白藜芦醇通过抑制氧化/硝化应激改善2型糖尿病患者左室舒张舒张功能：磁共振成像的体内研究

体内电影MRI

对年龄匹配的患者进行无创MRI扫描m-Lepr公司^数据库和勒普^数据库使用配备38毫米和60毫米正交驱动鸟笼射频线圈的瓦里安7-T水平钻孔MRI（瓦里安，帕洛阿尔托，加利福尼亚州）仪器，对白藜芦醇进行或不进行4周治疗的小鼠进行治疗。使用小型动物监测系统（SA Instruments，Stony Brook，NY）进行心电图、呼吸监测和门控。热空气通过MRI孔循环，以保持动物的体温。使用4%异氟醚和1 l/min氧气完成麻醉诱导。监测呼吸频率，并用于手动校准异氟醚维持剂量（1.2–1.8%）。成像协议与之前发布的程序类似(42). 简单地说，ECG/呼吸门控梯度回波序列的层厚为1 mm，层厚为30×30 mm²长轴和短轴图像的视野。在R波后立即使用中室轴向图像上的图像J（NIH，Bethesda，MD）测量壁厚，平均每只小鼠3次测量。在长轴冠状图像上测定心室长度。LV质量（LVM）由舒张末期心外膜和心内膜面积从心尖到心底的差值之和乘以切片厚度（1 mm）和心肌密度（1.053 g/ml）得出(31). 左心室舒张末期容积（LVEDV）和左心室收缩末期容积（LVESV）分别计算为舒张末期和收缩末期从心尖到二尖瓣环平面的每个切片的心内膜面积之和。左心室射血分数（EF）计算如下：左心室射血分数=（LVEDV−LVESV）/LVEDV。卒中体积（SV）计算如下：SV=LVEDV−LVESV，心输出量（CO）计算公式如下：CO=SV×HR，其中HR为心率(44，46). 左心室容积-时间曲线绘制为一个心动周期内左心室容积与时间的关系。收缩峰射血率（PER）和舒张峰充盈率（PFR）分别定义为左室容积-时间曲线最小和最大导数的最大绝对值。使用VNMRJ（Varian）和图像J进行图像分析(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)、和段(http://segment.heiberg.se网站) (15)软件工具。

肿瘤坏死因子-α和NAD（P）H氧化酶亚单位gp91的mRNA表达^{凤凰（phox）}通过实时PCR

我们使用定量实时RT-PCR技术分析TNF-α和gp91的mRNA表达^{凤凰（phox）}先前报道的小鼠左心室心肌组织(45，48). 使用2计算数据^-ΔΔC_T型方法（其中C_T型是阈值周期），并表示为转录本的折叠变化勒普^数据库正常化为内部对照（β-actin）的小鼠与m-Lepr公司^数据库小鼠（定义为1.0倍）。

TNF-α、IκB-α、磷蛋白-IκB--α、NF-κB、gp91的蛋白表达^{凤凰（phox）}Western Blot分析法测定内皮型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合成酶和硝基酪氨酸

使用TNF-α、IκB-α和磷酸化IκBα一级抗体（Santa Cruz Biotechnology）、NF-κB、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和硝基酪氨酸（N-Tyr）一级抗体^{凤凰（phox）}初级抗体（BD-Science Pharmingen）。使用Fuji LAS3000对信号进行密度扫描，并使用Multigage软件（Fujifilm）进行量化。蛋白质表达的相对量被量化为相应的m-Lepr公司^数据库控件的值设置为1.0。

NAD（P）H氧化酶活性

如前所述，使用由荧光素（Sigma）衍生的化学发光分析法测定均质心脏组织提取物中的NAD（P）H氧化酶活性(11，49). 样品由Fluoroscan Ascent FL（Thermal Scientific）读取，NAD（P）H氧化酶活性标准化为m-Lepr公司^数据库控件。

免疫荧光染色

免疫组织化学用于gp91的鉴定和定位^{凤凰（phox）}血管或心肌组织切片中的蛋白质。福尔马林固定心脏在5μm处切片。gp91的一级抗体^荧光粉（BD Biosciences Pharmingen）、内皮细胞标志物von Willebrand因子（Abcam）、平滑肌标志物α-肌动蛋白（Abcam）或巨噬细胞标志物F4/80（Serotec）用于顺序双免疫荧光染色。二级荧光抗体为FITC或德克萨斯红结合。切片安装在防褪色剂中（含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚和Invitrogen的慢速金）。使用带×40物镜的荧光显微镜（蔡司Axioplan显微镜）观察并分析载玻片。

