p53抑癌基因是抗癌的主要屏障(1,2). 因此，大约一半的人类肿瘤含有p53基因突变。然而，许多其他肿瘤保留野生型p53的表达。这通常被认为反映了其他遗传或表观遗传改变的存在，这些改变使p53失去功能。然而，在某些情况下，wt-p53可能被保留，因为它对癌细胞有益；这些细胞可能滥用wtp53以获得选择性优势(三,4).
自噬是蛋白质和细胞器传递到溶酶体或液泡的主要分解代谢途径，在那里它们被降解和再循环。自噬在营养缺乏期间被激活，并且在病理条件下通常被解除调节（参考文献综述）。5和6). 自噬由细胞质成分周围的新月形隔离膜（吞噬细胞）启动，形成一个封闭的双层自噬体。自噬体与溶酶体融合成为自溶体，其内容物在其中降解。自噬体膜的延伸需要MAP1轻链3（LC3）蛋白与磷脂酰乙醇胺的结合(7). 脂溶性LC3与自噬体结合，直到与溶酶体融合，此时自噬体内LC3降解(8,9).
自噬与癌症之间存在许多联系(10–14). 肿瘤抑制蛋白（包括Beclin 1、结节性硬化症（TSC）1、TSC2、死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）和交替阅读框（ARF））激活自噬，暗示自噬具有抗癌作用。自噬也能介导肿瘤诱导的衰老(15)，一种关键的抗癌机制。然而，在生长的肿瘤中遇到有限营养供应的癌细胞可能会利用自噬来生存；这种改进的自噬能力实际上将有益于癌细胞(9–13). 对p53的研究也强调了自噬与癌症之间的复杂关系。
p53调节靶基因的表达，导致多种细胞反应，包括凋亡、细胞周期停滞和衰老(1,2). p53通过激活AMPK和抑制哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）促进基因毒性应激后的自噬(16). p53的转录靶点包括启动AMPK和抑制mTOR的倍体蛋白(17–19)和损伤调节自噬调节剂（DRAM），一种介导自噬细胞死亡的溶酶体蛋白(20). 然而，p53也可以抑制自噬(21)，该效应归因于细胞质而非核p53。这是另一个例子，根据诱导应激的性质和程度，p53可能以不同的方式调节同一过程以实现不同的生物学结果(12,13,22).
我们研究了p53对长期暴露在不利环境中的癌细胞自噬调节的影响。我们报告称，wt-p53通过对慢性营养剥夺产生更好的自噬反应来促进细胞存活，我们认为LC3在这一过程中受到调控。
结果
p53缺失导致慢性饥饿HCT116癌细胞中异常的自噬体积聚。
为了探讨p53对面临慢性营养剥夺的癌细胞自噬的影响，我们比较了保留wt p53（HCT116 p53）的人结直肠癌HCT116细胞+/+)与他们的等基因衍生物，其中p53基因已被身体敲除（HCT116 p53−/−). 对于营养剥夺，将细胞置于厄尔平衡盐溶液（EBSS）中；除葡萄糖（1 g/L）外，EBSS不含营养素或生长因子。显示LC3的免疫染色，LC3是自噬体的典型标记。在标准条件下（续），自噬体在两个p53中的数量相似+/+和p53−/−单元格(,我和三). 此外，这两种细胞类型都表现出高效的自噬体循环（自噬通量），明显表现为在溶酶体抑制剂Bafilomycin A（BafA）存在下自噬小体的积累(23) (,ii（ii）和iv（四）). 短时间营养剥夺，最长8-12小时，两种细胞类型的自噬轻度增加(图S1一). 然而，长期饥饿（24小时或更长）时，自噬体大量积聚在p53中−/−但不在p53中+/+单元格(,v（v）和vii（七）). 这可能意味着p53中功能性自噬增加−/−细胞。然而，对自噬通量的评估驳斥了这一观点。而BafA增加了p53的LC3染色+/+细胞，指示产生的自噬通量(,不及物动词)，它在p53中没有这样做−/−单元格(,viii（八）)这意味着，在缺乏p53的情况下，自噬体循环在长期饥饿下变得无效，LC3高染色实际上是因为自噬停滞，导致静态自噬小体异常积聚。这通过监测自噬活性的功能性本体蛋白降解测定得到了证实。尽管HCT116 p53蛋白降解显著增加+/+饥饿24小时后的细胞(图S1C类)，p53的作用减弱−/−细胞。
