mTOR介导Wnt诱导的表皮干细胞耗竭和衰老

摘要

介绍

Wnt家族由19个分泌型富含半胱氨酸的糖蛋白组成，它们通过与Frizzled家族七跨膜受体的N末端胞外富含半胱蛋白区域相互作用，以及与LRP5或LRP6（低密度脂蛋白受体相关（LDL-R）蛋白家族的两个成员）相互作用来启动信号传导(Moon等人，2004年;努斯，2008年). Wnt可以刺激几个主要的信号级联，包括规范的Wnt/β-catenin途径，其中β-catentin稳定并转位到细胞核，以及非规范的Wnt途径，其中包括PCP（平面细胞极性）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、Rho和钙信号途径（综述于Moon等人，2004年;Reya和Clevers，2005年). Wnt/β-catenin通路的不适当激活与大量高度流行的肿瘤有关，支持该通路在促进细胞生长中的重要作用(布伦南和布朗，2004年;克劳斯和伯奇梅尔，2008年). 此外，大量数据表明，Wnt功能对于胚胎发育以及成人组织的维护和再生是必需的(刘等人，2008)具体地说，Wnt控制着从原肠胚形成到器官形成的各种过程，包括心脏、乳腺分支，以及血管、肾脏和肺的发育，通常导致涉及上皮-间充质相互作用的发育事件(克劳斯和伯奇梅尔，2008年;Moon等人，2004年;努斯，2008年;Reya和Clevers，2005年).

在表皮中，当间充质细胞填充皮肤时，毛囊（HF）开始发育。在这个过程中，真皮发出的信号会导致上皮增厚、上皮细胞伸长，并形成含有Wnt反应细胞的斑块(Andl等人，2002年)（在中审查阿隆索和富克斯，2003年;Blanpain and Fuchs，2009年;Maretto等人，2003年). 作为回应，斑块向真皮细胞发出信号，使其凝结形成HF的毛乳头成分，这也是对Wnt信号的反应(Maretto等人，2003年). 然后，完全形成的HF在皮层前体、毛乳头和基质细胞中保留可检测到的β-连环蛋白水平(Maretto等人，2003年;Reddy等人，2001年)有助于维护高频结构。

自我更新和产生分化后代的能力是干细胞的定义。胚胎干细胞是多能干细胞，因此能够生成身体的任何组织，但大多数成人组织的维持依赖于组织特异性的自我更新的体细胞，其分化潜能更有限，并且只能再生其来源组织的某些细胞类型（参见Blau等人，2001年). 在控制干细胞功能的有限信号网络中，典型的Wnt/β-catenin通路已成为干细胞自我更新的关键调节器(Alonso和Fuchs，2003年;努斯，2008年). 例如，Wnt激活β-catenin有助于抑制角质形成细胞分化(朱和瓦特，1999年)，诱导毛囊形成(Gat等人，1998年)和维持神经祖细胞的增殖(Zechner等人，2003年). Wnt3A和5A还能够调节造血干细胞的自我更新并增加其祖细胞的数量(努斯，2008年). 然而，β-连环蛋白的显性活性形式的表达可能对造血干细胞产生负面影响，导致多谱系分化障碍，从而导致干细胞活性的丧失(Kirstetter等人，2006年;Scheller等人，2006年). Wnt也可能在激活细胞衰老程序中发挥作用，正如我们最近在klotho衰老动物模型中所示(Liu等人，2007年).

在这里，我们研究了皮肤上皮细胞室异位Wnt1诱导信号传导的长期后果。令人惊讶的是，我们发现Wnt导致HF快速增长，但随后表皮干细胞室消失，并进行性过早脱发。虽然Wnt1表达诱导皮肤上皮细胞室中β-catenin和mTOR的激活，但HF生长和干细胞耗竭都与mTOR激活有关。这些发现表明，表皮干细胞可能具有一种保护机制，在持续刺激激活mTOR的促生长途径后，导致细胞衰老，从而帮助维持干细胞群体的遗传完整性，这可能最终有助于抑制肿瘤形成。

