此外，使用与流感病毒株A/WSN/33或2009年H1N1大流行性猪源流感病毒（SOIV）株的共识序列的M2双亲螺旋对应的肽治疗低胆固醇GUV，可导致GUV膜迅速萌芽(LC+Pep M2AH-WSN和LC+PepM2AH-SOIV）。M2AH肽的作用略有不同，M2AH-WSN肽的膜渗漏减少，M2AH-TMR肽在10μM浓度下的GUV裂解增强。然而，在低胆固醇环境中持续诱导膜出芽表明M2介导的膜出芽是M2蛋白的高度保守功能。
M2导致脂肪相界处萌芽
由于M2蛋白能够诱导单相GUV出芽，我们询问M2是否可以介导相分离GUV的出芽，这种GUV可以更好地模拟质膜内的结构域(Kaiser等人，2009年). 含有鞘磷脂、多不饱和磷酸胆碱和胆固醇的GUV可分为脂质有序（Lo）和脂质紊乱（Ld）相。荧光标记物的加入使两相可视化(). 将荧光标记的M2AH肽添加到相分离的GUV中表明，两亲性螺旋与Ld相结合，并在相边界处形成簇(). M2两亲性螺旋肽治疗高胆固醇GUV不会引起出芽，也不会对脂质相分离产生明显影响(). 然而，M2AH肽处理低胆固醇相分离的GUV会导致快速向外出芽，从GUV的Lo期切除开始，其方式可能类似于富含脂质的出芽病毒从体积相质膜中分离和释放，并导致大量、较小、，单相囊泡(,S5a系列,电影S4). 这表明M2两亲性螺旋可能会改变脂相之间的线张力，随后推动出芽，正如之前观察到的其他介导出芽和断裂的蛋白质一样(Allain和Ben Amar，2006年;刘等人，2006;Romer等人，2010年).
M2两亲螺旋在相界处引起膜萌芽用20或5摩尔%胆固醇和Lo和Ld相的荧光标记物电铸的相分离GUV在1小时内按指示进行处理和成像。（A）含有20摩尔%胆固醇的相分离的GUV的典型示例。（B） 如上所述制备相分离GUV，省略Lo标记。用10μM的M2AH-TMR肽处理GUV 1小时并成像。箭头表示相界处聚集的M2AH肽。（C） 如图4a所示制备的含有20摩尔%胆固醇或（D）5摩尔%胆固醇的相分离GUV用荧光素黄重新悬浮，用10μM M2AH肽处理1h并成像。Ld相显示为红色，Lo相显示为绿色，水性介质显示为蓝色。（E） 图4d中GUV的延时图像。注：Ld信号在稍后的时间点丢失是由于红色信号的快速漂白。（F） 从wt M2表达细胞或（G）M2（AH-Mut）表达细胞制备质膜球，交联GM1以标记Lo期（绿色），并将球染色为M2（红色）。比例尺指示10μm。箭头表示出芽地点。另请参见图S5和电影S4.
为了证实全长M2蛋白类似地定位于Ld期，我们创建了质膜球(Lingwood等人，2008年)来自M2和M2（AH-Mut）表达细胞。通过交联GM1并使用免疫荧光染色检测M2，我们观察到Lo期和M2的分离，表明M2在活细胞中定位于Ld期(). 此外，在Lo和M2之间的相边界处观察到出芽的Lo囊泡，细胞表达wt M2，但不表达突变体M2（AH-Mut）(,S5b、S5c)进一步表明，虽然M2两亲螺旋对于M2定位到Ld相似乎没有必要，但导致Lo相萌芽的线张力的调制需要wt-M2两亲水螺旋。
M2引起膜芽在体内
由于M2两亲螺旋足以诱导在体外脂质体分析，我们评估了M2蛋白诱导出芽的能力体内将M2表达质粒转染到293T细胞后，可通过免疫印迹法检测到含M2囊泡的出芽和释放()和电子显微镜(). Wt M2囊泡聚集；然而，这不太可能反映出任何与生物相关的活动，因为在成像前浓缩含囊泡上清液时可能发生了聚集。含M2的小泡释放到培养上清液中依赖于完整的两亲螺旋，因为M2（AH-Mut）在293T细胞中的表达导致M2小泡释放显著减少，即使与wt-M2相比表达水平降低也是如此(). 我们之前已经证明，M2在没有其他病毒蛋白的情况下表达时，仅表现出最小的胆固醇结合(Rossman等人，2010年). 因此，瞬时转染表达的M2可能介导体内以依赖于两亲螺旋的方式从质膜的低胆固醇区域发芽，类似于在体外低胆固醇GUV M2的萌芽(–).