p53减少HCT116细胞长期饥饿期间的自噬启动，p53缺乏导致LC3和自噬体异常积聚。第53页+/+或p53−/−细胞在对照培养基（补充有10%FCS和2 mM的McCoy培养基）中培养我-谷氨酰胺）或厄尔平衡盐溶液（EBSS）48小时；在培养的最后3小时，如有指示，加入1mM巴氟霉素A（BafA），随后培养细胞(一)固定用于抗LC3抗体的免疫染色（实验重复三次，并显示代表性图像）或(B类)如中所述溶解材料和方法，在15%SDS/PAGE上解析，用指示的抗体进行Western印迹，并使用Image-J软件进行定量。对于每个样品，脂质化计算为LC3II和GAPDH之间的比率。非服务型p53的脂质过氧化+/+细胞被设置为1，其余的样本也相应地被归一化。给出了三个独立实验的平均结果。通过将有BafA存在时脂质LC3的值除以没有BafA的值来计算自噬通量*P（P）值<0.05**P（P）< 0.01. (C类)在EBSS中饥饿48小时的细胞被固定在Epon中，并通过透射电镜（TEM）成像。p53的代表性图像+/+单元格(顶部)和两个p53−/−单元格(中部和底部)如图所示。白色矩形左侧指示放大的区域居中和赖特白色箭头表示自噬体完整；黑色箭头表示自噬体异常堆积。(D类)HCT116 p53型+/+或p53−/−如图所示，将保存在对照培养基中或在EBSS中饥饿的细胞固定，用抗LC3抗体（红色）、抗LAMP1抗体（绿色）和DAPI（蓝色）进行免疫染色。箭头表示自溶体。
LC3在诱导自噬时转化为脂化LC3（LC3-II），减缓其相对于SDS/PAGE中非脂化LC3-I的迁移。我们监测了不同条件下的LC3-II水平。由于抗LC3抗体优先与LC3-II反应，而与LC3-I反应较少，因此LC3-II水平归一化为GAPDH而非总LC3(24). 长期饥饿降低了p53中LC3-II的水平+/+单元格(). 根据有BafA存在时LC3-II的量与无BafA时的量之比推算出的自噬通量略有减少，但总体上持续存在(). 因此，尽管自噬事件的启动速度减慢，但启动的自噬小体成功地完成了这一过程并被回收。与之形成鲜明对比的是，LC3-II在长期饥饿的p53中大量积累−/−HCT116细胞，但BafA没有进一步增加()意味着自噬通量停滞。这种趋势在饥饿8小时时就开始出现(图S1B类)，在24小时后变得更加突出().
当p53+/+透射电镜（TEM）检查饥饿48小时的细胞，大多数细胞中很少见到自噬体(,我–三). 相反，大多数p53基因−/−细胞表现出广泛的双膜和多膜结构堆积，具有广泛的形态，可能与停滞的自噬体或自溶体相对应(,iv（四）–九). 在p53中偶尔也发现类似的结构+/+但丰度低得多。
接下来，我们对LC3和溶酶体相关膜蛋白（LAMP）-1分别作为自噬体和溶酶体标记物进行了免疫荧光分析(和图S1D类). 在p53中+/+细胞，自噬体和溶酶体的广泛共定位在含有但不含BafA的情况下很明显，证实了功能性自噬通量(,ii（ii）,不及物动词,x个、和十四). LAMP-1染色的环状物经常环绕LC3染色（箭头所示），表明BafA导致自噬体物质在自溶体内积聚。然而，在p53中−/−细胞，而在基础条件下观察到LAMP-1修饰的环以BafA依赖的方式吞噬自噬体(,iv（四）)，长期饥饿导致BafA非依赖性LC3积累(,vii、xi、和xv（xv）). 值得注意的是，LC3优先聚集在位于溶酶体附近但通常不在溶酶体内的大簇中。这表明，在慢性饥饿的HCT116细胞中，p53调节自噬到一个可承受的速率。在没有p53的情况下，细胞继续形成丰富的自噬体，在不完成分解代谢任务的情况下无法有效回收和异常积累。值得注意的是，p53中溶酶体酸性没有降低−/−细胞与p53的比较+/+细胞，但增加了(图S1E类)表明溶酶体的数量和完整性得以维持。
p53是慢性饥饿HCT116细胞LC3 mRNA下调所必需的。
如中所述，长期饥饿的p53中LC3蛋白水平降低+/+但不是p53−/−HCT116细胞。为了进一步研究这种差异，我们监测了LC3 mRNA如前所述，人类三种LC3亚型之一的LC3B mRNA编码水平在短暂饥饿时没有变化(25). 然而，到了8小时，LC3B mRNA增加了约5倍；这发生在两种细胞类型中，表明p53不参与。在进一步饥饿时，LC3B mRNA开始下降，在24小时内达到p53的基本水平+/+细胞。相反，在p53中−/−即使在48小时后，细胞LC3B mRNA仍保持大约两倍于基底细胞的水平。另一种LC3亚型LC3A也表现出类似的模式(图S2一). 因此，在慢性饥饿的HCT116细胞中，需要p53来有效下调LC3 mRNA。