结果

Wnt1诱导生长期、生长激素样HF结构的持续维持

为了评估Wnt1在表皮中的作用，我们有条件地表达重量1携带细胞角蛋白5启动子（K5）表达逆转录四环素反式激活因子（rtTA）的小鼠杂交基因(Vitale-Cross等人，2004年)FVB/N小鼠表达重量1含有IRES荧光荧光素酶的基因泰特-响应元件(泰特-重量1）(Gunther等人，2003年). 这一杂交后代遵循正常的孟德尔分布，虽然稍小，但没有观察到致死性泰特-通过给怀孕小鼠注射强力霉素，在发育过程中激活系统（未显示）。因此，我们关注Wnt1在出生后HF形态发生过程中的作用。HF的发育可分为八个不同的阶段，这些阶段在胚胎发生期间开始，并在动物出生后不久达到高潮(Paus等人，1999年). HF形态发生的最后阶段（阶段8）涉及生长阶段，通常称为生长期(Greco等人，2009年;Paus等人，1999年)紧接着是接近同步进入蜕变期和休止期阶段，在第一个毛发周期中遵循一个明确的模式(图1A). 在生长期（生长期），角质形成细胞分化为外根片（ORS）和内根片（IRS）形成HF的低循环部分。IRS由外部亨利层、赫胥黎层和将IRS与发干分离的角质层组成(伊藤，1986年). 在退化期间，HF经历了一个退化过程，主要由HF下半部的凋亡驱动。休止期是毛发周期的最后一个阶段，在此阶段，HF上半部的静止上皮细胞保持静止，直到接受新的生长刺激(莫里斯等人，2004年). 为了分析重量1在第一个头发周期中，我们选择了4个时间点，即7、14、17和21天(图1B). 我们观察到，在强力霉素治疗后，所有K5rtTA/泰特-与对照鼠相比，Wnt1转基因小鼠提前进入快速生长阶段。这种诱导导致加速但可控的HF生长，并形成所有HF鞘（ORS和IRS）。然而，与对照同窝鼠不同的是，突变小鼠的HF未能进入退化期和休止期。与此一致，K5rtTA/泰特-Wnt1小鼠保持了生长期发现的皮肤厚度，在第17天和第21天保留了皮下组织中HF的下半部分，这与分别处于衰退期和休止期的对照同窝小鼠截然不同(图1B). 在第二个头发周期中也观察到类似的结果(补充图1)这表明Wnt1促进HF在生长阶段的持续存在，而不是经历连续的生长和退化周期。

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图1

Wnt1的表达导致毛囊持续增殖状态（HF）。A） HF以循环方式生长，包括生长期或生长期、退化期（退化期）和休息期（休止期）。B） K5rtTA对照动物第一个同步毛发周期的H&E切片显示了指定年龄段每个阶段的组织学特征（上面板）。K5rtTA的典型示例/泰特-多西环素治疗的Wnt1小鼠早期进入生长期，随后未能经历退化和休止期（下表）。

为了进一步表征突变小鼠的HF结构，我们使用了棘层（细胞角蛋白1和10）和角化层（fillagrin）的特异分化标记(福斯，1995年). 我们还评估了HF标记物，如存在于ORS最内层细胞中的II型角蛋白6(福斯，1995年); 存在于头发皮层的AE13 I型头发角蛋白(Lynch等人，1986年); 和mIRSa，作为国税局的标记(波特等人，2004年) (图2A和B). K5rtTA的滤泡间表皮分化模式没有明显改变/泰特-Wnt1小鼠(图2A). 然而，当在第21天检查毛囊的结构时，我们发现毛囊ORS层中细胞角蛋白10的异常表达，而处于休止期的对照窝仔中不存在这种表达(图2A). 21天大的突变小鼠保持HF标记物的表达，如AE13和mIRSa，这些标记物在形态发生/发育后期（P14）的对照同窝鼠中存在，但在休止期（P21）则不存在(图2B). 因此，Wnt1的表达导致小鼠持续保持完全发育的HF，而不是进入退化和休止期。

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图2

K5rtTA高频结构的变化/泰特-Wnt1小鼠。A） 上面板：21日龄（P21）K5rtTA对照小鼠皮肤的冰冻切片显示，终末分化标记fillagrin在表皮最上层的典型定位。细胞角蛋白1（K1）和10（K10）在滤泡间室棘层的正常定位以及细胞角蛋白6（K6）在HF中的正常表达。α6整合素（α6）的表达将表皮与真皮分隔开来。DAPI用于核DNA染色（蓝色）。下面板：K5rtTA/泰特-喂食多西环素的Wnt1小鼠显示fillagrin、细胞角蛋白1、10正常定位，滤泡间表皮（IF）中无细胞角蛋白6。突变小鼠的HFs不表达fillagrin和细胞角蛋白1，但IRS室中存在细胞角蛋白10的异常表达，与细胞角蛋白6的正常表达共存。B） 在形态发生后期（P14），K5rtTA对照小鼠表达I型毛发角蛋白AE13和IRS特异性标记物（mIRSa）。这些标记物在休止期停止表达（P21）。K5rtTA公司/泰特-相反，喂食多西环素的Wnt1小鼠通过P21维持这两个标记的表达，这与未能进入休息状态一致。细胞角蛋白5（K5）染色显示基底上皮层。高倍镜（63x）显示K5rtTA中表达AE13和mIRSa结构的细节/泰特-Wnt1小鼠。