M2引起膜芽体内（A） 用M2或M2（AH-Mut）表达质粒转染293T细胞，转染24 h后收集上清液，浓缩上清液并用western blot与全细胞裂解液比较分析M2含量。数值表示上清液中M2百分比的平均+/-标准偏差，并通过至少三次重复计算得出。M2-low表示转染DNA减少4倍的细胞，以提供与M2（AH-Mut）相当的M2表达水平。垂直线表示单独的螺栓。（B） 通过电子显微镜分析图5a中的浓缩上清液。比例尺表示100 nm。插图是下面面板100纳米正方形区域的放大图。
膜断裂点的M2定位
为了让M2介导病毒感染细胞的膜断裂，M2蛋白需要特异性地定位在正在萌发的病毒粒子的颈部。我们之前已经表明，M2在病毒感染期间被募集到脂筏和出芽部位(Rossman等人，2010年). 然而，M2通常定位于出芽丝状病毒的基部()M2的特定定位无法通过光学显微镜来解决。因此，我们通过免疫金标记和电子显微镜检查了病毒感染细胞中M2的定位。我们观察到M2定位于出芽丝状病毒和球形病毒的基底，在所有免疫金标M2中，59.9%（n=1038）的出芽病毒在颈部有特异性定位()证实了我们之前的结果，即病毒感染细胞中的M2主要位于病毒出芽部位(Rossman等人，2010年).
M2定位于萌芽病毒的颈部MDCK细胞被A/Udorn/72的3pfu/cell的MOI感染18小时。（A）将病毒感染的细胞固定并处理，以进行HA（绿色）和M2（红色）的免疫荧光检测。（B） 图6a所示图像的放大。比例尺指示10μm。（C） 病毒感染的细胞通过免疫金标记进行M2染色，并通过电子显微镜分析薄片。（D） 图像放大倍数如图6c所示。比例尺表示100 nm。箭头表示M2疫点位于病毒萌芽部位。另请参见图S6.
在完成出芽过程的病毒丝状体上也观察到M2主要定位于但不限于病毒粒子的基部。使用荧光显微镜观察到，在丝状和球形病毒群中，M2集中在丝状颗粒的一端(图S6a). 定量分析表明，63%的纤丝（n=300）具有可检测到的M2焦点，代表病毒中M2的大多数。电子显微镜研究表明，丝状病毒和球形病毒的一端与M2抗体反应，占病毒上发现的所有免疫金标M2的79.8%（n=213）(图S6b). M2的这种浓度在出芽病毒丝状体的游离端看不到，而是与出芽部位共定位()这表明M2是在出芽完成时在丝状病毒的尾端结合的。这与M2在介导膜断裂和病毒释放中的作用一致。
最近的结果表明，流感病毒的萌芽依赖于Rab11的表达(Bruce等人，2010年). 已知Rab11在内胚体出芽以及将蛋白质运输到顶端质膜中起作用，因此Rab11的敲除可能在膜断裂中起直接作用，或可能影响流感病毒蛋白质（如M2）的运输。Rab11a/b的siRNA敲除导致Rab11a蛋白水平下降85%以上(图S7a)细胞表面M2水平显著降低40%，HA水平增加2倍(图S7b，c). 这种差异不能归因于表达差异，因为HA和M2水平在对照细胞和Rab11敲除细胞中是可比较的(图S7d). 因此，虽然不能排除Rab11的进一步影响，但很可能Rab11在M2向心尖膜的转运中起重要作用，而不是在膜断裂中起直接作用。
M2双相螺旋阻滞膜断裂的突变
虽然这里显示的数据表明M2定位于出芽病毒的颈部，并且能够介导出芽和膜断裂在体外以及体内它没有区分M2蛋白在病毒出芽中的加性作用和M2蛋白介导膜断裂的必要作用。为了确定M2两亲螺旋是否是病毒出芽和膜断裂所必需的，我们用薄片电子显微镜检查了wt和M2突变流感病毒的出芽。而在wt病毒感染的细胞中，可以在细胞表面观察到丝状和球形病毒的出芽()感染M2（AH-Mut）病毒的细胞在出芽过程中出现多种病毒；然而，这些病毒粒子的分裂和释放似乎受到了损害(). M2（AH-Mut）病毒感染细胞表面的这些突变病毒呈现出典型的“串珠状”形态，这种形态存在于具有晚期结构域突变的病毒中，这些结构域突变无法招募宿主ESCRT蛋白，因此无法进行膜断裂() (袁等，2000). 