p53在HCT116细胞慢性饥饿期间下调LC3 mRNA转录后表达。第53页+/+或p53−/−收集保存在对照培养基中或在EBSS中饥饿的细胞，提取RNA并进行定量RT-PCR分析。(一)LC3B mRNA的qRT-PCR分析。未检测到p53的水平+/+将细胞设置为1，并相应地对其余样品进行标准化。给出了三个实验的平均结果*P（P）< 0.05. **P（P）< 0.01. (B类)LC3B成熟mRNA和premRNA比率的时间依赖性变化图S2B类分析LC3B mRNA的值除以LC3B premRNA的相应值并求平均值*P（P）< 0.05.
p53是一种转录调节因子。因此，它可能抑制LC3基因转录。然而，mRNA丰度的变化也可以反映转录后过程。因此，我们评估了饥饿对初级LC3B转录物（LC3B pre-mRNA）相对数量的影响。定量RT-PCR按照但使用来自内含子LC3B序列的引物，可以量化未成熟前体mRNA，以更好地近似相对转录率(26–28). 令人惊讶的是，除了在3小时后观察到的LC3B前体mRNA的早期增加外，饥饿诱导的变化主要影响成熟转录物而非初级转录物(图S2B类). 在p53和p53中，LC3B mRNA和前mRNA的比率在8小时时都增加+/+和p53−/−单元格()，表明成熟LC3B mRNA的p53非依赖性稳定。值得注意的是，更长时间的饥饿大大降低了p53中LC3mRNA/premRNA的比例+/+细胞，但在p53中几乎没有−/−细胞。这强烈表明，在HCT116细胞中，p53促进LC3 mRNA在长时间营养剥夺中的转录后下调。
LC3具有多个功能同源物，包括高尔基相关ATP酶增强子（GATE）-16和GABA受体相关蛋白（GABARAP）；在饥饿期间，相应的mRNA都没有改变(图S2C类). 我们还监测了自噬中重要的LC3相互作用物p62的mRNA(29,30). 与LC3 mRNA一样，p62 mRNA在8小时时上调，但较温和，之后下调(图S2D类); 然而，这是p53依赖性。
p53提高HCT116细胞在长期饥饿状态下的存活率。
p53可诱导细胞凋亡以应对严重应激。因此，我们通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术检测了p53对饥饿诱导的细胞死亡的影响；凋亡细胞通过其亚G1 DNA含量鉴定。令人惊讶的是，长期饥饿促进了p53的更多凋亡−/−HCT116细胞比p53细胞+/+单元格()这意味着p53可以保护这些癌细胞免受慢性饥饿诱导的死亡。Annexin V染色进一步证实了这一点()：超过50%的p53−/−48小时时，细胞要么早期凋亡（Annexin V+，PI−），要么死亡（Annessin V+、PI+），而p53仅为20%+/+细胞。相反，p53+/+用5-FU（一种已知的p53依赖性凋亡诱导剂）治疗后，细胞更容易死亡。siRNA-介导的p53下调+/+饥饿前的细胞导致亚G1群增加(图S3一)进一步论证了p53在这些条件下抑制细胞凋亡。值得注意的是，p21敲除并不影响细胞死亡(图S3一). 磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（ACC）（AMPK底物）的水平没有增加，表明AMPK在这些条件下没有被激活(图S3B类). 在长期饥饿期间，p53在含有wt p53的HepG2肝癌细胞中也有保护作用(图S3C类). 然而，p53敲除并没有增加饥饿诱导的表达wt p53的U2OS人骨肉瘤细胞的死亡(图S3D类). 因此，在一些但不是所有wt-p53阳性癌细胞系中，p53对饥饿诱导的死亡提供了更好的保护。有趣的是，缺乏p53−/−HCT116细胞多倍体增加()当死亡被阻止时，这一点变得更加突出(和图S3F类). 这表明功能性自噬通量降低了基因组不稳定的发生率，支持了早期的发现(31).
