外科研究杂志。作者手稿；PMC 2011年10月1日发布。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院204913
COX-2在塞来昔布耐药乳腺癌细胞系中的过度表达
，博士。，1 ，文学学士。，1 ，理学学士。，1和医学博士。1,2
巴尔拉吉·辛格
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
拉塔西亚·欧文
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
凯伦·泰
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
安东尼·卢奇
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心外科肿瘤学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030。
2收件人：美国德克萨斯州休斯顿市霍尔科姆大道1515号德克萨斯大学安德森癌症中心444单元外科肿瘤科，邮编：77030，电话：713-563-1871；传真：713-792-4689；gro.nosrednadm@iccula公司 摘要
背景
环氧合酶-2（COX-2）在乳腺癌的进展和转移中起着关键作用。COX-2的有效靶向治疗需要了解肿瘤是否对COX-2上瘾，以及我们是否可以对抗抗COX-2治疗的潜在耐药性。在此，我们测试了塞来昔布耐药涉及选择过度表达COX-2的癌细胞的假设。
材料和方法
我们通过在塞来昔布存在下进行培养，从两种转移细胞系SUM149炎症性乳腺癌（IBC）细胞系和MDA-MB-231-BSC60细胞系中选择塞来昔伯耐药（CER）变体。我们通过western blotting测量了双亲细胞系及其CER变体中COX-2蛋白及其网络成分Bcl-2、Bcl-xL和Bax的相对水平。为了确定塞来昔布耐药是否会增加致瘤性，我们进行了在体外克隆原性测定。我们使用两样本t检验来确定各组之间差异的统计学显著性。
结果
塞来昔布耐药细胞株SUM149-CER和BSC60-CER产生的COX-2蛋白水平均显著高于其亲本（p<0.05）。CER变体导致促凋亡蛋白Bax（两种细胞系）水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2（BSC60）或Bcl-xL（SUM149）水平升高。重要的是，CER变体的克隆形成性显著高于其亲本细胞系（p<0.05）。在SUM149-CER细胞系中，siRNA-介导的COX-2敲除导致克隆原性以及Bcl-xL和Bcl-2蛋白水平显著降低，从而支持我们的假设。
结论
乳腺癌细胞系中存在的塞来昔布耐药变异细胞过度表达COX-2，这与生存途径和克隆原性密切相关。由于COX-2在侵袭性的变异癌细胞中很重要，因此它是一个很好的治疗靶点。
关键词：乳腺癌、炎性乳腺癌、肿瘤异质性、COX-2、转移、凋亡、靶向治疗、治疗耐药
简介
环氧合酶-2（COX-2）是炎症介质，在癌前和恶性乳腺上皮细胞中表达，在乳腺癌的进展和转移中起关键作用[1,2]. COX-2阻断对癌症预防和治疗都有效[在三]. 回顾性流行病学研究表明，使用特异性和非特异性COX-2抑制剂与降低乳腺癌发病率之间存在相关性。例如，一项病例对照研究表明，暴露于选择性COX-2抑制剂塞来昔布或罗非昔布可显著降低（71%）乳腺癌风险，突显出其在乳腺癌化学预防方面的巨大潜力[4]. 最近进行的一项广泛的荟萃分析（涉及38项研究）支持非甾体抗炎药（NSAID）的使用与乳腺癌风险之间存在负相关[5].
COX-2的过度表达诱导癌前乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞的基因组不稳定[6,7]. 其他研究表明，COX-2促进导管原位癌向浸润性乳腺癌的进展[8]COX-2基因是肺和脑转移的基因表达特征的一部分[9,10]. 我们研究了COX-2蛋白在乳腺癌骨转移中的作用，骨转移是乳腺癌的主要转移部位。在临床前小鼠模型中，我们发现COX-2通过产生前列腺素E，在乳腺癌向骨转移中发挥积极作用2（PGE2)白介素-8（IL-8）、白介素-11（IL-11）和尿激酶纤溶酶原激活剂（uPA）[11–14]. 此外，COX-2在乳腺癌Ⅰ至Ⅲ期的表达与骨髓中存在播散性肿瘤细胞（DTC）相关[15]是临床转移的独立预测因子[16]. 有趣的是，我们还检测到乳腺癌患者骨髓中单独DTC中的COX-2蛋白，进一步支持COX-2在骨髓微转移（BMM）中的作用[15].