Wnt1激活HF中的β-catenin途径：长期接触Wnt1会导致脱发

接下来我们研究了Wnt1下游分子β-catenin的表达和活性。突变小鼠和对照小鼠在皮肤的滤泡间区域以及包括隆起和球解剖区域在内的滤泡隔室中均广泛表达β-catenin(图3A). 虽然β-catenin的膜和细胞质定位很容易检测到，但未观察到核β-catentin染色，可能是由于膜染色的强烈信号或核β-catanin的有限存在。然而，通过BrDU掺入和cyclin D1表达评估，K5启动子驱动的Wnt1表达主要诱导HF基础K5表达层内的细胞增殖(图3B,补充图2).

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图3

强力霉素处理的K5rtTA表皮和HF中Wnt下游靶点的激活/泰特-Wnt1小鼠。A） 对照和突变小鼠中总β-连环蛋白的存在。对照组和K5rtTA皮肤中总β-连环蛋白（绿色）、细胞角蛋白14（K14）（红色）和DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光分析/泰特-图中显示了喂食多西环素的Wnt1。高倍镜显示β-catenin的膜和细胞质定位。B） K5rtTA中上皮性HF细胞的过度增殖/泰特-Wnt1小鼠。图形栏表示喂食多西环素的指定基因型的代表性动物在放大20倍的条件下10个场的平均±S.E.M.中BrDU阳性细胞的数量（***P<0.001）。C） 荧光素酶（Luc）的IHC在对照窝鼠的P14和P21上呈阴性染色，在K5rtTA的ORS上呈阳性染色/泰特-Wnt1小鼠与转基因构建物的表达相一致。突变小鼠HF IRS中未磷酸化、活性形式的β-连环蛋白（Actβ-Cat）的积累是显著的。然而，IHC在P14和P21对照品中未检测到β-连环蛋白的活性形式。使用培育成我们小鼠系的β-catenin报告小鼠系（BAT-Gal小鼠），我们能够在P14（生长期）检测到β-catentin活性，但在P21（休止期）检测不到。K5rtTA公司/泰特-然而，Wnt1小鼠与BAT-Gal小鼠杂交后，IRS中β-Gal染色的表达显示出β-catenin通路的强烈激活。在K5rtTA HF的IRS中观察到WISP-1（Wnt1诱导分泌蛋白1）的IHC反应/泰特-Wnt1小鼠，但不在K5rtTA对照小鼠中。Wnt-1表达后，在HF的IRS室中，以及在对照窝友（P14）的后期形态发生期间，容易检测到高水平磷酸化形式S6（p-S6）的积累，但在休止期（P21）则不存在。

确保我们的K5-driven泰特-Wnt1-IRES荧光荧光素酶小鼠，我们通过免疫组织化学分析荧光素酶的表达，显示突变小鼠ORS中K5表达层的强烈反应性(图3C). 接下来，我们对β-连环蛋白的激活状态进行了详细分析。使用识别Ser37或Thr41上β-连环蛋白去磷酸化形式的特异性抗体-β-连环素的活性形式(van Noort等人，2002年)，我们发现活性β-catenin的细胞质定位局限于IRS，与K5层表达荧光素酶的隔室相反(图3C). 因此，Wnt1的表达可能导致邻近HF上皮层中β-catenin的旁分泌激活。这是否包括最近报道的ORS中可能缺失的HF基质中特定Wnt1受体的作用(Reddy等人，2004年)，需要进一步调查。为了进一步研究这种旁分泌效应，我们使用β-catenin报告鼠系BAT-Gal，它表达lacZ公司β-catenin/T细胞因子应答元件控制的基因(Maretto等人，2003年)将这些老鼠与K5rtTA杂交/泰特-Wnt1鼠标线。事实上，LacZ对β-Gal活性的检测是在对照同窝小鼠（P14）和21天大的突变小鼠的第一个毛发周期的生长阶段进行的，而在此期间，在已经处于休止期的对照小鼠（P21）中未观察到β-Gal活动(图3C). 此外，我们还检测了HF室中内源性Wnt调节分子的表达。例如，通过IHC分析，我们能够检测到WISP-1（Wnt1诱导分泌蛋白1）的表达，这是一种β-连环蛋白调节分子(Xu等人，2000年)，在突变小鼠毛囊的IRS室中（P21）(图3C)与β-Gal报告系统对β-catenin-activated基因表达的分析一致。基于最近支持非传统蛋白激酶mTOR代表Wnt途径的直接靶点的研究(Inoki等人，2006年)，我们还表征了mTOR下游分子S6磷酸化形式的水平(Wendel等人，2004年). 与对照窝友相比，转基因Wnt1的表达在IRS处引起了pS6的强烈积累(图3C)具有与WISP-1染色相似的模式，活性β-catenin积累和β-Gal报告活性。总之，这些观察结果表明，位于ORS的Wnt1分泌细胞可诱导HF IRS室Wnt-下游靶点的旁分泌激活。

