α/β-水解酶折叠蛋白家族突变引起的神经鞘磷脂贩运缺陷^*

细胞培养和DNA转染

HEK293细胞保持在37°C，10%CO₂在含有10%胎牛血清和2 m米 我-谷氨酰胺。使用FuGENE 6（Roche Applied Science）将NLGN cDNA构建物转染到HEK293细胞中，用于瞬时表达研究和建立稳定转染的细胞系，如前所述，使用800μg/ml G418（Geneticin，Sigma-Aldrich）筛选这些细胞系(27).

共焦显微镜免疫细胞化学

将稳定表达的亲代HEK293、WT NLGN3或G221R NLGN3细胞镀于聚-d日-赖氨酸涂层玻璃盖玻片，并在DMEM中生长。将细胞固定在磷酸盐缓冲液（PBS）中的4%多聚甲醛中，清洗并标记免疫荧光(16)使用抗FLAG M2单克隆抗体（1:500）（Sigma）和抗钙网织蛋白多克隆抗体（1:200）（Assay Design/StressGen，Ann Arbor，MI）在稀释5倍的封闭缓冲液（PBS，2%正常驴血清，0.5%BSA，和50mL米甘氨酸）。FITC-偶联抗兔和Cy5-偶联抗鼠二级抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫市Jackson ImmunoResearch）在同一缓冲液中稀释为1:100。图像处理采用了MRC-1024激光扫描共焦系统（Bio-Read）和蔡司Axiover 35 M显微镜。

免疫沉淀

稳定表达NLGN3 WT或R451C或G221R突变蛋白的HEK293细胞在PBS中洗涤两次，并在裂解缓冲液（140 m）中收获米氯化钠，3米米氯化镁₂，10米米Tris-HCl、pH值8、0.5%诺奈特P-40和5μg/ml亮氨酸肽）。在冰上孵育30分钟后，在14000℃下离心去除核碎片和细胞碎片克将细胞裂解物总蛋白（～500μg）与4.8μg抗FLAG抗体在0.5 ml中孵育2 h，然后添加30μl固定化蛋白g（Thermo Fisher Scientific）1.5 h。然后用T-TBS（20 m）将珠洗三次米三氯化氢，pH 7.6137 m米NaCl，0.2%吐温）和蛋白质在30μl 2×SDS样品缓冲液（100 m）中煮沸洗脱米三重HCl、pH 6.8、4%十二烷基硫酸钠、2%β-巯基乙醇、0.2%溴酚蓝和20%甘油）。快速旋转样品以去除珠子。收集上清液中的蛋白质进行Western blot分析。为了进行大规模蛋白质纯化以分析伴侣蛋白含量，细胞被清洗，用PBS收获，并用含有10 m的裂解缓冲液提取米 N个-乙基马来酰亚胺（皮尔斯）。在使用抗FLAG抗体进行蛋白质免疫沉淀后，在150 m米氯化钠，10米米HEPES，pH值7。NLGN蛋白用FLAG肽（500μg/ml）在50 m内洗脱米甘氨酸，pH值2。

Western Blots和免疫印迹

使用标准技术进行蛋白质印迹，包括10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）和Immobilon P膜（Millipore，Bedford，MA）。使用商用抗神经原小鼠单克隆抗体（克隆4F9，目录号129 011 Synaptic Systems，Goettingen，Germany）检测NLGN（参见图2B类,​,3,三、和​和4）4)稀释度为1:1000。用于伴侣检测的主要抗体的稀释度和来源（参见图2一和​和3）三)如下：抗钙网蛋白兔多克隆抗体，1:2000；抗calnexin兔多克隆抗体，1:2000；抗HSP70兔多克隆抗体，1:30000；抗PDI兔多克隆抗体和1:4000（均来自Assay Design/StressGen）；抗GRP78（GRP78/BiP）兔多克隆抗体，1μg/ml；抗GRP94兔多克隆抗体，1:2000；抗ERp57兔多克隆抗体，1:2000；抗HSP90兔多克隆抗体，1μg/ml；抗PDIr兔多克隆抗体，1:1000；抗ERp72兔多克隆抗体和5μg/ml（均来自马萨诸塞州剑桥Abcam）。

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图2。

WT和G221R NLGN3的细胞贩运。 一，表达FLAG标记的NLGN3全长蛋白的HEK293细胞的代表性免疫荧光图像(上部面板，重量；下部面板，G221R突变）。图像显示ER标记钙网蛋白的共定位染色(绿色)，NLGN3-FLAG标签(红色)，以及两个信号的合并视图，其中显示了黄色代表共定位蛋白质。显示了NLGN3 WT（*）和G221R（**）合并面板的放大倍数。B类糖苷酶治疗截短和全长免疫沉淀NLGN3蛋白、WT和G221R。左侧面板，PNGase F处理NLGN3可溶性蛋白质。NLGN3在位置Tyr-640处截断。中间面板，PNGase F处理全长NLGN3蛋白。右侧面板，NLGN3蛋白与Endo H孵育。所有消化后，使用抗NLGN抗体进行SDS-PAGE和免疫印迹。分子质量标记以kDa表示。突变蛋白和WT蛋白，无论是否O（运行）-糖基化链和膜跨被删除，在PNGase F裂解后显示出更快的迁移N个-连接的低聚糖，而只有G221R突变蛋白会被高甘露糖定向糖苷酶Endo H消化。