COX-2在炎症性乳腺癌（IBC）中高度表达，IBC是乳腺癌的一个侵袭性亚群[17]. 我们对IBC特别感兴趣，因为迫切需要针对这种疾病的有效治疗。对非IBC和IBC中60个NF-κB靶点的分析表明，COX-2可能是IBC的驱动因素，这表明COX-2是除原发肿瘤外，在转移瘤中也表达的仅有的两个基因之一（另一个是CXCL1）[17]. COX-2的有效靶向治疗需要了解肿瘤是否对COX-2上瘾，以及是否可以对抗抗COX-2治疗的潜在耐药性。对塞来昔布耐药机制的更清楚了解应确定COX-2抑制的新模型，作为IBC和其他过度表达COX-2的侵袭性乳腺癌的治疗方法。
材料和方法
细胞系和培养
SUM149炎性乳腺癌细胞系最初取自Stephen Ethier博士（Barbara Ann Karmanos cancer Institute，Detroit，MI，USA），在添加了5%胎牛血清（FBS）、5µg/ml胰岛素、1µg/ml氢化可的松、100 U/ml青霉素、，和100µg/ml链霉素，在湿润的5%CO中2大气。MDA-MB-231-BSC60（缩写为BSC60）细胞系，是MDA-MB231的一种转移性变体，通过心脏心室接种在雌性裸鼠体内两代后，从骨转移细胞培养中分离出来[12,14]在添加10%FBS的RPMI 1640培养基中生长。
塞来昔布耐药变异株的筛选和培养
在对SUM149细胞（第16代）进行胰蛋白酶化和电镀后不久，我们将塞来昔布（最终浓度为10µM；LKT Laboratories，Inc.，St.Paul，MN）添加到培养基中。用含有塞来昔布的新培养基更换培养基两次，以去除死的漂浮细胞。15天后，我们通过胰蛋白酶化将存活细胞的菌落聚集在一起，并将其置于含有20µM塞来昔布的培养基中16天，然后将其置于10µM塞来昔布培养基中11天。在用塞来昔布进行3轮筛选后，这些变体被认为是塞来昔布耐药性的（命名为SUM149-CER第0代），除非另有规定，否则将其保存在10µM塞来昔伯的存在下。所有实验均在塞来昔布初始筛选后6代内进行。
通过5轮塞来昔布筛选，建立了MDA231-BSC60-CER变体。用20µM处理BSC60细胞（第16代）17天，40µM治疗14天，3代用10µM分别治疗10、11和10天。选择后，这些细胞被认为是塞来昔布耐药细胞，命名为BSC60-CER第0代，除非另有规定，否则在存在10µM塞来昔布时保持。所有实验均在最初选择塞来昔布后的11代内进行。
西方免疫印迹法
如前所述，通过western blot分析检测COX-2蛋白的表达[6]. 含有等量蛋白质的样品在8%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离，并转移到0.45-µm硝化纤维素膜上。使用单克隆抗体（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）和ECL Advance western blot检测试剂（Amersham Biosciences）检测COX-2蛋白。为了通过western blotting分析Bcl-2、Bcl-xL和Bax蛋白，将其溶解在12%的凝胶上，转移到0.2-µm硝化纤维素膜上，并用单克隆抗体检测（均来自马萨诸塞州丹佛市的Cell Signaling Technology）。通过在0.5%Triton X-100中培养膜来剥离过滤器，并使用单克隆β-肌动蛋白抗体（密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）进行再感染，作为凝胶负载对照。我们每个蛋白印迹至少进行3次。我们通过ImageJ图像处理程序（美国国立卫生研究院）量化了X射线胶片上的COX-2、Bcl-2、Bcl-xL、Bax和β-actin蛋白带。
克隆原性测定
为了确定癌细胞的致瘤潜能，我们进行了如上所述的克隆原性测定[7]进行了一些修改。将SUM149和SUM149-CER亚流培养物与胰蛋白酶-EDTA分离，并在添加0.5%胎牛血清、0.5µg/ml胰岛素和0.1µg/ml氢化可的松的Ham’s F-12培养基中以7500个细胞/10 cm培养皿培养。这些细胞生长25天，然后在0.1%结晶紫（w/v）和6%戊二醛固定剂（v/v）水溶液中染色15–30分钟[18]. 将平板在水中漂洗5-10次，直到漂洗液中检测不到更多染料。在空气干燥菌落后，我们使用配备Quantity One版本4.6.1软件的Bio-Read Gel文档系统XR对菌落进行计数，并用数码相机拍摄。