Wnt1的长期影响通过跟踪一组突变和野生型同卵双胞胎（n=25）>1年来进行分析。尽管K14启动子活性β-catenin的转基因表达导致了毛瘤瘤的肿瘤生长(Gat等人，1998年)，长期接触Wnt1导致了非常明显的生物学结果。在K5rtTA中观察到的持续增殖性生长抑素样表型/泰特-Wnt1小鼠逐渐脱发(图4A)所有鞘的扩张在显微镜下都能反映出来，这在第二个毛发周期中非常明显(补充图1)与对照组小鼠进行比较。强力霉素诱导的Wnt1表达导致90天后HF的终末分化(图4B). 随后，在Wnt1长时间表达后，ORS、隆起和皮脂腺分化为囊状结构(图4B,补充图3A). 长期多西环素治疗后，还观察到伴有多核巨细胞的继发性根尖周真皮炎症，并伴有HF密度的逐渐降低(图4B-C和补充图3B). 然而，在IF表皮中除了中度棘皮病（上皮室增厚）外，未观察到其他主要改变(补充图3C).

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图4

K5rtTA患者进行性过早脱发/泰特-Wnt1小鼠。A） K5rtTA公司/泰特-与K5rtTA对照鼠相比，喂食多西环素的Wnt1转基因鼠在1岁时毛发完全脱落。B） K5rtTA和K5rtTA的H&E组织学切片/泰特-与正常K5rtTA对照小鼠相比，Wnt1在21、90和360天龄时表现出进行性HF变性。K5rtTA公司/泰特-Wnt1小鼠在21天大时呈现生长期、生长激素样表型，其演变为HF结构改变和随后的HF丢失。C） 使用与表皮表面平行的组织切片对毛囊进行定量。图形栏表示所示年龄的毛囊数量，即所示基因型的代表性动物放大10倍后10个场的平均±S.E.M.（***P<0.001；**P<0.01；ns:P>0.05）。

Wnt1通过引起干细胞消融诱导衰老并损害HF的再生能力

HF结构的渐进性变化和随后的脱发使我们探索了长期接触Wnt1是否会导致细胞凋亡或衰老。虽然我们无法检测到Wnt1表达引起的凋亡细胞的聚集（未显示），但我们观察到Wntl可以促进细胞衰老，这是通过检测细胞核中γ-H2AX病灶所揭示的DNA双链断裂来判断的(Motoyama和Naka，2004年)以及内源性β-Gal活性在pH 6时的表达，这是衰老细胞（SAβ-Gal）的一个已知特征(Dimri等人，1995年) (图5A-B). 令人惊讶的是，这与CD34的完全缺失有关⁺与同窝婴儿相比，HF干细胞(图5C). 为了证实这些结果，我们分析了Wnt1表达对CD34的影响⁺表达高水平和低水平α6整合素的细胞，每个细胞都代表具有自我更新能力的毛囊干细胞的不同亚群(Blanpain等人，2004年). 7周龄K5rtTA的FACS分析/泰特-Wnt1和对照窝鼠CD34和α6整合素（CD49f）的双重标记显示两个干细胞群体（CD34）的数量显著减少^你好α6^你好和CD34^你好α6^低的)在K5rtTA中/泰特-Wnt1小鼠(补充图4A和B)支持Wnt1促进毛囊干细胞室消融这一新兴概念。接下来，我们进行了一项功能分析，以评估我们的K5rtTA干细胞群体的能力/泰特-Wnt1小鼠在剃掉小鼠背毛后重新激活新的毛发周期(Sarin等人，2005年). 对照组和突变组小鼠在剃须前2天服用多西环素粒剂，并连续四周每天监测毛发再生情况。对照组小鼠在28天内将剃过的毛发倒回，而突变组小鼠在使用强力霉素治疗时毛发无法再生(图5D)，即使随访超过65天（未显示）。因此，综上所述，这些数据表明Wnt1可能会诱导HF干细胞退出其静止状态，这可能会导致HF中上皮细胞的初始增殖爆发，然后导致HF干电池群的耗尽。

