腺相关病毒（AAV）血清型9在小鼠和大鼠体内提供优于AAV1、AAV6、AAV7和AAV8的全局心脏基因转移

摘要

介绍

A类非相关病毒AAV是一种理想的基因治疗载体，因为其低免疫原性有利于持续的转基因表达。心脏注射AAV引起的免疫反应可以忽略不计，并且在用生理盐水或裸质粒治疗后的基线反应中没有显著升高（Wright等。,2001). 这与其他病毒载体引发的深刻免疫反应形成了鲜明对比，如腺病毒、疱疹病毒，以及在某种程度上的慢病毒（Wright等。,2001; 万德莱斯等。,2007). 因此，AAV载体能够在动物模型中向包括肝脏、骨骼肌和心脏在内的多个器官提供安全、长期的基因转移（高等。,2002; 阿鲁达等。,2005; 求爱等。,2005).

AAV特别适合作为心脏病的基因治疗载体，心脏病通常遵循慢性病程，因此需要安全、持续的转基因表达。事实上，已经提出了一项使用AAV1将SERCA2a基因传递给充血性心力衰竭（CHF）患者的1/2期临床试验（Hajjar等。,2008)，其他人肯定会效仿。然而，还有许多其他基因可能在CHF中表现出临床益处，还有一些其他新型AAV血清型可能比AAV1更有效地转导心脏（高等。,2002,2004).

啮齿动物模型提供了一个相对快速和廉价的系统，在进入大型动物和临床试验之前，可以在其中筛选和评估此类基因和血清型的治疗潜力。关于血清型，文献中对AAV2病毒进行了初步研究，因为这是第一个被设计成载体的血清型（Carter，2004). 然而，一旦分离出额外的血清型（高等。,2002,2004)，假型载体很快投入生产（希尔丁格等。,2001)并评估不同组织取向性。在小鼠中，AAV1–AAV5的初始筛查确定AAV1为最嗜心血清型（Du等。,2004)但后来，包括AAV6–AAV9在内的更全面的研究都一致认为，AAV9是小鼠心脏最具向心性的血清型等。,2006; 帕察克等。,2006; 万德莱斯等。,2007; 津卡雷利等。,2008). 然而，尽管这些研究能够确定用于心脏基因转移的最有效的AAV血清型，但没有一项研究将高效基因转移与限制全身暴露的传递方法相结合。在大鼠中，AAV8被确定为心脏基因转移最有效的血清型（Palomeque等。,2007)但本研究仅评估了AAV1–AAV8。事实上，尚未在大鼠心脏中对AAV9与其他血清型进行直接比较。

我们在这项研究中的目标是比较AAV1的向心性，AAV1很快将用于心力衰竭的临床试验（Hajjar等。,2008)与小鼠和大鼠中新的AAV血清型6、7、8和9相同。为了扩展现有的小鼠文献，我们通过剑突下注射技术将病毒靶向心包空间，以限制全身暴露（Zhang等。,1999). 在大鼠体内，这是AAV9与心脏内其他AAV血清型的首次直接比较。在这两个物种中，我们试图最大限度地提高转基因表达，并进行了剂量反应研究，以确定全球递送所需的最小剂量。对小鼠进行长达1年的监测，以评估表达的稳定性，对大鼠进行血流动力学和生物分布分析，以确定AAV介导的心脏基因转移的安全性。

材料和方法

结果

用AAV血清型评价小鼠心脏基因转移

对AAV血清型1、6、7、8和9进行评估，以确定其向小鼠心脏提供基因转移的能力。新生小鼠（第4-5天）经心包腔注射2.5×10¹¹AAV CB LacZ的基因组拷贝（GC），并在6周时杀死以通过X-Gal染色分析转基因表达。所有血清型都能在这种剂量的载体上提供高效的心脏基因全局转移(图1). AAV8和AAV9在转换隔膜方面也很有效(图1). 所有检测血清型在肝脏中的表达均较低(图1).

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图1。

心包内注射含有2.5×10的50μl后6周，小鼠心脏、膈肌和肝脏切片的代表性显微照片¹¹所示血清型AAV-CB-LacZ的GC。切片已用X-Gal染色，并用曙红复染。比例尺：心脏为1 mm，肝脏和隔膜为200μm。

AAV血清型在小鼠心脏的剂量反应

由于所有检测的血清型在初始载体剂量下似乎都具有类似的向心性，因此接下来进行了剂量-反应研究。如前所述，另外两组小鼠注射AAV-CB-LacZ，并监测6周：一组小鼠的剂量为2.5×10¹⁰GC和剂量为2.5×10的另一个⁹通用条款。AAV9继续以中等剂量提供高水平的整体心脏基因转移，而其他血清型介导的表达急剧下降(图2a). 在低剂量下，AAV9仍然能够提供适度的心脏转基因表达，而由其他血清型介导的表达可以忽略不计(图2a). 此外，尽管心脏转基因表达在中等剂量时仍然很高，但在肝脏和膈肌中的表达几乎检测不到（数据未显示）。对中间组的心脏组织提取物进行定量β-半乳糖苷酶检测，该检测结果证实了X-Gal染色：AAV9处理的心脏的活性比其他血清型高约1 log(图2b).