O的测量₂^·−使用电子顺磁共振光谱

O（运行）₂^·−如前所述，在心脏组织匀浆中测定电子顺磁共振（EPR）光谱的定量(48). 简言之，在含有0.01mmol/l EDTA的50mmol/l磷酸盐缓冲液中制备10%的组织匀浆。将含有2 mmol/l 1-羟基-3-羧基吡咯烷的上清液在37°C下培养30分钟，并在液氮中快速冷冻。根据从过氧化氢标准溶液中产生的阴离子的辣根过氧化物酶生成的标准曲线，通过峰的双重积分确定EPR光谱中的超氧化物定量，使用第页-乙酰氨基酚作为共基质，然后通过蛋白质浓度进行归一化。

亚硝酸盐/硝酸盐的测量

根据Zhang等人的报告，使用美洲计量传感器（世界精密仪器）评估心脏组织中的亚硝酸盐/硝酸盐水平(49). 简单地说，硝酸盐通过硝酸分析仪（世界精密仪器）转化为亚硝酸盐。2毫米传感器（ISO-NOP）检测到的电流（pA）代表左心室心肌组织溶解过程中亚硝酸盐的浓度。

白藜芦醇降低2型糖尿病患者TNF-α的蛋白和mRNA表达以及磷酸化IκB-α和NF-κB-p65的蛋白表达

TNF-α的蛋白和mRNA表达(图2)英寸勒普^数据库与m-Lepr公司^数据库老鼠。白藜芦醇抑制肿瘤坏死因子-α的表达勒普^数据库老鼠。IκB-α表达在勒普^数据库小鼠，而IκB-α磷酸化和NF-κB p65表达在勒普^数据库老鼠。白藜芦醇降低IκB-α磷酸化和NF-κB p65蛋白表达，但不影响总IκB-α表达(图3).

白藜芦醇增加2型糖尿病小鼠eNOS表达和亚硝酸盐/硝酸盐水平

糖尿病小鼠的心脏亚硝酸盐/硝酸盐水平降低，白藜芦醇增加了NO的产生(图4一个). 糖尿病小鼠eNOS蛋白表达下调。白藜芦醇增加eNOS表达(图4B类). eNOS的蛋白表达在数据库^TNF−/数据库^TNF−和勒普^数据库用NF-κB抑制剂MG-132（10 MG·kg⁻¹·天⁻¹ip，5天）与勒普^数据库小鼠，而m-Lepr公司^数据库TNF-α治疗小鼠（10μg·kg⁻¹·天⁻¹ip，3天，R&D）显示eNOS表达降低(图4B类).

白藜芦醇抑制NAD（P）H氧化酶活性和随后的O₂^·−2型糖尿病的产生

图5一个显示O₂^·−年产量显著增加勒普^数据库白藜芦醇降低O₂^·−生产勒普^数据库老鼠，但不在m-Lepr公司^数据库老鼠。NAD（P）H氧化酶抑制剂apocynin（20 mg·kg⁻¹·天⁻¹ip，3天）衰减O₂^·−生产勒普^数据库小鼠的水平与正常对照小鼠没有显著差异。NAD（P）H氧化酶活性在勒普^数据库老鼠比在m-Lepr公司^数据库老鼠(图5B类). 白藜芦醇显著降低勒普^数据库老鼠。此外，数据库^TNF−/数据库^TNF−和勒普^数据库NF-κB抑制剂MG-132治疗的小鼠NAD（P）H氧化酶活性降低，而m-Lepr公司^数据库用重组TNF-α治疗的小鼠表现出增强的NAD（P）H氧化酶活性。

白藜芦醇降低gp91蛋白和mRNA表达^{凤凰（phox）}2型糖尿病与gp91的细胞来源^{凤凰（phox）}

我们研究了NAD（P）H氧化酶亚基p22的表达^{凤凰（phox）}，gp91^{凤凰（phox）}和第67页^{凤凰（phox）}.图6，一个和B类，显示gp91的蛋白质和mRNA表达^荧光粉显著高于勒普^数据库老鼠。白藜芦醇降低gp91^{凤凰（phox）}蛋白和mRNA的表达勒普^数据库老鼠。相反，p22的蛋白表达^{凤凰（phox）}和第67页^荧光粉各组间无显著差异（数据未显示）。内皮细胞（血管性血友病因子）、血管平滑肌细胞（α-actin）或巨噬细胞（F4/80）以及gp91的标记物^{凤凰（phox）}建立表达gp91的细胞类型^{凤凰（phox）}建议gp91^{凤凰（phox）}定位于心脏组织的内皮细胞和巨噬细胞(图6C类).