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图5

诱导衰老和CD34丢失⁺K5rtTA中的上皮干细胞/泰特-Wnt1小鼠。A） K5rtTA和K5rtTA的冷冻皮肤切片/泰特-喂食多西环素（Doxy）的Wnt1小鼠显示SAβ-Gal反应性作为衰老标志。突变HF对该衰老标记呈阳性，而对照样品对SAβ-Gal无染色。在K5rtTA的HF细胞核中观察到IF染色对双链DNA损伤标记γ-H2AX的Foci/泰特-Wnt1小鼠（γ-H2AX-red，DAPI核染色）。更高的放大倍数如下所示。B） 突变和K5rtTA对照小鼠HF中γ-H2AX病灶的定量。条形图表示阳性HF的定量分析，即所示基因型和治疗的代表性动物在放大20倍的条件下10个视野中HF呈现γ-H2AX阳性细胞数量的平均±标准误差（**P<0.01；*P<0.05）。C） 冰冻皮肤样品切片并染色以获取角蛋白5（K5）（红色）和CD34（绿色）标记。K5rtTA小鼠在HF的隆起区表现出强烈且无标记的CD34染色⁺在K5rtTA的HF中观察到细胞/泰特-喂食多西林的Wnt1小鼠。放大倍数较高（左下）显示CD34的存在⁺K5rtTA对照小鼠中的细胞（箭头），但没有CD34⁺K5rtTA中的单元格/泰特-Wnt1老鼠（箭头）。D） 每组6只小鼠同时接受强力霉素饮食。到第28天，K5rtTA小鼠的背毛已经完全恢复，而/泰特-Wnt1强力霉素治疗的小鼠未能恢复剃毛区域。展示了具有代表性的老鼠。

mTOR在Wnt诱导细胞衰老中的作用

接下来，我们探讨了Wnt对HF诱导的显著影响是否取决于基质和周围组织产生的细胞衰老线索。为此，我们培养了在体外来自对照组和K5rtTA的原代角质形成细胞/泰特-Wnt1小鼠和对照组。Wnt1的表达式在体外根据荧光素酶活性评估，可以在强力霉素治疗的前24小时内实现(补充图5A). 同时，来自K5rtTA的初级角质形成细胞/泰特-通过SAβ-Gal染色判断Wnt1小鼠显示出衰老的早期证据(图6A). 我们还观察到Wnt1表达导致pS6水平升高(图6B)与EGF刺激的对照细胞相似，表明Wnt1可以调节上皮细胞中的mTOR活性在体外和体内这一观察促使我们探索mTOR是否参与Wnt1激活引发的衰老表型。为此，我们利用雷帕霉素抑制mTOR通路的能力(亚伯拉罕，2002). 如所示图6CK5rtTA的原代角质形成细胞暴露/泰特-Wnt1小鼠服用强力霉素导致出现核γ-H2AX病灶细胞。然而，令人惊讶的是，雷帕霉素导致显示γ-H2AX病灶的细胞数量减少(图6C). 接下来，我们利用了毛囊上皮干细胞在其细胞表面表达CD34的观察结果(Blanpain等人，2004年)隔离CD34⁺和CD34⁻角质形成细胞并探讨Wnt刺激这些细胞群的后果图6D). 当Wnt被外源性添加到他们的培养基中时，它导致CD34中出现核γ-H2AX病灶⁻和CD34⁺细胞，伴随着CD34中表达CD34的细胞数量减少⁺分类细胞群(图6D). 虽然雷帕霉素不影响CD34和γ-H2AX的基础表达（未显示），但该mTOR抑制剂阻止了核γ-H2AX病灶的积聚以及暴露分选的CD34导致的CD34表达下降⁺角质形成细胞对Wnt(图6D，右侧面板）。