我们用上述BSC60和BSC60-CER细胞进行了克隆原性分析，但在含有10%FBS的RPMI 1640全培养基中（7500个细胞/10 cm平板培养，13天后菌落染色）。在涉及低血清的第二次试验中，将细胞以30000个细胞/10 cm培养皿接种在添加3%FBS的RPMI 1640培养基中，15天后对菌落进行染色。
用siRNA敲除COX-2
我们在SUM149-CER细胞系中使用COX-2特异性消音器选择siRNAs11472和s11473，然后消音器选择阴性对照#1 siRNA（全部来自加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。在融合培养皿上用胰蛋白酶分解细胞后不久，我们在10 cm培养皿中转染了120000个细胞，这些细胞被镀在15 ml低血清培养基中（见克隆原性分析），培养皿中含有20 nM siRNA（最终浓度），这些siRNA是用30µL siPORT NeoFX转染剂（Applied Biosystems）预先培养的按照制造商的说明，在1.2 ml OPTI-MEM无血清培养基中（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）。15天后，菌落被结晶紫染色。为了在siRNA转染后对COX-2和其他蛋白进行western blot分析，如上所述转染240000 SUM149-CER细胞，并进行克隆原性分析。我们在转染后16天制备细胞裂解物，并对其进行蛋白质印迹分析。
统计分析
我们使用双样本t检验对western blots和克隆原性分析进行了统计分析。对于western blots，我们通过除以β-肌动蛋白信号使相对蛋白质水平标准化。我们使用三个机器人的标准化值来确定平均±标准偏差，并确定p值。P（P）≤0.05被认为是显著的。
结果
塞来昔布耐药变异株的选择
为了了解塞来昔布抑制COX-2时乳腺癌对治疗的耐药性如何发展，我们选择了两种合适的细胞株模型：1）SUM149 IBC细胞株，因为COX-2在IBC中占主导地位；2）BSC60转移性MDA-MB-231变异体，具有功能性COX-2网络[11–14]. 我们按照材料和方法中的描述用塞来昔布处理这两种细胞系，并选择存活的变体，这些变体能够生长并产生在10µM塞来昔卜存在下持续生长的稳定细胞系。我们注意到的一个显著的形态学差异是BSC60-CER和BSC60之间的差异；当细胞生长到汇合点时，CER变体的细胞密度显著高于亲本细胞（比较). 这种差异是由于BSC60细胞停止分裂的细胞密度低于BSC60-CER。如果融合后长时间留在培养皿中，亲本BSC60将从培养皿中脱落，而CER变体继续相互堆积，从而达到更高的细胞密度。例如，培养17天后，BSC60-CER中每10 cm培养皿的平均细胞数是BSC60的两倍以上（分别为570万个细胞和230万个细胞）。
细胞形态。BSC60（第9代）和BSC60-CER（第7代）培养物允许在合流处生长17天，并在尼康显微镜下进行检查。这两种文化的代表性图像都是用数码相机以100倍放大率拍摄的。CER变体的细胞密度显著高于亲本细胞系，这一点通过第18天的细胞计数得到证实（分别为570万个细胞/10厘米培养皿和230万个细胞/10厘米培养皿）。
CER变体中COX-2蛋白水平增加
为了研究塞来昔布耐药的机制，我们首先分析了塞来昔布靶点COX-2。耐药的一个明显机制是CER变体过度表达COX-2，从而逃避塞来昔布的细胞毒性作用。我们过去对塞来昔布的剂量依赖性抑制研究表明，COX-2蛋白的一小部分具有耐药性（B Singh和a Lucci，未发表数据）；因此，与亲代细胞系相比，过表达COX-2的CER变体可能含有更高的塞来昔布耐药COX-2的总库。为了验证我们的预测，我们通过western blotting比较了CER变体及其亲代细胞系中COX-2蛋白的水平。SUM149-CER和BSC60-CER产生的COX-2蛋白水平显著高于其亲本对应物(和). 尽管SUM149细胞系COX-2表达的基础水平高于BSC60，但BSC60-CER的相对增加量高于SUM149-CER（2.9倍，0.4494±0.0344，0.1566±0.0246，p<0.05）与他们的亲代细胞系相比。
