简言之，长RNA首先通过RNA片段或DNA片段转换为cDNA片段库（见正文）。测序适配器（蓝色）随后添加到每个cDNA片段中，并使用高通量测序技术从每个cDNA中获得短序列。由此产生的序列读取与参考基因组或转录组对齐，并分为三种类型：外显子读取、连接读取和聚（A）末端读取。这三种类型用于为每个基因生成碱基解析表达谱，如底部所示；显示了带有一个内含子的酵母ORF。