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图6

Wnt1在分离的原代表皮角质形成细胞中的表达通过mTOR导致细胞衰老。A） 来源于K5rtTA和K5rtDA的角质形成细胞的原代培养/泰特-Wnt1小鼠用强力霉素治疗5天。在K5rtTA中观察到衰老检测/泰特-Wnt1细胞经SA-βgal染色（箭头所示）。B） K5rtTA角质形成细胞单层，泰特-Wnt1和K5rtTA/泰特-Wnt1小鼠隔夜饥饿，并用强力霉素治疗（24小时）。裂解细胞，并通过蛋白质印迹法分析磷酸化S6（p-S6）、总S6（S6）和微管蛋白含量，作为负载对照。未经强力霉素治疗的每个小鼠基因型的总细胞裂解物用作对照。K5rtTA小鼠的细胞隔夜饥饿，并用EGF（30ng/ml）预处理30分钟，作为额外的对照。C） 如图所示，将转基因小鼠角质形成细胞的原代培养物置于盖玻片上，并用强力霉素（1μg/ml）加或不加雷帕霉素（50nM）处理24小时。如图所示，进行DAPI核染色和γ-H2AX IF检查，图像合并在右侧面板。K5rtTA和K5rtTA中γ-H2AX染色的定量/泰特-用强力霉素加载体或雷帕霉素处理Wnt1衍生细胞。数据表示为γ-H2AX的百分比⁺细胞，表示为所示基因型和处理的代表性细胞在20倍放大倍数下10个场的平均±S.E.M.（**P＜0.001，ns:P＞0.05）。D） 将7周龄小鼠的角质形成细胞分为两个不同的细胞群（CD34⁺和CD34⁻). 将分选好的细胞置于IV型胶原涂层的培养皿中，并按照指示进行处理。在载体处理的细胞中，CD34分选的细胞显示膜CD34染色，当Wnt3处理6天时，随着γ-H2AX病灶的核积聚而丢失。CD34型⁻细胞对Wnt3也有核γ-H2AX聚集灶。雷帕霉素抑制CD34中γ-H2AX的积累⁺和CD34⁻并阻止CD34中CD34的表达降低⁺Wnt3引起的分类角质形成细胞。处理后CD34的CD34和γ-H2AX染色定量分析⁺分类后的角质形成细胞如右图所示。数据表示为每种指定治疗的一式三份培养物中阳性细胞的百分比，以平均±S.E.M.表示（***P<0.001；**P<0.01；ns:P>0.05）。

基于这些结果，我们询问雷帕霉素给药是否会影响K5rtTA皮肤中Wnt1表达引起的任何生物反应/泰特-Wnt1小鼠体内我们观察到雷帕霉素对mTOR的抑制阻止了Wnt1在转基因小鼠皮毛中引起的显著变化(图7A-左）。雷帕霉素也可消除滤泡间皮肤上层和K5rtTA IRS区pS6的积聚/泰特-强力霉素处理Wnt1，以及这些小鼠毛囊和皮肤对Wnt1的过度增殖反应(图7A-右侧）。雷帕霉素导致K5rtTA和K5rtTA细胞增殖减少/泰特-Wnt1小鼠(补充图5B)，它不会影响转基因的表达(补充图5C)Wnt1刺激K5rtTAβ-catenin报告子的表达/泰特-Wnt1/Bat-gal小鼠(图7B).

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图7

雷帕霉素阻断mTOR可防止毛囊改变、细胞衰老和CD34耗竭⁺Wnt1引起的上皮干细胞。A） 21日龄喂食多西环素颗粒的小鼠从3日龄开始每天服用雷帕霉素，而对照组的室友只服用该载体。雷帕霉素治疗阻止了皮毛的变化，这是K5rtTA中容易观察到的表型/泰特-用多西环素和载体对照处理的Wnt1。冰冻切片进行p-S6免疫反应染色。雷帕霉素治疗可阻止IRS室中p-S6的激活以及强力霉素引起的K5rtTA组织学改变/泰特-Wnt1小鼠，如H&E组织切片所示。注意HF下半部分在K5rtTA中无法回归/泰特-Wnt1小鼠喂食强力霉素，并在雷帕霉素治疗后在这些小鼠中重建正常的毛发周期（休止期）。B） 根据14天大的K5rtTA中β-Gal的检测，雷帕霉素没有阻止β-catenin报告系统的表达/泰特-用强力霉素和雷帕霉素治疗Wnt1/BAT-Gal小鼠。C） K5rtTA公司/泰特-Wnt1小鼠在3日龄时喂食多西环素，每天注射雷帕霉素或溶媒，21日龄时处死。K5rtTA对照小鼠的冷冻切片显示存在CD34⁺HF隆起区的上皮干细胞，无核γ-H2AX病灶。相反，K5rtTA/泰特-喂食多西环素的Wnt1小鼠出现大量显示γ-H2AX染色的细胞，并且缺乏CD34⁺但两者都被雷帕霉素治疗所阻止。D） CD34的量化⁺K5rtTA中的γ-H2AX染色/泰特-Wnt1小鼠喂食经溶媒对照或雷帕霉素治疗的强力霉素。数据表示为HF显示CD34的百分比⁺细胞，表示为所示基因型和治疗的代表性动物放大20倍后10个场的平均±S.E.M.（***P<0.001，*P<0.05），以及显示γ-H2AX阳性病灶的细胞核百分比，表示为在20倍放大率下从所示基因型和治疗的代表性动物中计数300个HF细胞后的平均±S.E.M.（**P<0.01；ns:P>0.05）。