SUM149-CER变异体中COX-2增加，Bcl-xL增加，Bax水平降低。按照材料和方法中的描述，在正常生长条件下从两种细胞系制备的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。显示了Bcl-2印迹的两次曝光-与BSC60的Bcl-2印迹相同的曝光（上面板）()以及更长的曝光时间，以观察微弱的Bcl-2波段（下面板）。SUM149，第24段；SUM149-CER，第6段。
BSC60-CER变体中COX-2增加，Bcl-2增加，Bax水平降低。根据材料和方法中的描述，对从两种细胞系制备的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析。A.正常血清（10%FBS）中生长的早期传代细胞。BSC60，通道24；BSC60-CER，第4段。B.在正常血清中培养早期传代细胞（与A中的细胞相同），直到达到亚融合状态，然后将其转移到低血清（0.5%FBS）中24小时，然后制备细胞裂解液用于免疫印迹。C.正常血清（10%FBS）中生长的晚期传代细胞。BSC60，通道13；BSC60-CER，第11段。
CER变体中生存信号增加的证据
除了支持我们关于塞来昔布耐药机制的假设外，我们的CER变体还可能提供一个机会来研究在侵袭性和转移性疾病中起作用的COX-2网络。在这方面，我们重点研究了一些已知的抗细胞凋亡/凋亡机制的成员，这些成员似乎与乳腺癌中的COX-2有关，即Bcl-2、Bcl-xL和Bax[19]. 这种联系基于MMTV-LTR-COX-2转基因小鼠肿瘤和COX-2转染MCF7乳腺癌细胞系的发现[7]. 我们选择分析这些蛋白质的另一个原因是，众所周知，它们与抗癌治疗的泛耐药有关[20].
我们通过western blot分析发现，与SUM149相比，SUM149-CER中抗凋亡蛋白Bcl-xL的水平增加（代表性blot中增加2.2倍），促凋亡蛋白Bax的水平降低（代表性blot中减少45%）(). Bcl-2蛋白在SUM149细胞系中产生的水平相对较低，在CER变体中没有显著变化(). 与BSC60相比，BSC60-CER中的Bcl-2抗凋亡蛋白水平增加（典型印迹中增加63%），Bax蛋白水平降低（典型印痕中减少71%）(). Bcl-xL蛋白在BSC60和BSC60-CER中的产生水平相当。总的来说，这些结果表明，CER变异体中产生的COX-2蛋白水平的增加具有功能性，并与生存网络的组成部分相联系，这与生存增加一致。
值得注意的是，BSC60-CER中Bcl-2蛋白增加。与亲代细胞系相比，在含有10%FBS的正常生长培养基中没有观察到这种增加，但在将细胞转移到低血清培养基中24小时后观察到了这种增加(). 这一结果表明，在这些生长条件下，血清介导的信号可能掩盖COX-2特异性信号。另一个重要问题与BSC60-CER中Bax蛋白的减少有关。在早期传代（第4代）中未观察到Bax蛋白的减少，尽管COX-2蛋白水平在此阶段较高(); 然而，在后期（第11段；). 对这一结果的简单解释是，COX-2的持续表达可能会引发一些表观遗传学改变，这些改变是随后Bax减少的原因。或者，COX-2过表达可能在早期传代期间触发某些亚群的促凋亡效应，从而导致Bax在此阶段增加，这将掩盖真正稳定的CER变体的减少。
CER变异体中COX-2蛋白过表达的稳定性
在临床环境中一个重要的问题是，塞来昔布未加入培养基后，CER变体中观察到的COX-2表达增加是否持续存在。有趣的是，我们观察到8天内缺乏塞来昔布不会导致SUM149-CER中COX-2蛋白水平的任何显著降低(). 相反，BSC60-CER细胞中COX-2的过度表达高度依赖于塞来昔布的持续存在，因为塞来昔布停药5天会导致COX-2蛋白水平的急剧下降(). 细胞系之间这种差异的一个原因可能是细胞系所能耐受的最大COX-2量的差异。
塞来昔布退出BSC60-CER后COX-2蛋白水平下降。A.第11代的BSC60-CER细胞系与10µM塞来昔布平行培养一代（5天），然后制备细胞裂解物进行western blot。B.第6代的SUM149-CER细胞系与10µM塞来昔布平行培养一代（8天），然后制备细胞裂解物进行western blot。