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图2。

心包内注射50μl（含指定剂量的AAV-CB-LacZ）6周后，小鼠心脏中LacZ表达的剂量反应。(一)小鼠心脏X-Gal染色和曙红复染的代表性显微照片。比例尺：200μm。(b条)图表显示了通过定量化学发光分析测定的中等剂量处理的小鼠样品的β-半乳糖苷酶活性。列和误差条代表平均值和标准偏差。注意，AAV9优于在中等剂量下评估的其他血清型(*第页 < 0.05与其他血清型）。

AAV9在小鼠心脏表达的时间进程

由于AAV9似乎是最适合小鼠心脏的血清型，因此我们接下来评估了该组转基因表达的稳定性。如前所述，用高剂量AAV9-CB-LacZ治疗小鼠，并监测长达1年，在1周、2周、3周、6周、7个月和1年时进行安乐死。转基因表达在所有检测时间点都是全局高效的(图3). 表达在1周时可检测到，在2周时达到峰值，在6周内保持稳定。到7个月和1年时，大量LacZ阳性细胞仍然存在于整个心脏，尽管其频率有所降低(图3). 定量β-半乳糖苷酶检测结果显示，酶活性从6周到1年下降了约5倍（数据未显示）。

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图3。

心包内注射含2.5×10的50μl LacZ表达的时间进程¹¹AAV9-CB-LacZ的GC。所示为X-Gal染色和曙红复染切片的代表性显微照片。比例尺：低放大1 mm(顶行)，200μm用于高倍率(最下面一行).

大鼠AAV血清型的心脏向性

接下来评估AAV血清型1、7、8和9向大鼠心脏提供基因转移的能力。AAV6未在大鼠中进行评估，因为在本研究中，它在小鼠心脏中的表现与AAV1相似，并且之前有报道称在大鼠心脏中表现类似（Palomeque等。,2007). 成年大鼠（8周龄）接受左胸切开术，直接注射5×10¹¹将AAV-CB-LacZ GC送入心肌，在4周时处死，通过X-Gal染色分析LacZ的表达。AAV9为心脏靶区（左心室游离壁）提供了高效的全局转基因表达，而与其他血清型注射后表达最低(图4).

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图4。

左心室游离壁直接心肌注射250μl（含5×10）4周后大鼠心脏切片的代表性显微照片¹¹气相色谱法测定五等分样品中所示血清型的AAV-CB-LacZ。切片已用X-Gal染色，并用曙红复染。比例尺：2.4 mm。

大鼠AAV血清型的剂量反应

为了确定AAV9是否会以较低的载体剂量继续提供高水平的基因转移，向大鼠注射5×10¹⁰如前所述的AAV-CB-LacZ GC，在4周时死亡。AAV9能够在低剂量下提供适度的基因转移，但在接受其他血清型治疗的大鼠心脏中几乎检测不到LacZ的表达(图5a). 对高剂量组的心脏组织提取物进行了定量β-半乳糖苷酶测定，该测定结果证实了X-Gal染色：AAV9心脏的活性比其他血清型高5-10倍(图5b).

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图5：。

在五等分样品中直接心肌注射指示剂量的250μl AAV-CB-LacZ 4周后，大鼠心脏中LacZ表达的剂量反应。(一)大鼠心脏X-Gal染色和曙红复染的代表性显微照片。比例尺：200μm。(b条)图表显示了通过定量化学发光法测定的大鼠高剂量治疗样品的β-半乳糖苷酶活性。列和误差条代表平均值和标准偏差。请注意，AAV9优于其他评估血清型(*第页 < 0.05与其他血清型）。

大鼠心脏基因转移后的心脏功能

为了确定心脏基因转移是否会对心脏功能产生有害影响，大鼠接受了两种最高效血清型（AAV8和AAV9）的高剂量治疗，并进行了超声心动图（echo）检查在4周安乐死前使用Millar压力-容量电导导管进行血液动力学评估，并与未注射的对照组进行比较。中显示的回波数据表1结果表明，两组间心脏功能在缩短分数（FS）或射血分数（EF）方面无显著差异。三组之间的心脏几何形状也没有显著差异，尽管AAV8组中一只异常大的动物确实导致了该组心脏重量和心室尺寸增加的趋势(表1). 血流动力学数据显示在图6表明三组之间的压力-体积关系没有显著差异。因此，心脏基因转移在舒张充盈或收缩压产生方面均不会对心脏周期产生不利影响。