p53可提高慢性饥饿时HCT116细胞的存活率。(一)p53基因+/+或p53−/−将细胞保存在对照培养基中或在EBSS中饥饿48h，进行胰蛋白酶消化，甲醇固定，用碘化丙啶（PI）染色，并在FACSsort流式细胞仪中进行分析。给出了三个实验的典型结果。图中显示了G1的位置，箭头表示饥饿培养中的G1亚群。(B类)p53基因+/+或p53−/−细胞保存在对照培养基中，在EBSS中饥饿48小时，或用5-FU处理16小时，胰蛋白酶化，并用Annexin V和PI染色。给出了两个实验的典型结果。显示了每个象限中的单元格百分比。(C类)第53页+/+或p53−/−细胞在EBSS中饥饿5天，然后拍摄活细胞图像(中间左对齐和左下角)细胞固定并用结晶紫染色(左上)或在成像和染色前用对照培养基替换EBSS 24小时(赖特). 给出了三个实验的典型结果。(D类)第53页+/+或p53−/−细胞在有或无Z-VAD-fmk的EBSS中饥饿48小时，然后在LSR-II流式细胞仪中进行固定和分析。实验重复两次；给出了一个具有代表性的结果。Matlab使用FCS数据读取器脚本执行数据分析。(E类)第53页+/+或p53−/−细胞保存在对照培养基中，在EBSS中饥饿48小时或在裂解前用5-FU处理16小时，并用10%SDS/PAGE进行分析。(顶部)抗PARP，长时间暴露（L）。(中部)抗PARP，短期暴露（S）。(底部)反GAPDH。
饥饿延长至5天，进一步加剧了p53缺失的有害影响：在p53中观察到大量细胞+/+宏观和微观培养，但不在p53中−/−个(). 重要的是，补充全培养基导致p53的数量迅速增加+/+1d内的细胞()，表明细胞不仅是有活力的，而且一旦恢复营养供应，它们也能够恢复剧烈的增殖。此外，当在持续轻度营养剥夺下维持数周时，p53中仍有更多的细胞残留+/+与p53相比−/−文化(图S3E类).
通用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK（氟甲基酮）有效地将两种基因型的HCT116细胞从饥饿诱导的死亡中拯救出来，进一步证明了这种死亡的凋亡性质(和图S3F类). 值得注意的是，长期饥饿引发p53中的多聚ADP核糖聚合酶（PARP）裂解，这是凋亡的标志−/−HCT116细胞；这是可以检测到的减少数量的非发酵形式()以及解理形态的外观(). 正如预期的那样，在5-FU治疗中观察到p53状态的相反影响。
综上所述，这些数据表明，p53可以延迟HCT116癌细胞的凋亡，并促进其长期存活。
LC3敲除拯救p53缺陷的HCT116细胞免于凋亡。
为了评估p53缺陷的HCT116细胞在长期饥饿时不能下调LC3是否导致其死亡增加，在siRNA-介导的内源性LC3敲低后监测细胞凋亡。所有三种LC3亚型的联合敲除显著降低了G1亚群(和图S4一)，强烈主张过多的LC3水平有助于增强细胞凋亡。相反，GFP-LC3的过度表达适度增加了p53的凋亡+/+单元格(). 值得注意的是，LC3脂化需要击倒Atg5或Beclin 1(6)也在一定程度上减少了细胞凋亡(和图S4D类). 然而，尽管击倒很有效(图S4B类)自噬作用减弱，明显表现为LC3-II流量减少和LC3-I在siAtg5细胞中的积累(图S4C类)，其保护作用相对温和。因此，过量的LC3也可能通过其他机制促进细胞死亡，这些机制不依赖于其脂质化，也不一定与自噬有关。
敲除LC3可使p53缺陷的HCT116细胞免于凋亡。(一)第53页−/−用150 nM对照（100 nM siLacZ加50 nM非靶向siControl 2）、LC3特异性（50 nM siLC3A、50 nM siLC3B、50 nM-siLC3C）或Atg5特异性（50nM siAtg5加100 nM siLacZ）siRNA寡核苷酸转染细胞；48小时后，细胞在EBSS中饥饿或在对照培养基中保存48小时，然后进行PI和FACS分析，如给出了三个实验的典型结果。(B类)第53页+/+用增强型GFP载体或eGFP-LC3转染细胞；24小时后，细胞在EBSS中饥饿24小时，然后进行固定和FACS分析，如给出了三个实验的典型结果。