CER变体的克隆原性增加
接下来，我们研究了COX-2蛋白的增加以及相关的Bcl-2/Bcl-xL的增加和Bax的减少是否会转化为CER变体的克隆原性增加。这个结果在体外检测通常与致瘤性相关体内并且对抗癌治疗具有泛耐药。我们在低血清条件下进行了这些测定，以增加观察到CER变体中生存途径改变的影响的可能性，并将血清介导的影响降至最低。我们观察到，与亲本相比，SUM149-CER和BSC60-CER的克隆原性显著增加(). 作为一个技术问题，尽管两种细胞株都产生了类似的结果，但该分析更适合于SUM149-CER，而不是BSC60-CER。BSC60-CER在本试验中需要高浓度的FBS（最低3%），因此，血清介导的信号传递的影响并不像SUM149-CER（仅需要0.5%的FBS）那样最小化。
CER变异体的克隆原性比其亲本细胞系增加。我们在材料和方法中描述的低FBS培养基中进行了检测。平板的比较表明，CER变体比亲本细胞系更具克隆形成性，并且2）CER变体在本试验中被塞来昔布抑制。通道编号：SUM149，24；SUM149-CER，4；英国标准60，9；英国标准60-CER，7。
COX-2击倒的影响
如果COX-2水平的增加导致CER变异体中生存信号的增加，则COX-2的特异性敲除应逆转这种效应。为了验证这一点，我们进行了siRNA转染实验以击倒COX-2。我们用两种不同的COX-2特异性siRNA进行了这些实验(消音器从加利福尼亚州福斯特市的Applied Biosystems中选择siRNAs s11472和s11473）。s11473 siRNA对COX-2的抑制作用优于s11472（数据未显示）。中显示的数据结果表明，s11473 siRNA特异性地击倒了COX-2（在代表性印迹中，与转染阴性对照siRNA的SUM19-CER细胞相比，基于β-肌动蛋白水平的标准化COX-2数量减少了69%）Bcl-xL和Bcl-2蛋白水平也相应下降（在典型的印迹中，基于β-肌动蛋白水平的标准化量分别下降了40%和69%）(). 重要的是，COX-2敲除导致SUM149-CER细胞系的克隆原性显著降低(). 与阴性对照siRNA转染细胞相比，COX-2 siRNA-转染细胞中的克隆数减少（在代表性实验中，每10 cm培养皿中的克隆数量从301个减少到70个，减少了76%），克隆形成性降低。在正常生长条件下（在含有5%FBS的培养基中；数据未显示），转染COX-2特异性siRNA也会导致COX-2敲除。我们选择了先前建立的克隆原性检测条件，包括在低FBS培养基上生长，以最小化FBS的影响。
COX-2敲除对SUM19-CER细胞系存活信号和克隆形成的抑制。A.第6代的SUM149-CER细胞系转染阴性对照siRNA或COX-2特异性siRNA，并进行材料和方法中所述的western blot分析。B.我们对转染了阴性对照siRNA或COX-2特异性siRNA的SUM149-CER细胞进行了克隆形成性分析，并与a组所示的western blotting实验并行。显示了两个实验中获得的典型western blotting和克隆形成性测试结果。
塞来昔布联合化疗药物抑制CER变异
从翻译的角度来看，重要的问题是如何处理塞来昔布耐药问题。似乎合乎逻辑的是，这个问题可能更容易尽早解决，也就是说，在治疗早期将塞来昔布治疗作为一种联合治疗，以最大限度地减少CER变异的扩大。我们的结果表明，由于COX-2（网络）在CER变异体中具有高度功能，因此塞来昔布与其他治疗（如化疗）联合使用可能对其有益。在这方面，塞来昔布与紫杉醇或阿霉素联合使用在抑制CER变体克隆形成性方面比单独使用这两种化疗药物更有效(). 我们还注意到，尽管SUM149-CER细胞在含有5%FBS的培养基中对塞来昔布的生长具有耐药性，但塞来昔布可在含有0.5%FBS的细胞克隆原性试验中显著抑制其生长(). 我们用BSC60-CER获得了类似的结果，即塞来昔布在低FBS下进行的克隆原性测定中抑制了它们(). 然而，与在SUM149-CER中观察到的情况相比，BSC60-CER中的这种抑制作用不太明显，这可能部分是因为FBS的混杂效应，因为在使用BSC60进行克隆形成性分析时，技术上不可能将FBS浓度降低到3%以下。在FBS浓度低于3%的情况下，BSC60细胞无法存活。