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图6。

心肌直接注射5×10后4周大鼠心脏血流动力学的测定¹¹AAV8-和AAV9-CB-LacZ与未注射对照的GC比较。通过Millar电导导管记录典型的压力-容积回路。未观察到压力或体积方面的显著差异。RVU，相对体积单位。

表1。

用二维超声心动图评估4周时的心功能^一

	人力资源（bpm）	IVSd（厘米）	LVIDd（厘米）	LVFW（厘米）	LVID（厘米）	FS（%）	EDV（毫升）	血沉（ml）	EF（%）	LV质量（g）	CO（升/分钟）	SV（毫升）
天真	267 ± 15b条	0.17 ± 0.02	0.72 ± 0.03	0.18 ± 0.07	0.42 ± 0.02	41 ± 4.2	0.83 ± 0.11	0.19 ± 0.03	77 ± 4.6	1.3 ± 0.10	0.17 ± 0.04	0.64 ± 0.12
AAV9型	274 ± 51	0.18 ± 0.02	0.73 ± 0.03	0.16 ± 0.02	0.44 ± 0.08	39 ± 10	0.86 ± 0.09	0.22 ± 0.12	74 ± 13	1.3 ± 0.06	0.17 ± 0.04	0.63 ± 0.12
AAV8发动机	259 ± 3.5	0.16 ± 0.06	0.80 ± 0.06	0.29 ± 0.13	0.52 ± 0.07	35 ± 6.1	1.13 ± 0.25	0.34 ± 0.12	69 ± 9.0	1.9 ± 0.96	0.20 ± 0.05	0.78 ± 0.19

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缩写：CO，心输出量；EDV，舒张末期容积；EF，射血分数；ESV，收缩末期容积；FS，分数缩短；心率；IVSd，室间隔舒张直径；左心室；LVFW，左室游离壁；LVIDd，舒张时左室内径；左心室内径、收缩时左心室内二聚体；SV，冲程容积。

^一P（P） = NS用于所有比较。

^b条数值报告为平均值±标准偏差。

大鼠基因表达和载体基因组的生物分布

接下来进行生物分布研究，以确定用AAV8和AAV9治疗的高剂量组在4周时非心脏组织中LacZ表达的程度和载体基因组的存在。直接心肌注射两种血清型后，LacZ的表达主要局限于心脏(图7a). 在肝脏中检测到少量阳性细胞，而在其他检查的组织中几乎没有表达(图7a). 在所有被检查的组织中都检测到了载体基因组，其中心脏和肝脏中检测到的载体基因组数量最多(图7b). 心脏和肝脏中检测到的基因组数量相似，比其他组织中的基因组数量多2到3个对数(图7b).

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图7。

直接注射5×10后4周LacZ表达和载体基因组的生物分布¹¹将AAV8-和AAV9-CB-LacZ GC送入大鼠心脏。(一)检查了几个器官中LacZ表达的代表性显微照片。切片用X-Gal染色并用曙红复染。比例尺：200μm。(b条)图中显示了通过TaqMan PCR检测的几个器官中的载体基因组分布。他，心；Li，肝脏；卢，肺；Br，脑；Te，睾丸；Ki，肾脏；Sp，脾脏；St，胃；嘎，腓肠肌。列和误差条表示平均值和SD。

讨论

本研究的目的是确定AAV血清型1、6、7、8和9在小鼠和大鼠中的相对心脏向性。我们还寻求使用一种传递技术，该技术可以最大限度地转移心脏基因，同时最大限度地减少对载体的全身暴露。在研究的小鼠臂中，我们发现通过剑突下途径将AAV注射到新生儿心包腔是实现高效、全面心脏基因转移的有效方法。高载体剂量（2.5×10¹¹)，所有检测的血清型都能够提供低肝表达的LacZ报告基因的高水平、全局心脏基因转移。AAV8和AAV9也在该剂量下有效地转导隔膜。然而，在中等剂量（2.5×10¹⁰)，AAV9是唯一继续向心脏提供高水平基因转移的血清型。此外，在中等剂量下，表达几乎完全局限于心脏，在膈肌和肝脏中只检测到少量阳性细胞。

尽管其他几个研究小组已经证明AAV9是小鼠中最有利于心脏的血清型等。,2006; 帕察克等。,2006; 博斯蒂克等。,2007; 万德莱斯等。,2007; 津卡雷利等。,2008)，没有人将重点放在将高水平基因转移与限制潜在危险的系统暴露的传递方法相结合。我们能够以大约比尾静脉注射后低5倍的剂量实现心脏特异性基因的全球转移（稻垣祯一等。,2006). 这不仅使我们能够最大限度地减少心外载体暴露和基因转移，还可以减少动物的总病毒载量。此外，我们的时间进程研究表明，心包内注射AAV9介导的基因转移起效快，至少在1年内相对稳定。