白藜芦醇对2型糖尿病的心脏保护作用

白藜芦醇的心脏保护作用已在各种疾病模型中进行了研究。超声心动图分析表明，白藜芦醇降低了老年人的等容舒张时间，这是舒张功能的一个参数(三)和压力超负荷诱导的心肌肥大（主动脉结扎大鼠模型）(16). 在大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，在体左室插管显示，白藜芦醇预处理增加了左室最大收缩压和dP/dt吨_最大值心肌梗死面积减小(35). 使用体内MRI，我们证明白藜芦醇改善了2型糖尿病小鼠的心脏功能。结果表明，在16周大时，尽管男性的SV仅略有下降勒普^数据库小鼠，一氧化碳显著减少(表1和图1). PER和PFR在勒普^数据库小鼠，提示收缩和舒张功能早期受损。收缩功能障碍更可能取决于心肌细胞丢失和损伤的程度，这是收缩力降低、泵功能降低和EF的原因(10). 白藜芦醇在改善SV、CO或PER方面没有表现出显著的益处，但显著增加了PFR(表1和图1). 因此，我们认为白藜芦醇主要通过改善舒张功能在糖尿病心肌病中发挥有益作用。尽管白藜芦醇在高脂饮食喂养的小鼠和链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠中预防了饮食诱导的肥胖并减轻了胰岛素抵抗，但在勒普^数据库白藜芦醇不能改变小鼠体重或降低高胰岛素性高血糖(49). 因此，白藜芦醇的治疗效果，尤其是对心脏功能障碍的治疗效果也可以独立于体重减轻和高血糖状态。

此外，勒普^数据库与m-Lepr公司^数据库老鼠(表1). 这些结果与Panagia等人之前使用MRI对2型糖尿病小鼠心脏进行的研究一致(28). 虽然白藜芦醇改善了舒张功能，但通过两种药物对心脏的形态学改变，其效果均不显著m-Lepr公司^数据库和勒普^数据库老鼠。因此，通过补充白藜芦醇进行早期干预可能是预防或延缓糖尿病心肌病发病的一种有希望的方法。

白藜芦醇降低心脏TNF-α表达和NF-κB活化

白藜芦醇抑制LPS激活的脑巨噬细胞小胶质细胞产生TNF-α(4). 它还消除了吸烟诱导的大鼠颈动脉TNF-α上调(7). 我们证明，2型糖尿病小鼠心脏组织中TNF-αmRNA和蛋白表达升高，白藜芦醇抑制2型糖尿病患者TNF-(图2). 白藜芦醇的TNF-α抑制作用可能有助于其心脏保护作用，因为TNF-β已被证明是心力衰竭患者的预后标志物。依那西普是一种可溶性TNF-α受体拮抗剂，在安静诱导的心力衰竭犬模型中，在进行性LV功能障碍中减弱LV扩张并恢复EF(23). TNF-α拮抗剂在心力衰竭临床治疗中的作用存在争议。临床研究(20)在一项多中心、随机、安慰剂对照临床试验中，显示抗肿瘤坏死因子-α治疗对慢性心力衰竭患者缺乏益处。尽管有这些发现，仍需进一步研究，以确定个体化剂量的抗肿瘤坏死因子-α治疗是否会通过治疗早期心脏功能障碍患者而产生有益效果，然后才能得出任何最终结论(24).