联合治疗对CER变异体克隆形成性的抑制作用。我们在第1天添加塞来昔布（10µM）或二甲基亚砜溶剂（作为对照）以及不同浓度的阿霉素或紫杉醇（紫杉醇）。A和B，SUM149-CER细胞（第5代）以每10 cm培养皿7500个细胞的速度在低FBS（0.5%）培养基中培养，如材料和方法所述，并在第25天染色。将C和D、BSC60-CER细胞（第4代）以每10 cm培养皿7500个细胞的速度在含有正常量FBS（10%）的培养基中培养，并在第13天进行染色。平板对比显示：1）塞来昔布在本试验中抑制CER变体，2）塞来昔布与化疗药物协同抑制克隆形成性。
讨论
异质性疾病背景下的COX-2
癌症是一种多层次的异质性疾病，包括肿瘤细胞群水平的异质性，这一发现也见于乳腺癌细胞系。因此，当应用任何治疗（靶向治疗、化疗或放射治疗）时，目标细胞群的一些预先存在的变体对治疗无效。这似乎是临床上经常遇到的“泛耐药”的主要原因，尽管治疗本身可能会改变目标细胞群从而导致耐药。
从本研究的角度来看，在给定的乳腺癌细胞系中，细胞在COX-2表达方面是异质的，COX-2可能通过其在肿瘤干样表型中的作用而导致异质性[21]. 由于COX-2参与乳腺癌转移，并且有相对安全的COX-2抑制剂，因此我们决定在临床上研究COX-2靶向治疗的潜在耐药机制。为了增加转化的可能性，我们为本研究选择了已被选择用于转移且具有强大COX-2网络的细胞系。建立在这种细胞系上的实验模型将是评估有希望的新疗法的理想选择。
除了进一步了解塞来昔布耐药的机制外，CER变异体在评估新的新疗法方面可能也很有价值，因为它们在侵袭性疾病致病能力的相关背景下提高了功能性COX-2（以及控制细胞存活的相关网络）的水平。这一点很重要，因为COX-2网络可能具有非常不同的功能输出，这取决于细胞背景，从生长停滞到细胞存活和细胞增殖[例如，参见参考文献13,22]. 我们的CER变异体及其亲本细胞系代表了研究COX-2信号传导及其治疗靶向的合适的等基因对。作为一个重要的概念点，我们认为COX-2是网络的一个组成部分，其中网络的各个组成部分表现出特定的上下文依赖关系，例如，在乳腺癌晚期与NF-κB通路的合作以及与p53信号的拮抗[22]. 这些网络而不是线性信号更好地解释了COX-2在癌症中的作用。
在COX-2发挥作用的大多数癌症模型中，包括乳腺癌小鼠模型，COX-2抑制导致肿瘤进展的部分抑制[例如，参见14,23,24]. 与我们的研究结果类似，最近对小鼠乳腺癌模型的两项研究，包括C3（1）-SV40肿瘤抗原转基因小鼠和BALB/c和COX-2基因敲除小鼠乳腺脂肪垫中的4T1异种移植物，提供了证据表明，COX-2特异性抑制剂的逃逸涉及肿瘤细胞中COX-2的过度表达[23,24]. 与我们研究中CER变异体的起源有关，也可能与在小鼠模型中驱动COX-2抑制逃逸的类似变异体有关[23,24]，我们倾向于在塞来昔布治疗之前，变异体和/或其前体就已经存在的模型。细胞系内COX-2蛋白水平存在显著的细胞异质性[21]. 高水平的COX-2蛋白可能通过多种机制导致细胞异质性，包括基因组不稳定性[6,7]. 具有高水平COX-2蛋白的细胞也可能具有强大的促生存网络[19，本研究]。此外，COX-2击倒后获得的结果()支持高水平COX-2蛋白与SUM149-CER细胞系中的抗凋亡装置有关的解释。这种细胞可以在抗COX-2治疗和其他治疗中存活，特别是如果一次应用一种。
IBC与非IBC中的COX-2信号
为了简要讨论IBC和非IBC细胞系对塞来昔布反应的异同，两种细胞系的反应方式基本相似，但存在一些差异。这两种细胞株都产生具有高COX-2蛋白水平的CER变体；然而，与BSC60-CER细胞系相比，塞来昔布停药后SUM149-CER细胞系中COX-2蛋白水平的升高更稳定(). 细胞系之间这种差异的一个原因可能是细胞系所能耐受的最大COX-2量的差异。我们对促凋亡和抗凋亡蛋白的有限分析表明，COX-2在这两种背景下都与增强的促生存信号有关。鉴于IBC基因表达特征与侵袭性非IBC基因表现特征相似，这并不奇怪[25]. CER变异体之间的差异在于Bcl-2家族的特定成员；BSC60-CER的Bcl-2水平升高，而SUM149-CER的Bcl-xL水平升高(和).
