肝病学。作者手稿；PMC 2010年11月9日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院245794
犬Eck氏瘘管术后选择性门静脉输注筛选候选肝生长因子
,2 ,1 ,1 ,1 ,三 ,1 ,1 ,2 ,2和1
托马斯·斯塔兹尔
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
总裁普特
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
卡洛·斯科蒂·福格利尼
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
乔治·米哈洛普洛斯
三北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院病理学系
朱塞佩·卡里里
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
乔斯·雷霍
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
齐华曾
1宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学健康中心外科，邮编：15213
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学健康中心外科15213
2意大利巴里巴里大学消化系
三北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学院病理学系
请将转载请求发送至：Thomas E.Starzl。宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学第五大道3601号外科医学博士、博士。
摘要
犬门腔静脉完全分流（Eck’s瘘管）会导致肝细胞萎缩、肝细胞器破坏、脂肪浸润和轻度增生。通过在Eck瘘管进入分流器上方分离的左门静脉后持续四天输注测试物质来评估肝脏生长调节物质对这些变化的影响。将直接注入的左叶与未经治疗的右叶进行组织病理学比较。在所谓的肝营养效应中，刺激物质阻止了萎缩并增加了肝细胞有丝分裂。在测试的激素中，只有胰岛素具有强烈的肝营养；吨三有轻微影响，胰高血糖素、催乳素、血管紧张素II、血管加压素、去甲肾上腺素和雌二醇呈惰性。胰岛素样生长因子、肝刺激物质、转化生长因子-α和肝细胞生长因子（也称为造血素A）具有强烈的肝营养作用，但表皮生长因子的作用几乎不明显。转化生长因子-β受到抑制，但三苯氧胺、白介素-1和白介素-2没有影响。当胰岛素输注液与转化生长因子-β或三苯氧胺混合时，胰岛素的肝营养作用没有改变。这些实验表明了体内除了在体外假定生长控制因子的测试。他们说明了Eck的瘘管模型如何用于筛选此类物质，并可能帮助描述其作用机制。
对肝质量的调节和肝再生的控制了解甚少，可能是相关的过程。激素、可溶性介质和其他可能影响肝细胞大小、增殖或两者兼而有之的物质已被鉴定为在体外或体内测试模型(1–10). 这两个测试系统都很重要，因为无法保证代理在体外活动在生理上很重要。此外，在完整动物体内具有强大生理活性的物质在测试时可能是惰性的在体外(11).
安体内犬门腔静脉分流模型（Eck’s瘘管）以前曾被用来证明胰岛素显著的肝营养特性(三,4)，原油(12)并部分纯化(13)再生肝脏胞浆中的肝刺激物质（HSS）和免疫抑制药物环孢菌素(14)和FK 506(15). 在这项研究中，同样的技术被用于测试大多数其他据报道影响肝细胞增殖的生长因子。
材料和方法
实验模型
用静脉注射戊巴比妥钠、氟烷和氧化亚氮麻醉体重为8.3至13 kg的条件雌性比格犬。实验模型如前所述(三,4,12,14,15). 进行侧-侧门腔静脉分流，通过结扎吻合口上方的门静脉将其转换为功能性端-侧分流(). 分离门静脉左右主干，结扎右静脉。左门静脉分支用一根2.4 mm（内径）的插管进行插管，插管长度为1 em，固定并穿过腹壁引入一个校准的电池驱动的持续输液泵（Cormed II AIF，Cormed Inc.，Murray Hill，NJ），该泵被纳入一个无限制的光体石膏内。在门腔静脉分流术完成后立即开始，以25 ml/天的速度持续注入溶解在盐水中的受试物，并加入5 mmol/L醋酸铵和5 mg/L BSA（以避免在塑料管上聚集）。先前的实验证明，胰岛素和胰高血糖素在所用剂量内，以及两者合用时，对血糖没有影响(4). 在控制实验中（数据未显示），确定该车辆为惰性车辆。给这些动物喂食糖水随意手术当天和手术后的常规饮食。在处死动物之前，进行肝和肾功能测试。未发现血清肌酐或胆红素升高或血清白蛋白下降。埃克氏瘘典型的ALT和碱性磷酸酶轻微升高(16)都很常见。所有狗都很活跃，进食正常，临床表现良好。
Eck瘘模型，用于术后输注（A）左侧门静脉和（B）左侧和右侧门静脉。
病理学终点
门腔静脉分流术后4天，静脉注射0.2 mCi/kg(三H） 胸腺嘧啶核苷的比活度为80至90 Ci/mmol（杜邦新英格兰核研究产品公司，马萨诸塞州波士顿）。两小时后，当这些狗处于戊巴比妥钠麻醉下时，从肝脏左右叶取下标本，并将其固定在10%的正常福尔马林缓冲液中。这些狗被静脉注射氯化钾杀死。吻合口通畅，导管尖端位置正确。
对肝组织进行处理，并用苏木精和伊红染色。使用柯达NTB2液体乳剂（纽约州罗切斯特市伊士曼柯达）进行放射自显影，曝光时间至少为30天。复制肝细胞的数量作为肝细胞再生的指标，通过计算(三H） 胸腺嘧啶核苷标记每1000个肝细胞。单个肝细胞的大小（肥大或萎缩指数）通过追踪投射在标准厚度纸上的至少500个中区肝细胞来确定，切割出单个轮廓并称重。该方法已被证明可准确测定肝细胞大小，并已通过平面测量法和单细胞生物研究进行验证，单细胞生物的大小已被直接测定(2).