值得注意的是，虽然连接每一个附着病毒的膜颈并不总是可见的，但这很可能是由于其存在于切面之外。M2（AH-Mut）不完全芽变病毒的免疫金标记表明，56.5%（n=929）的金颗粒定位于M2病灶，位于M2（AH-Mut(). 这表明M2在出芽接近完成时结合到病毒粒子中，并且M2两亲性螺旋的突变导致M2在每个粒子的膜近端结合；然而，M2不能完成膜的断裂，导致一连串的附着颗粒。感染不产生M2蛋白（ΔM2；)，证实了先前的观察结果(McCown和Pekosz，2006年). M2（AH-Mut）和ΔM2病毒的断裂形态均失败()再加上之前的研究结果表明，这些病毒具有明显的生长缺陷，并且在病毒颗粒释放方面受到损害(Cheung等人，2005年;Jackson和Lamb，2008年;Rossman等人，2010年)表明M2在介导膜断裂中起着必要的作用，并且是有效释放出芽病毒所必需的。
M2两亲螺旋是膜分离和病毒释放所必需的用3pfu/cell（A）A/Udorn/72，（A-C）A/Udarn/72M2（AH-Mut）或（D）A/Udorn/72-ΔM2的MOI感染MDCK细胞18 h，并进行电镜分析。通过（B）中的免疫金标记检测M2。箭头表示M2在膜破裂点的病灶。比例尺表示100 nm。
讨论
虽然已经提出了流感病毒组装的许多步骤，但对萌芽病毒粒子的最后截取（膜断裂）缺乏机械解释。在这项研究中，我们确定了流感病毒M2蛋白在病毒萌芽中的关键作用。我们观察到M2能够改变细胞膜的曲率，导致细胞膜在降低胆固醇的环境中萌芽和断裂(). 在病毒组装和出芽期间，M2定位于出芽病毒的颈部()需要膜断裂和释放出芽病毒().
我们以前的研究表明，HA、NA或M2的表达会导致VLP系统中的芽生，然而，与单独的每个蛋白质相比，HA和M2的表现都提高了VLP释放的效率(Chen等人，2007年). 在病毒感染期间，HA的突变或缺失可消除感染性病毒的产生，但不会显著改变细胞中萌芽的病毒颗粒数量(Chen等人，2005年;Pattnaik等人，1986年). 相反，M2蛋白的突变或缺失会损害多种不同流感病毒株的传染性和病毒颗粒的释放(Chen等人，2008;Cheung等人，2005年;岩冢-Horimoto等人，2006年;McCown和Pekosz，2005年, 2006;Rossman等人，2010年). 在没有M2的情况下，仍会形成萌芽的病毒粒子，然而，从未发生膜断裂和病毒粒子释放(). 这表明HA可能能够启动出芽事件，但其他病毒蛋白的组装可能会阻止膜断裂，直到M2补充。
在HA介导的病毒出芽起始后，M1可以桥接HA和M2，允许M2募集到富含脂筏的病毒出芽位点(Chen等人，2008;Rossman等人，2010年). 在这种富含胆固醇的环境中，M2不能诱导膜断裂()反而可能导致负膜弯曲(). 这种阻断可能会使病毒萌芽部位稳定足够长的时间，以允许病毒蛋白的全部补体的募集和组装。病毒组装可能最终耗尽与筏相关的HA的局部库，使M2位于出芽病毒的脂质有序期和大块质膜的脂质无序期之间的边界(Rossman等人，2010年). 作用于相界，将M2两亲螺旋插入Ld相可能会改变脂质相之间的线张力(). M2介导的线张力改变可能为膜曲率的改变提供驱动力，正如先前对其他线张力改变蛋白的建议一样(Allain和Ben Amar，2006年;刘等人，2006;Romer等人，2010年). 或者，由于胆固醇的硬化作用，M2两亲螺旋可能只能插入低胆固醇膜。将两亲性螺旋深入膜中可能会直接导致脂质堆积缺陷，导致膜曲率的改变，而不需要线张力衍生的能量。出芽病毒颈部膜曲率的变化可能足以导致膜断裂和出芽病毒的释放(–,–). M2两亲螺旋的突变或M2定位的改变（通过M1结合的破坏）阻止了膜的断裂和出芽病毒的释放，这解释了在两种突变病毒中观察到的生长缺陷(Chen等人，2008;McCown和Pekosz，2006年;Rossman等人，2010年).