雷帕霉素治疗可阻止Wnt1表达后出现核γ-H2AX病灶的毛囊堆积体内(图7C–D)，从而与获得的结果平行在体外引人注目的是，雷帕霉素挽救了CD34的丢失⁺Wnt1表达小鼠毛囊隆起区的细胞(图7C–D). 的确，尽管K5rtTA/泰特-雷帕霉素治疗的Wnt1小鼠毛囊仍然较少，其中绝大多数保留了完整的隆起干细胞室。这表明mTOR功能在介导CD34中至关重要⁺Wnt1导致上皮细胞丢失，同时可能还存在其他雷帕霉素敏感性机制，这可能发挥更有限的作用。事实上，雷帕霉素可以预防Wnt1引起的长期脱发：K5rtTA/泰特-用强力霉素和雷帕霉素治疗的Wnt1小鼠的毛发保留时间超过40天，如果用溶媒对照而不是雷帕霉素（未显示）治疗，这段时间大多数小鼠的毛发都会大量脱落。因此，mTOR途径似乎可以介导皮肤中Wnt-1表达引起的过度增殖反应和随后的阿金样表型，包括其干细胞室的衰竭。

讨论

来自胚胎组织的细胞能够分裂有限的次数，然后经历细胞分裂停滞直至死亡。这种现象称为复制性衰老(海弗利克和穆尔哈德，1961年)是一个不可逆的过程，也可由多种导致细胞应激的条件触发，如DNA损伤、细胞毒性药物暴露和氧化应激、端粒酶功能障碍和异常的癌基因诱导的增殖信号，后者被称为癌基因诱导衰老（OIS）（综述于塞拉诺和布拉斯科，2001年). 在正常（非恶性）细胞中，可以独立于端粒缩短观察到OIS或衰老的过早激活(塞拉诺和布拉斯科，2001年). 当由致癌信号激活启动时，这一不可逆的过程会导致细胞周期停滞，尽管细胞仍保持活性和功能。在这里，我们观察到Wnt1的表达诱导HF细胞的过度增殖和其干细胞的快速耗竭，正如CD34的消融所反映的那样⁺细胞在HF干细胞龛中，伴随着细胞衰老途径的激活。我们的动物模型中OIS的激活反映在衰老标记物γ-H2AX和SAβ-gal的积累以及剃须后头发没有再生，这是一种对毛囊干活性的功能性检测体内(Sarin等人，2005年). 我们可以推测，持续有丝分裂刺激导致干细胞库死亡可能是一种预防策略，以避免将遗传改变纳入自我更新的多能干细胞，从而避免其毁灭性后果，包括肿瘤形成。

Wnt信号传导对轴向模式和祖细胞命运至关重要，是从苍蝇到人类保守的调节信号系统的一部分(努斯，2008年). 事实上，Wnts在广泛的发展过程中发挥作用(Chang等人，2004年;Olivera-Martinez等人，2001年)以及控制增殖和分化(Moon等人，2004年;努斯，2008年;Reya和Clevers，2005年). Wnt1的异常激活与包括乳腺在内的许多器官的肿瘤发展有关（综述于Lindvall等人，2007年). 在我们的动物模型中，我们惊讶地发现Wnt1启动途径的表皮激活并没有像预期的那样导致肿瘤的形成，这是基于之前使用稳定、活性形式的β-连环蛋白的研究(Gat等人，1998年). 相反，Wnt1触发HF生长并维持持续的增殖状态，而不是进入增殖、衰退和静止状态的连续循环程序。最重要的是，即使经过长时间（>1年）的观察，我们也没有发现任何异型增生、化生或肿瘤的迹象。Wnt1和β-catenin动物模型的表皮表型差异的合理解释是Wnt-induced pathways的新兴复杂性(Moon等人，2004年;Reya和Clevers，2005年)只能通过β-catenin截短形式的表达进行部分模拟。在这种情况下，虽然β-连环蛋白的活性形式可以促进癌症进展，但Wnt刺激β-连环素，但也可能启动伴随的细胞衰老程序激活，从而保护肿瘤生长。