在正常、未改变的狗中，每1000个肝细胞中存在1.5±0.5（S.D.）标记的肝细胞，中区肝细胞的大小为0.16±0.01（S.D。埃克氏瘘后，复制率几乎增加了三倍，肝细胞大小在4天内几乎减半(4,12,15)之后存在稳定状态(17,18). 这些变化的特殊再现性使得很容易确定药物对这种转化的影响。每个实验都作为自己的对照，因为直接注入的肝叶中的细胞复制和大小可以与对侧未融合叶中的这些测量值进行比较。
已测试的代理
胰岛素和胰高血糖素的剂量与早期实验中显示的剂量相同，不会引起血糖变化(4). 其他药物的剂量根据之前确定的HSS的有效剂量进行指导(13).
激素类()
表1
Eck氏瘘犬门静脉左支持续灌注激素后肝细胞大小和放射自显影标记
| | | 每1000个肝细胞中标记的肝细胞数量一
| 单元格大小单位一
|
|---|
| 组 | N个 | 剂量kg/天 | 左叶 | 右叶 | 左叶 | 右叶 |
|---|
| 催乳素 | 2 | 200纳克 | 3.95 ± 0.07 | 3.95 ± 0.06 | 0.100 ± 0.01 | 0.097 ± 0.01 |
| 血管紧张素II | 2 | 100纳克 | 4.1 ± 0.05 | 3.85 ± 0.06 | 0.101 ± 0.01 | 0.098 ± 0.03 |
| 血管紧张素II | 1 | 200纳克 | 4.2 | 3.9 | 0.114 | 0.100 |
| 血管加压素 | 2 | 50纳克 | 3.95 ± 0.07 | 3.85 ± 0.07 | 0.097 ± 0.01 | 0.093 ± 0.01 |
| 去甲肾上腺素 | 三 | 0.10纳克 | 3.73 ± 0.7 | 3.8 ± 0.7 | 0.104 ± 0.02 | 0.104 ± 0.01 |
| 雌二醇 | 三 | 700纳克 | 5.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.4 | 0.099 ± 0.01 | 0.099 ± 0.01 |
| 吨三 | 三 | 100纳克 | 7.02 ± 0.9b条 | 4.1 ± 0.4 | 0.115 ± 0.01 | 0.097 ± 0.01 |
| 胰岛素 | 5 | 0.43单位 | 13 ± 3.8c（c） | 4.6 ± 0.9 | 0.160 ± 0.02b条 | 0.100 ± 0.02 |
| 胰高血糖素 | 三 | 0.6毫克 | 4.2 ± 1.5 | 4.3 ± 1.1 | 0.085 ± 0.01 | 0.082 ± 0.01 |
该组包括：胰岛素（人类常规半合成，E.R.Squibb&Sons Inc.，新泽西州普林斯顿）；胰高血糖素、泌乳素、血管加压素、去甲肾上腺素雌二醇和T三（西格玛化学公司，密苏里州圣路易斯）；和血管紧张素II（Peninsula Laboratories，Belmont，CA）。
生长因子刺激因子()
表2
Eck氏瘘犬门静脉左支持续输注生长刺激因子后肝细胞大小和放射自显影标记
| | | 每1000个肝细胞中标记的肝细胞数量一
| 单元格大小单位一
|
|---|
| 组 | N个 | 剂量ng/kg/天 | 左叶 | 右叶 | 左叶 | 右叶 |
|---|
| IGF-II型 | 4 | 50 | 12.2 ±0.1b条 | 4.37 ± 0.51 | 0.147 ± 0.01b条 | 0.094 ± 0.02 |