白藜芦醇不仅抑制TNF-α的表达，还抑制NF-κB的活化。我们的研究表明，IκB-α的总表达在勒普^数据库小鼠，而IκB-α磷酸化和NF-κB p65表达升高(图3). 白藜芦醇抑制磷酸化IκB-α和NFκB p65的表达，但不影响细胞内总IκBα的表达勒普^数据库老鼠(图3). 这些结果表明，白藜芦醇通过阻止IκB-α的磷酸化来抑制NF-κB的活化，从而消除NF-κ的活化所诱导的下游信号传导。

白藜芦醇对NO生成和eNOS表达的影响

激动剂刺激冠状动脉内皮内eNOS释放NO对心肌细胞产生旁分泌作用，主要影响舒张时间和心肌O₂消耗(32). eNOS在心肌细胞内的自分泌作用可能包括调节基础肌力和舒张、β-肾上腺素能反应性以及力-频率关系(32). 电子NOS^−/−小鼠不仅高血压，而且收缩功能增强，舒张功能降低，但无左室肥厚(30). 此外，NOS抑制剂对基础NO生成的抑制N个^G公司-一甲基-我-精氨酸显著损害左心室舒张充盈(6). 这表明eNOS产生的NO有助于心肌舒张(29).

在压力过载诱导的心肌肥大大鼠模型中，eNOS和氧化还原因子-1的表达显著降低。白藜芦醇增加eNOS和氧化还原因子-1的表达，改善舒张松弛(16). 我们的结果表明，20 mg·kg剂量的白藜芦醇⁻¹·天⁻¹eNOS蛋白表达增加勒普^数据库老鼠(图4B类)与心肌亚硝酸盐/硝酸盐水平升高有关，这是NO生成的一个参数(图4一个). 此外，数据库^TNF−/数据库^TNF−和勒普^数据库用MG-132处理的小鼠表现出eNOS蛋白表达升高，而在m-Lepr公司^数据库重组TNF-α治疗小鼠(图4B类)表明白藜芦醇可能通过抑制TNF-α-NF-κB信号传导影响eNOS的表达。因此，白藜芦醇在改善糖尿病小鼠心脏充盈方面的益处可能通过增强eNOS衍生NO的生成来改善心肌病。

白藜芦醇对NAD（P）H氧化酶亚单位表达、NAD（P）H氧化酶激活和随后O₂^·−生产

eNOS产生的NO不能准确反映NO的可用性，因为ROS对NO的灭活被认为是NO生物利用度降低的关键机制(5). 之前的研究(36)提示左室舒张功能与氧化应激有关。因此，我们评估了糖尿病小鼠心脏组织中的氧化应激。尽管存在多种活性氧来源(13，14)在过去的十年中，已经表明ROS的主要心血管来源，特别是在血管系统中，来自NADPH氧化酶家族。

我们以前的研究(11，12)已经表明数据库^TNF−/数据库^TNF−和MG-132处理勒普^数据库小鼠冠状动脉NAD（P）H氧化酶活性降低。本研究表明，NAD（P）H氧化酶活性在心脏组织中升高勒普^数据库小鼠，而数据库^TNF−/数据库^TNF−和MG132-处理勒普^数据库小鼠NAD（P）H氧化酶活性改善(图5B） ●●●●。O（运行）₂^·−年产量提高勒普^数据库小鼠和NAD（P）H氧化酶抑制剂apocynin降低O₂^·−生产恢复到m-Lepr公司^数据库这表明NAD（P）H氧化酶可能是O的主要来源之一₂^·−糖尿病小鼠心脏组织的产生(图5一个). 白藜芦醇抑制NAD（P）H氧化酶活性和随后的O₂^·−可能通过抑制TNF-α诱导的NF-κB活化而产生。

经典的NADPH氧化酶复合物包括膜结合的细胞色素b558（由一个gp91组成^{凤凰（phox）}亚单位和一个p22^{凤凰（phox）}亚单位），形成酶的催化核心，以及四个细胞溶质调节亚单位（p47^荧光粉，第67页^荧光粉，第40页^{凤凰（phox）}和Rac）(19). 通用条款91^{凤凰（phox）}是自gp91缺失以来NAD（P）H氧化酶介导的氧化应激中最重要的亚单位之一^荧光粉严重抑制激活的O₂^·−生产(1). 我们确定gp91^{凤凰（phox）}糖尿病小鼠蛋白质和mRNA表达升高(图6，一个和B类)，而p22^{凤凰（phox）}和第67页^{凤凰（phox）}蛋白质表达在m-Lepr公司^数据库和勒普^数据库小鼠（数据未显示）。白藜芦醇大大降低gp91^{凤凰（phox）}mRNA和蛋白表达，表明白藜芦醇可能通过阻断NAD（P）H氧化酶亚基gp91而消除NAD（P）H氧化酶的激活^{凤凰（phox）}表达式。免疫荧光染色显示gp91^{凤凰（phox）}主要与心脏组织中的内皮细胞和巨噬细胞共存(图6C类). 因此，抗氧化作用可能有助于白藜芦醇通过舒张LV发挥心脏保护作用。