p53提高慢性饥饿非转化细胞的存活率。
接下来，我们试图确定p53是否也能保护非癌细胞免受饥饿诱导的凋亡。如中所示和图S5一p53基因敲除使MRC5和IMR90人胚胎二倍体肺成纤维细胞对长期营养剥夺引起的死亡更敏感。同样，饥饿p53的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的凋亡率高于wt-MEFs(，siCont面板）。因此，p53的这种保护功能是正常细胞的固有特征。
p53在长期饥饿期间促进未转化细胞的存活。(一)用20 nM对照（siLacZ）或p53特异性（sip53）siRNA寡核苷酸转染MRC5或IMR90细胞；48小时后，将细胞置于EBSS中48小时，然后进行PI和FACS分析，如给出了三个实验的典型结果。(B类)Wt或p53−/−用50 nM对照（siLacZ）或小鼠LC3特异性（20 nM mLC3A加30 nM mLC 3B）siRNA寡核苷酸转染MEF；48小时后，将细胞置于EBSS中，并按照一给出了三个实验的典型结果。(C类)Wt或p53−/−采集保存在对照培养基中或在EBSS中饥饿的MEF，提取RNA并用指定的引物进行qRT-PCR分析。对相同样品中HPRT mRNA的结果进行标准化。给出了三个实验的典型结果。
与HCT116细胞一样，MEF中也需要p53才能在长期饥饿时有效下调LC3 mRNA(，48小时）。然而，与HCT116不同，LC3敲除并不影响饥饿p53的死亡−/−MEF；相反，它增加了p53生产细胞的死亡(和图S5B类). 虽然这似乎与HCT116数据不一致，但实际上有一个共同点：在这两种情况下，p53似乎都通过优化自噬反应来提高适应度。在MEF中，基础自噬流量低(图S5C类)饥饿的主要挑战是诱导和维持较高的自噬率。这至少部分依赖于p53(图S5C下部)，如前所述(16). 相比之下，HCT116的基础自噬流量已经相当高()可能是由于癌细胞代谢紊乱和随后的结构性损伤(三); 因此，防止过度自噬对长期饥饿的癌细胞更为关键。无论是哪种情况，p53缺失都会影响细胞调节自噬以适应随时间变化的环境的能力，使其更容易受到长期饥饿的不利影响。
讨论
p53与自噬调节有关；然而，这种联系的确切性质似乎仍有争议。我们现在认为，p53可以以上下文相关的方式调节自噬，并提出p53有助于维持自噬体内平衡。因此，p53不仅是自噬的正调节器，也不是负调节器，而是一个变阻器，不断调整自噬速率以适应不断变化的环境。通过这样做，p53赋予细胞更大的适应性和更好的长期生存能力。它的丢失损害了正确调节自噬反应的能力。
我们表明，在长期营养缺乏的情况下延长细胞生存期是p53的固有特征，在各种正常细胞中都可以观察到。事实上，尽管p53因其促凋亡活性而广为人知，但它也可以具有促生存作用，尤其是在轻度应激条件下(32–34). p53的这种细胞保护功能可能是其在维持细胞内代谢稳态方面日益受到重视的作用的一部分。在一个健康的生物体中，这可能会降低促进癌症的细胞紊乱的发生率。然而，一些癌细胞可能利用了p53的这种生存特征：如果他们成功完成了转化过程而没有获得p53突变，那么随后的wt p53保留可能会使他们在改变营养物质可用性的条件下更有弹性。事实上，在应激条件下，阻断自噬流可能会促进体内肿瘤细胞死亡(35). 我们的发现加入了越来越多的癌症细胞滥用p53功能以服务机体健康的例子(三,4).