| IGF-II型 | 1 | 100 | 12 | 4.2 | 0.152 | 0.093 |
| IGF-II型 | 1 | 150 | 12.8 | 4 | 0.150 | 0.091 |
| 表皮生长因子 | 4 | 50 | 4.8 ± 0.5c（c） | 3.92 ± 0.12 | 0.114 ± 0.005c（c） | 0.094 ± 0.01 |
| 表皮生长因子 | 1 | 100 | 4.9 | 4.1 | 0.121 | 0.091 |
| 表皮生长因子 | 1 | 150 | 5.2 | 4 | 0.119 | 0.100 |
| 转化生长因子-α | 三 | 50 | 10.7 ± 0.4b条 | 3.9 ± 0.4 | 0.136 ± 0.0012b条 | 0.093 ± 0.009 |
| 高速钢 | 5 | 50 | 12.3 ± 0.03b条 | 4.6 ± 0.008 | 0.148 ± 0.015b条 | 0.08 ± 0.01 |
| HGF公司 | 2 | 50 | 12.0±0.1b条 | 4.7 ± 0.12 | 0.146 ± 0.012 | 0.089 ± 0.02 |
这些项目包括：我们实验室生产的HSS(11); 胰岛素样生长因子（IGF-II）（协作研究公司，马萨诸塞州贝德福德）；表皮生长因子（EGF）（Collaborative Research，Inc.）；转化生长因子-α（TGF-α）（Peninsula Laboratories，Inc.）；和肝细胞生长因子（HGF，也称为肝细胞生成素A或HPTA），由乔治·米哈洛普洛斯在北卡罗来纳州达勒姆杜克大学纯化(19).
生长因子抑制剂()
表3
Eck氏瘘犬门静脉左支持续输注生长抑制因子后肝细胞大小和放射自显影标记
| | | 每1000个肝细胞中标记的肝细胞数量一
| 单元格大小单位一
|
|---|
| 组 | N个 | 剂量ng/kg/天 | 左叶 | 右叶 | 左叶 | 右叶 |
|---|
| 他莫昔芬 | 三 | 1000 | 4.23 ± 0.45 | 4.03 ± 0.23 | 0.096 ± 0.01 | 0.093 ± 0.01 |
| 他莫昔芬 | 1 | 2000 | 4.2 | 3.9 | 0.103 | 0.101 |
| 转化生长因子-β | 三 | 5 | 2.4 ± 05b条 | 4.6 ± 0.8 | 0.064 ± 0.02b条 | 0.103 ± 0.01 |
| 白介素-1 | 2 | 5 | 4.4 ± 0.28 | 4.9 ± 1.3 | 0.119 ± 0.01 | 0.105 ± 0.05 |
| 白介素-2 | 三 | 5 | 4.9 ± 1.3 | 4.5 ± 0.58 | 0.112 ± 0.01 | 0.109 ± 0.01 |
这些抑制剂包括：他莫昔芬（西格玛化学公司）；TGF-β、白介素1（IL-1）和白介素2（IL-2）（合作研究公司）。
刺激剂-抑制剂组合B()
表4
右门静脉分支持续注射胰岛素（0.42 IU/kg/天），左门静脉分支注射胰岛素加三苯氧胺或TGF-β后肝细胞大小和放射自显影标记
| | | 每1000个肝细胞中标记的肝细胞数量
| 单元格大小单位
|
|---|
| 抑制剂物质 | N个 | 抑制剂剂量ng/kg/天 | 左叶（抑制器侧） | 右叶（无抑制剂） | 左叶 | 右叶 |
|---|