白藜芦醇对iNOS表达及后续硝化应激的影响

iNOS是由炎症细胞因子诱导的，与组成型NOS相比，iNOS产生的NO水平要高得多(43). 心肌细胞以及心肌内的许多其他实质细胞，包括冠状微血管内皮、心内膜和浸润性炎性细胞，都能够表达iNOS，以响应可溶性炎症介质(2). 最近的一项研究(43)表明iNOS产生的病理性NO浓度可能通过产生强大的硝化分子过氧亚硝酸盐（ONOO）而导致硝化应激和组织损伤⁻). 有条件靶向心肌表达人iNOS cDNA的转基因小鼠模型显示iNOS上调，导致ONOO的产生增加⁻这些小鼠很少出现明显的心力衰竭，但由于缓慢心律失常导致的心源性猝死发生率很高(25). 心肌再灌注损伤增加了iNOS的表达和随后产生的RNS（N-Tyr），这可以通过使用1400W（选择性iNOS抑制剂）或M-40401（ONOO）进行预处理来预防⁻清道夫(39). 因此，硝化应激和过氧亚硝酸盐在糖尿病心肌病的发病机制中起着至关重要的作用(26，27). 我们的研究表明iNOS在心脏组织中的表达增强勒普^数据库小鼠，同时存在过量O的N-酪氨酸表达升高₂^·−iNOS抑制剂1400W逆转了增加的N-酪氨酸表达，表明iNOS在糖尿病心肌细胞中增加RNS生成中的作用(图7一个). 因此，我们推测白藜芦醇降低心脏N-酪氨酸表达的作用可能部分解释为其在抑制iNOS表达中的作用(图7B类). 尽管与对照小鼠相比，糖尿病小鼠心脏组织中iNOS的表达增加，但对照小鼠和糖尿病小鼠主动脉中iNOS蛋白的表达没有差异（数据未显示）。此外，50-kDa N-酪氨酸蛋白在糖尿病小鼠心脏中的表达比对照小鼠高10倍以上，而在糖尿病小鼠主动脉中的表达仅是对照小鼠的3倍(49)支持2型糖尿病小鼠心脏组织中更显著的硝化应激的观点。

人肝（AKN-1）和人肺（A549）上皮细胞系中TNF-α诱导的iNOS基因表达都需要NF-κB的激活(40). 我们发现数据库^TNF−/数据库^TNF−和勒普^数据库MG-132治疗的小鼠表现出iNOS表达降低，而iNOS的表达在m-Lepr公司^数据库抗肿瘤坏死因子-α治疗小鼠与对照组m-Lepr公司^数据库老鼠(图7B类). 这些发现表明，TNF-α诱导的NF-κB活化可能上调糖尿病小鼠心脏组织中iNOS的表达。

白藜芦醇调节NO和O失衡₂^·−2型糖尿病

心脏内皮细胞和心肌细胞之间存在复杂的旁分泌相互作用。心脏内皮细胞释放（或代谢）几种扩散因子，这些扩散因子对心肌细胞功能产生直接影响，与冠脉流量的变化无关(33). 由于心脏微血管内皮细胞和心室肌细胞之间的扩散距离较短（<1μm），NO在旁分泌/自分泌途径中的作用是活跃的(38). 在病理情况下，由eNOS衍生的NO产生的NO的有益作用会因ROS的生成减少或失活增强而减弱。iNOS产生过量NO也会产生NO的有害影响，通常伴随着ROS和ONOO的同时产生⁻形成(33). 因此，NO和ROS生成之间的平衡是心血管系统病理生理状态的主要因素。

白藜芦醇抑制NAD（P）H氧化酶衍生的O₂^·−以及iNOS衍生NO，但刺激eNOS衍生的NO生成。这可以防止心脏氧化/硝化应激，并提高NO的可用性。因此，通过调节NO和ROS之间的失衡，白藜芦醇被认为可以有效改善糖尿病心脏的氧化/硝化应激和随后的组织损伤。

作者感谢阿什利·布朗（Ashley Brown）提供的技术援助以及哈里·杜鲁门纪念退伍军人医院退伍军人事务生物分子成像中心和密苏里大学（密苏里州哥伦比亚市）提供的MRI设备支持。