这种心包内注射方法以前曾被用于将腺病毒输送到小鼠心脏，尽管LacZ转基因表达在3天时是有效的，但在2个月后它在心肌中几乎不存在（Zhang等。,1999). 该方法还用于将单链AAV1（ssAAV1）和自互补AAV1输送至小鼠心脏；然而，由ssAAV1介导的GFP表达在第11天几乎检测不到，在第21天最低（Andino等。,2007). 尽管scAAV的使用导致了更快的表达开始和更高的表达，但scAAV限制了治疗应用，因为包装容量减少了一半（McCarty等。,2001,2003; 崔等。,2005). 例如，SERCA基因已被提议用于临床试验（Hajjar等。,2008)，太大，无法打包到scAAV中。因此，我们认为，我们使用ssAAV9的策略比上述方法具有显著优势。

我们技术的潜在应用有很多。AAV9介导的高效、稳定的基因转移使其成为心脏基因转移载体的理想选择，因为大多数心脏病都有慢性病程。此外，由于小鼠是作为新生儿注射的，并且载体剂量可以调整以限制心脏的表达，这种心包内注射技术可以作为创建心肌特异性转基因或基因敲除（使用短发夹RNA[shRNA]；Andino等。,2008)行。这在胚胎发育过程中操纵产生致命表型的基因的情况下尤其有用。或者，这种基因转移技术可以用于在许多广泛使用的心脏病小鼠模型中筛选潜在的治疗性转基因，以确定大型动物试验的候选基因。最后，通过使用高矢量剂量，可以同时治疗心脏和横膈膜，这项技术可能在中密度纤维板Duchenne型肌营养不良小鼠模型等。,2003).

在我们研究的第二部分中，我们对成年大鼠进行了AAV血清型评估，我们在小鼠手臂中筛选了AAV，以确定AAV9在大型动物中作为心脏基因转移载体是否会继续发挥优势。据我们所知，我们是第一个对成年大鼠心脏中AAV9与其他血清型进行直接比较的小组。最全面的研究发现，AAV8优于AAV血清型1-7（Palomeque等。,2007)而其他人则显示AAV6优于AAV2（川本等。,2005)和AAV1超过AAV2和AAV5（Schirmer等。,2007). 我们没有在大鼠中测试AAV6，因为在本研究中，AAV6在小鼠中的表现与AAV1相似，并且之前有报道称它在大鼠（Palomeque）中的表现类似等。,2007). 这并不奇怪，因为AAV1和AAV6是同一分支的一部分，因此在其衣壳中具有>95%的序列同源性（高等。,2002,2004).

我们在这里报告说，在将AAV9直接注射到五等分的心肌中后，AAV9可向成年大鼠的左心室游离壁提供高效、全面的基因转移。这种基因转移水平超过了其他血清型提供的水平（约为1 log），并且优于另一位研究人员使用血管输送方法实现的基因转移（宫城县等。,2008). AAV9介导的基因表达在直接注射后也对心脏具有特异性。虽然在所有检查的组织中都检测到了载体基因组，但在肝脏中只检测到少量LacZ阳性细胞，而在其他检查的多个组织中没有阳性细胞。AAV9可能在介导心脏基因表达方面具有优势，因为病毒的不同内化和/或核脱外壳，正如之前对其他AAV血清型（Sipo）所确定的那样等。,2007)，但需要进一步调查来证实这一假设。最后，通过直接心肌注射在大鼠体内进行AAV9介导的心脏基因转移似乎是安全的，因为通过超声心动图或Millar电导导管在注射AAV9的大鼠和未注射AAV9-的大鼠之间没有发现心脏功能的差异。

我们的结果表明，AAV9应该是涉及心脏基因转移到大鼠心脏的研究的首选载体。这一点很重要，因为作为较大的动物，大鼠有机会在更具临床相关性的模型中评估潜在的治疗基因。例如，通过冠状动脉结扎在大鼠而不是在小鼠体内建立缺血性心肌病模型或通过主动脉结扎建立压力超负荷心肌病的模型在技术上更可行，这些大鼠模型在文献（Pleger等。,2007; 坂田等。,2007). 然而，研究人员没有在这些模型中使用AAV9，因此，获得了次优的基因转移效率，这可能会导致他们低估或错过潜在治疗基因的有益作用。

AAV9是小鼠和大鼠中最具嗜心性的血清型，应用于涉及这些动物心脏基因转移的研究。我们已经描述了允许在这些物种中进行全局心脏特异性基因转移的技术。如果需要，可以通过载体的转录和/或转导靶向性进一步增强心脏特异性（Godecke，2006; 穆勒等。,2006,2007). AAV9可能是心脏临床试验的首选载体，但应首先启动大型动物和非人类灵长类动物研究，以评估AAV9在这些高等物种中的心脏性能。

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