| 他莫昔芬 | 1 | 2,000 | 9.8 | 10.6 | 0.1511 | 0.1598 |
| 他莫昔芬 | 1 | 4,000 | 10.7 | 11.1 | 0.1421 | 0.1387 |
| 转化生长因子-β | 1 | 10 | 11.2 | 10.6 | 0.1593 | 0.1587 |
| 转化生长因子-β | 1 | 20 | 12.7 | 11.2 | 0.1684 | 0.1696 |
在单独的实验中，胰岛素是最有效的体内单独使用时，刺激物与TGF-β混合，TGF-α是唯一可以确定的明确抑制物质。将混合物注入左侧门静脉分支的同时，将胰岛素单独注入右侧门静脉分支(). 一个类似的实验是在一个门静脉分支中注射胰岛素-氨茶酚钠混合物，而在另一个门脉分支中单独注射胰岛素。
统计分析
在每个实验组中，通过标记细胞核的数量和大小单位来定量的细胞更新率在左（输注）肝叶与除双侧输注实验外未输注的右肝叶之间进行比较(). 数据被报告为平均值±S.D.学生的单尾t吨通过检验确定差异的显著性。p值小于0.05被认为是显著的。
结果
激素
胰岛素是唯一一种防止门腔静脉分流术引起肝细胞萎缩并导致肝细胞增殖显著增加的激素(). 胰岛素保护侧的肝细胞细胞器完整，脂肪沉积较少，糖原浓度较高。胰高血糖素没有影响。这些结果与之前报告的结果相同(三,4,14). 剂量为100 ng/kg/天时，T三导致增殖的程度要小得多，但不能防止萎缩。催乳素、血管紧张素II、加压素、去甲肾上腺素和雌二醇在所用剂量下是惰性的().
生长刺激因子
从再生大鼠肝细胞的胞质溶胶中纯化381000次的50纳克/千克/天剂量的IGF-II、TGF、HGF和HSS产生了胰岛素引起的相同的显著作用。EGF几乎没有明显的活性()在50至150 ng/kg/天的剂量范围内没有差异。
生长抑制剂
剂量为5 ng/kg/天。TGF-β减少了因门腔静脉分流引起的轻度增生的一半，并导致已经萎缩的肝细胞进一步萎缩。在相同剂量下，无法显示IL-1和IL-2的活性。三苯氧胺无效。
刺激剂-抑制剂组合
在双输注实验中添加三苯氧胺或将胰岛素与TGF-β剂量混合，都不会改变胰岛素介导的肝细胞增殖和防止萎缩，而TGF-().
讨论
一种活性测试物质可防止输注的肝叶中预期的急性肝细胞萎缩和细胞器破坏；此外，Eck氏瘘引起的静息肝细胞有丝分裂显著增加，而最有效的添加剂使其增加了一倍或三倍。这些所谓的肝营养反应之前已经描述过胰岛素(三,4)，原油(12)或净化(13)再生肝细胞液提取物和免疫抑制剂环孢素(14)和FK 506(15).
只有少数药物具有这些所谓的肝营养特性。本文报告的观察结果已将IGF-II、TGF-α和HGF（以毫微克计）添加到高效能物质列表中。据报道，在组织培养中或在某些情况下，在完整动物中有许多其他物质是强刺激物（例如T三) (1,20)几乎没有影响。吨三()导致低度增生和EGF刺激培养肝细胞(21)在我们的模型中几乎看不到活性，即使给药量是计划的50纳克/天的两倍或三倍(). 虽然EGF在结构和功能上与TGF-α相似，并且具有相同的细胞表面受体(22)，其相对于TGF-α的不活动性并不令人惊讶。对于肝细胞来说，TGF-α是一种比EGF更强的有丝分裂原在体外(23)，在除肝细胞复制外的许多其他功能中，它是一种更强的影响因子(24). 其他对Eck瘘管准备几乎没有影响或没有影响的假定刺激物包括催乳素激素(25)，血管紧张素II(26)，血管加压素(7)，去甲肾上腺素(6,27)，雌二醇(28)和胰高血糖素(29).