p53维持自噬稳态的机制在不同细胞类型之间可能不同。在HCT116细胞中，p53在长期营养剥夺条件下促进LC3 RNA和蛋白质的选择性下调。这可能使自噬开始的频率降低到与这些细胞逐渐减弱的代谢能力相适应的水平。因此，可持续的自噬通量在较长时间内保持不变。相反，p53的缺失会导致过量的LC3产生，迫使人们试图保持高的自噬率。然而，由于基本资源的持续消耗，该过程最终会停滞，减缓自噬流量，导致过度异常中间产物的积累，最终导致凋亡细胞死亡。
p53主要是一种转录调节因子。令人惊讶的是，我们发现p53对LC3 mRNA下调的影响主要是转录后的。这提出了一种有趣的可能性，即与细胞质p53调节自噬的观察结果一致(21)，p53可能通过其RNA结合活性促进成熟LC3 mRNA的降解(36). 或者，p53可以调节编码其他RNA结合蛋白的基因。无论如何，这值得进一步调查。
我们的体外观察在多大程度上与各种实际体内情况相关，尚需在正常组织和癌组织中严格确定。然而，值得注意的是，虽然饥饿会导致wt小鼠的几个组织中的自噬诱导，但在p53-null小鼠中不会发生这种情况，因为在最佳条件下，自噬体数量较多，但饥饿不会导致任何进一步的变化(21).
总之，我们的研究结果表明，p53可以确保自噬体内平衡，根据营养物质可用性的变化来调节它的大小。一方面，这可以作为一种抗癌机制（例如，通过保持基因组稳定性）(31)在这种情况下，肿瘤发生会选择wtp53的缺失，这在许多癌症中确实存在。然而，另一方面，上述促生存效应可能会对某些癌细胞保留wt p53产生选择性压力。哪一种选择最终获胜，可能在很大程度上取决于特定肿瘤中额外的遗传和表观遗传事件的特定组合，以及在肿瘤发展过程中所面临的环境压力。
材料和方法
细胞培养、试剂和siRNA转染。
细胞培养生长和饥饿条件、试剂和转染详细信息列于SI材料和方法.
相对长度单位。
细胞生长在盖玻片上，并用0.3%戊二醛和0.3%多聚甲醛固定在二羧酸缓冲液（二羧酸盐0.1 m，pH 7.4）中。样品在1%OsO中染色40.3%重铬酸钾和0.3%亚铁氰化钾，并嵌入Epon中。通过TEM观察70–100 nm的截面（Technai-12；Phillips）。
蛋白质分析。
使用了以下商业抗体和试剂：抗LC3B（L7543；Sigma）；抗GAPDH（Chemicon）；抗PARP（SA-250；Biomol）、抗LAMP1（h4a3；发育研究杂交瘤库，衣阿华大学）、DAPI（Sigma）和LysoTracker Red（DND-99；分子探针）。对于Western blot分析，细胞在放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液（0.1 M NaCl，5 mM EDTA，0.1 M Na）中进行裂解2高性能操作4/NaH（氢化钠）2将PO4、pH 7.5、1%Triton、0.5%脱氧胆酸盐（DOC）、0.1%SDS和蛋白酶抑制剂）和40μg裂解液加载到SDS/PAGE。为了获得免疫荧光，将细胞固定在甲醇中，用丙酮渗透，与所示抗体孵育，并用蔡司LSM-510或蔡司LSM-710共焦显微镜观察。
RNA分析。
使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion）分离总RNA。cDNA和实时PCR按说明进行(37). 对于LC3B premRNA分析，在进行实时PCR之前，RNA在随机六聚体引物存在下与（RT）或不与（非RT）逆转录酶孵育。从RT值中减去非RT实时PCR值，以获得和图S3D类引物序列详见表S1.
FACS分析。
如前所述，对DNA含量进行FACS辅助细胞周期分析(37). 使用FITC-膜联蛋白-V凋亡检测试剂盒（Roche）对凋亡细胞进行分析。使用FACS分选机（Becton Dickinson）或LSR-II（BD Biosciences）流式细胞仪分析样本。LSR-II流式细胞仪的结果通过Matlab使用FCS数据读取器脚本进行分析。