我们的结果显示了流感病毒萌芽的机制，即病毒编码的剪断机。未来的调查将确定其出芽是否被认为是ESCRT依赖性的其他包膜病毒（参见Chen和Lamb，2008年)也编码自己的ESCRT替代物，能够介导膜断裂和病毒释放。我们的数据表明，M2两亲性螺旋对于介导膜断裂是必要的，并且充分的，并且表明M2可能作为病毒编码的ESCRT替代物，负责介导流感病毒的萌芽。因此，我们得出结论，M2是一种多功能蛋白质，除了其质子选择性离子通道活性外，在病毒出芽中也起着重要作用。
实验程序
免疫荧光显微镜
按指示感染生长在玻璃盖玻片上的MDCK细胞，固定并染色HA和M2。在玻璃盖玻片上斑点后对病毒上清液进行染色。对于Rab11敲除，用对照siRNA或靶向Rab11a和Rab11b的siRNA转染A549细胞，按指示感染并染色HA和M2。对50–100个细胞的荧光强度进行量化并取平均值。图像收集在LSM5 Pascal（Zeiss，Thornwood，NY）共焦显微镜上。
电子显微镜
LUV按指示处理，并在成像前用磷钨酸染色。对于低温电子显微镜，使用FEI Vitrobot（Hillsboro，Or）将LUV嵌入玻璃冰中，并使用Gatan（Pleasanton，CA）低温容器成像。为了分析病毒感染的细胞，如前所述，对MDCK细胞进行指示处理，并进行预包埋αM2免疫金标记，然后进行薄片检查(Leser等人，1996年). 样品在JEOL 1230（日本东京）电子显微镜上成像。
蛋白质纯化
使用Bac-N-Blue杆状病毒表达系统（Invitrogen）表达M2和M2（AH-Mut），并如前所述进行纯化(Tosteson等人，1994年).
大单层囊泡
LUV是通过使用纯化的wt M2或M2突变蛋白从4:1:2摩尔比的POPC∶POPG∶胆固醇（Avanti Polar Lipid，Alabaster，AL）或4:1摩尔比的POPC∶POPG挤出制备的。
巨大单板层囊泡
使用LUV脂质比电铸GUV，并添加0.5 mol%TopFluor-Cholesterol（Avanti）进行可视化。使用DOPC:SM:胆固醇的2:2:1或10:10:1摩尔比，并加入0.5 mol%的TopFluor-Cholesterol和Rho-PE（Avanti），在60°C下电铸相分离GUV。如前所述，通过脱水含M2的LUV制备含M2蛋白的GUV(Girard等人，2004年;Streicher等人，2009年).
萌芽试验
用M2或M2（AH-Mut）-pCAGGS转染293T细胞。收集并浓缩转染后24h的上清液。如前所述，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析上清液和细胞裂解物(Chen等人，2008).
集锦
流感病毒M2蛋白含有高度保守的两亲性螺旋。
M2两亲性螺旋足以支持ESCRT依赖性芽接在体外.
M2定位于萌芽病毒的颈部。
M2两亲性螺旋的突变抑制细胞膜的断裂和病毒粒子的释放。