在福斯托提出的“启动和进展”概念中(30)，不同的结果在体外和体内测试可以反映细胞周期中不同时间的行为。在福斯托的命名法中，在几个小时内激活g0-g1转变的启动子可能已经存在于肝脏或血液中，或者在再生刺激后几乎立即合成(30). 在我们的实验中被测试为阴性的离子、营养素和生长调节剂可能属于这一类。福斯托方案中的一些进展阶段因子不仅调节g0–1，还调节g1-s中随后的DNA合成和有丝分裂。我们埃克氏瘘管模型中的大多数强大刺激物并不启动复制在体外但最好称为“增强子”，单独或主要作用于g1-S间期。
肝脏有丝分裂原的另一种分类方案是基于化合物对肝细胞培养物的作用。Michalopoulos交替分类中的完全有丝分裂原(31)刺激是化学定义的吗在体外条件，而他的术语“不完全有丝分裂原”（comitogen）是指非肾上腺素等物质，这些物质不是直接促有丝分裂的，而是增强完全有丝裂原的作用和/或抵消有丝分裂抑制剂的作用(32). 去甲肾上腺素的合成作用强烈依赖于胰岛素的存在(27)，这可能解释了为什么在我们的埃克瘘管病实验中看不到去甲肾上腺素的作用。
剥夺肝脏直接获得内源性胰岛素是导致埃克氏瘘后变化的最重要和最容易证明的原因(三,4,12)或其他使肝脏处于胰岛素优先状态的复杂手术(16–18,33–35). 关键的证据是，经口注射外源性胰岛素本身可以防止Eck瘘管的大部分变化(三,4). 然而，在肝细胞培养中，胰岛素本身的主要和基本作用是维持肝细胞的存活和健康，但具有最小或无有丝分裂性(36–41).
在Eck氏瘘管模型中，IGF-II的效力与胰岛素相同，尽管在肝细胞培养中它也几乎没有固有的有丝分裂性(42). 在土拨鼠肝炎模型的肝癌中发现IGF-II(43)，其在调节正常和肿瘤肝细胞中的作用值得研究。此外，强有力的证据表明，IGF-I和IGF-II不仅可以通过其自身的受体发挥作用，还可以通过胰岛素受体发挥作用体内和在体外系统(44). 因此，本文报道的IGF-II在Eck瘘管系统中的强大作用可能反映了该物质众所周知的胰岛素模拟作用。即使使用的最小剂量也有完全的促肝作用。
这样的临界值体内从本文报告的结果中可以明显看出测试结果。到目前为止，在Eck氏瘘管模型确定的七种最有效的肝营养物质中，只有TGF-α(45)和HGF(19)在组织培养中也具有很强的有丝分裂特性。HGF在Eck的瘘管模型中也有很强的作用，这是其首次证据体内效力。HGF产生于多个部位，包括胰腺外分泌部(46)，其生理作用尚待确定。但是，使用在体外在测试生长效果时，研究人员可能会认为不仅没有胰岛素和IGF-II，也没有环孢菌素(47)，FK 506(47)和HSS。然而，这五家公司都是米哈洛普洛斯公司的第一名。
除了HSS在肝细胞培养中不具有刺激性之外(10)根据其他理由，HSS（使用Michalopoulos的定义）可能具有共生作用。在本文报道的实验中，HSS是从再生大鼠肝脏的胞浆中提纯出来的，并在狗体内有效，表明它不是物种特异性的。在狗体内，残留肝脏碎片中的粗细胞液直到48小时才具有刺激活性，根据犬Eck瘘管模型的测定，72小时后达到最大效力(12)或在肝次全切除术后增加第二只狗的肝再生(48). 犬肝再生达到高峰的时间为3天(49).
可以用Eck的瘘管模型研究的其他潜在复合物的清单很长，包括数百种外源性物质，如苯巴比妥和过氧化物酶体增殖剂(50). 虽然这些药物不是促有丝分裂的在体外，它们刺激肝脏中的DNA合成体内并作为强大的肝肿瘤促进剂发挥作用。
除了筛选刺激性化合物外，Eck的瘘管模型对于体内筛选和研究抑制性物质。在细胞更新增强的背景下，TGF-β是一种强大的肝细胞增殖抑制剂在体外(51,52)在我们目前的实验中显示，除了进一步缩小已经萎缩的肝细胞的大小外，还可以抑制正在进行的增殖。在我们的埃克瘘管实验中没有活性，但据报道在组织培养系统中具有抑制作用的其他测试物质是他莫昔芬(28)、IL-1和IL-2(53).
最后，论证了利用该模型研究刺激物和抑制剂相互关系的可行性。在我们的实验中，当两种药物同时使用时，TGF-β对肝细胞复制和大小的减少被胰岛素所覆盖。重要的是要了解这些相互作用与剂量和时间相关的程度，并测试生长抑制剂与其他刺激物质的相互作用。
致谢
由退伍军人管理局的研究拨款和马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院的DK 29961和CA 35373号项目拨款资助。
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