两种CER变体的促凋亡蛋白Bax均减少；与BSC60-CER相比，SUM149-CER的这种下降（早期传代）更快，后者可能取决于这种背景下COX-2高表达所迫使的“进化”(). 对这一结果的一个简单解释是，COX-2的持续表达可能触发一些表观遗传改变，这些改变导致随后的Bax减少。或者，COX-2过表达可能在早期传代期间触发某些亚群中的促凋亡效应，从而导致Bax在此阶段增加，这将掩盖真正稳定的CER变体的减少。值得注意的是，MMTV-LTR-COX-2转基因驱动的乳腺肿瘤在我们的研究中观察到BSC60-CER变体中Bcl-2升高而Bax降低[19]. 然而，转基因小鼠肿瘤中Bcl-xL水平降低，而SUM149-CER水平升高。这种差异的解释可能在于癌细胞特定亚群的表观遗传学。最后，我们注意到BSC60-CER变体在培养皿上的细胞密度显著高于亲本细胞。CER变体的这种特性可能表明其相对攻击性。
侵袭性乳腺癌患者的COX-2成瘾
有几个理由继续我们目前的研究。关键问题是表达COX-2蛋白的乳腺癌细胞是否对其上瘾。这个问题的答案可能会产生不同的结果，这取决于COX-2网络的性质，这种网络可能受到乳腺癌细胞特定亚群内遗传和表观遗传变化的影响。因此，我们认为在重要的疾病背景下分析这一问题很重要，例如，选择转移的人类乳腺癌细胞系（BSC60）和人类炎性乳腺癌细胞株（SUM149）。先前引用的研究是用转基因小鼠模型和异种移植物模型在接种了小鼠来源的乳腺癌细胞系的小鼠中进行的。此外，与我们分析COX-2蛋白的研究不同，COX-2蛋白质在任何这些研究中都没有进行分析；这是根据COX-2 RNA的变化推断出来的[23]或前列腺素F1α的循环水平[24]. 因此，我们的研究对解决COX-2成瘾这一重要问题作出了重大贡献，并表明COX-2上瘾可能是侵袭性疾病背景下的一种普遍现象。
我们最近发现，细胞系中存在的细胞亚群过度表达COX-2，并且它们对低浓度塞来昔布具有相对抗性[21]. 重要的是，COX-2高的变异体的行为类似于产生COX-2的癌症干细胞低的单元格[21]. 为了解释这里的数据，我们提出塞来昔布耐药（CER）变异体代表原有COX-2的扩张高的变异，而大多数细胞被塞来昔布杀死。另一种并非相互排斥的可能性是，癌细胞依赖COX-2活性生存，它们必须通过过度生产COX-2蛋白来应对塞来昔布对COX-2酶活性的抑制。重要的一点是，只要癌细胞“依赖”COX-2生存，它就是一个治疗靶点。我们面临的最重要的问题是如何杀死CER变体。
我们的数据在这方面信息丰富。首先，我们发现在含有5%血清的完全培养基中选择的塞来昔布耐药性变体在低血清（0.5%）下进行的克隆原性测定中被塞来昔布显著抑制，这表明耐药性涉及与血清介导的信号传导的协同作用。更重要的是，我们还展示了塞来昔布与化疗药物阿霉素和紫杉醇之间的合作。与BSC60-CER相比，SUM149-CER（在本试验中，其耐受的存活血清水平低于BSC60-CER）可以更清楚地证明这些结果(). 其他一些研究也提供了塞来昔布与化疗药物之间合作的证据[例如。，26–28]. 我们目前正在寻求几种方法，以确定克服塞来昔布耐药性的其他靶向治疗方法。
致谢
这些研究部分得到了美国国立卫生研究院R21 DK067682（AL）和CA16672（Core）拨款的支持，美国陆军医学研究与材料司令部（AL，M.D.Anderson癌症中心的Morgan Welch炎症性乳腺癌多学科研究项目，以及外科肿瘤学会（AL）颁发的临床研究员奖。
脚注
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