当位于隆起区域的表皮干细胞迁移到HF的球部区域时，每个新的毛发周期都会启动，在那里它们会增殖并产生HF中存在的所有细胞谱系(阿隆索和富克斯，2003年;莫里斯等人，2004年). 在这方面，增殖和静止状态之间的适当平衡对于维持功能性干细胞室至关重要(Cheng等人，2000年;Kobielak等人，2007年). 因此，适当调节生长和休息周期可能会延长HF干细胞的寿命，并延长毛发随动物年龄增长而出现的总时间。事实上，维持持续的HF生长期会导致其干细胞室消失，这一事实表明，这种周期性生长和休息可能是维持表皮干细胞自我更新能力所必需的，而表皮干细胞在正常情况下很少增殖(阿隆索和富克斯，2003年;Kobielak等人，2007年;Morris等人，2004年). 我们的研究结果表明，HF结构的不断增殖导致其干细胞池的耗尽，最终导致过早脱发。

Wnt表达对干细胞的影响可能具有高度组织特异性。例如，当Wnt1在乳腺中过度表达时，可以观察到其干细胞室迅速扩张(Cho等人，2008年;Li等人，2000年)在获得肿瘤抑制途径的基因改变后，可能有助于肿瘤形成，包括第53页(Debies等人，2008年). 然而，在HF的情况下，其干细胞在促增殖途径异常激活时可能特别容易衰老。考虑到毛囊和皮肤中的上皮细胞必须耐受多种环境DNA损伤因子，这可能代表了一种压倒一切的保护机制(Cang等人，2007年). 我们可以假设，在致癌应激或持续促进生长的情况下，HF的干细胞室可能会暂时扩张，但最终会耗尽，从而通过限制其干细胞的寿命和自我更新能力来阻止致癌过程。事实上，这种情况可能反过来解释了Wnt1表达反应的组织特异性，Wnt1可导致细胞衰老或肿瘤形成，这取决于每个特定干细胞群体中是否存在特定的保护性抗肿瘤机制。

另一方面，mTOR通路的异位激活与肿瘤进展有关(萨巴蒂尼，2006年;Shaw和Cantley，2006年)，mTOR还控制秀丽线虫、酵母、蠕虫和果蝇（在中审查Schieke和Finkel，2006年)，mTOR功能下降导致寿命延长（综述于Powers等人，2006年). 在此，我们提供证据表明，mTOR代表Wnt1激活可导致细胞生长和组织老化的途径的关键下游成分。Wnt通过最近阐明的涉及抑制GSK3的机制激活mTOR(Inoki等人，2006年). 在这种情况下，GSK3增强肿瘤抑制蛋白TSC2的活性，这是一种GTPase激活蛋白，可降低RheB1（一种激活mTOR的小GTPase）的GTP-结合水平。因此，Wnt通过抑制GSK3降低TSC2对mTOR的抑制作用，从而增强mTOR功能(Inoki等人，2006年). 事实上，根据pS6的积累判断，mTOR的激活发生在同一个细胞室中，在该细胞室中我们观察到β-catenin报告系统的表达增加和Wnt调节蛋白WISP-1的表达增加，支持mTOR刺激是Wnt1表达的直接结果。Wnt1激活mTOR有助于乳腺细胞的异常生长(Inoki等人，2006年). 然而，在皮肤中，mTOR依赖于Wnt1对HF内上皮细胞的持续增殖，或直接激活HF干细胞中的mTOR，可能导致HF干电池室耗尽。在这种情况下，干细胞中mTOR的过度增殖和激活可能会增加其周转，过早耗尽这些干细胞重新填充毛囊的能力。与此相一致，雷帕霉素对mTOR的药物抑制足以防止Wnt1表达后的干细胞消融，这反映了CD34的维持⁺鼓起干细胞。mTOR抑制也损害了小鼠Wnt1表达和CD34暴露引起的早衰表型的获得⁺因此，当其他癌基因的异常活动触发mTOR时，mTOR可能会导致OIS，这一领域值得进一步研究。

我们的研究和最近发表的报告显示Wnt1可能促进组织特异性干细胞的增殖和再生能力(加藤和加藤，2007年)mTOR可能在Wnt的促生长途径中发挥关键作用(Inoki等人，2006年). 然而，Wnt的长期激活可能通过mTOR的持续激活导致细胞衰老和干细胞室的衰竭或死亡。虽然干细胞的耗竭可能是一种保护机制，防止这种特定的自我更新细胞群的致癌扰动，但mTOR的持续激活也可能有助于加速衰老，因此，为以干细胞病理性耗竭、组织再生能力丧失和组织老化为特征的多种疾病的药物干预提供了新的分子靶点。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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