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图3。

ER伴侣与WT、R451C和G221R NLGN3的关联。用抗FLAG抗体从稳定转染的HEK293细胞裂解液中免疫沉淀出全长蛋白。使用多种伴侣蛋白的可用商业抗体对裂解液和免疫沉淀纯化样品进行免疫印迹。使用抗NLGN抗体检测免疫沉淀NLGN3作为对照。ER伴侣蛋白和R451C和G221R突变体NLGN3蛋白的相关性大于WT蛋白。特别是，伴侣PDI似乎选择性地与G221R突变蛋白相关。美国犹他州，未转染细胞；知识产权，免疫沉淀蛋白。一、WT和R451C NLGN3。B类、WT和G221R NLGN3。

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图4。

WT和突变NLGN3蛋白的蛋白酶敏感性。用胰蛋白酶消化WT、R451C和G221R NLGN3蛋白，并通过还原SDS-PAGE进行分析，然后用抗NLGN抗体进行免疫印迹。上部面板显示WT和突变蛋白的胰蛋白酶消化物。下部面板显示在没有胰蛋白酶的情况下突变蛋白的孵化。突变蛋白比WT蛋白对胰蛋白酶更敏感。一、WT和G221R NLGN3。B类、WT和R451C NLGN3。

内糖苷酶H和N-糖苷酶F消化

免疫沉淀蛋白在商用糖蛋白变性缓冲液中煮沸10分钟，并在37°C的G5反应缓冲液中用内切糖苷酶H（Endo H）消化3小时（马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室）。或者，用N个-糖苷酶F（PNGase F）在G7反应缓冲液（新英格兰生物实验室）中37°C下保持1小时。对消化液进行SDS-PAGE，并使用上述抗NLGN商业抗体进行免疫印迹。

蛋白质水解消化

将来自稳定转染WT或突变构建物的HEK293细胞的NLGN3蛋白进行免疫沉淀，并用胰蛋白酶（比活性：10000单位/mg蛋白质）（Sigma-Aldrich）处理50 m米三氯化氢，pH 7.4。将含有免疫沉淀NLGN蛋白的珠在室温下孵育，孵育时间为图4WT和R451C突变蛋白的胰蛋白酶浓度为3μg/ml，G221R蛋白的胰酶浓度为1μg/ml。添加SDS-PAGE负载缓冲液后，在90°C下加热样品，停止反应。使用商业化抗NLGN抗体通过SDS-PAGE和免疫印迹分析蛋白质降解。

代谢标记和免疫沉淀

稳定表达WT或突变NLGN3蛋白的HEK293细胞在无蛋氨酸和半胱氨酸的DMEM（Invitrogen）中生长30分钟，37°C，然后用0.5 mCi/ml脉冲处理30分钟[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 半胱氨酸（PerkinElmer Life Sciences），37°C。然后通过在含有5%FBS和5 m米未标记的蛋氨酸和半胱氨酸（Sigma-Aldrich）。在追逐结束时，收集细胞，将蛋白质溶解在裂解缓冲液中，并使用抗FLAG抗体（Sigma-Aldrich）和固定化蛋白G进行免疫沉淀3 h。用0.1%吐温20在Tris缓冲盐水（TBS）中洗涤珠子四次，并通过加入SDS-PAGE负载缓冲液并在90°C下加热5分钟来洗脱蛋白质。蛋白质在10%SDS-PAGE凝胶上分离，然后在固定溶液（1%乙酸，25%异丙醇水溶液）中培养凝胶30分钟，然后在扩增溶液中培养30分钟（GE Healthcare）。凝胶干燥后，通过荧光成像显示放射性信号。

G221R和R451C突变改变伴侣相互作用

为了鉴定有助于天然NLGN3折叠的ER伴侣，并分析与WT相关的伴侣和突变蛋白之间的差异关联，我们从稳定表达的HEK293细胞中免疫沉淀NLGN3，然后免疫印迹鉴定特定的ER伴侣蛋白。我们发现GRP78/BiP和GRP94与R451C和G221R突变蛋白的结合比野生型蛋白更为密切(图3)而凝集素calnexin和calreticulin与WT和突变蛋白都有关联。

由于NLGN3同时存在二硫键和游离半胱氨酸，我们测试了与PDI家族氧化还原酶的相互作用，发现PDIr、ERp57和ERp72与突变蛋白相关，但与WT NLGN3无关。PDI是该家族中唯一与G221R突变蛋白表现出特定相互作用的成员；它与WT或R451C NLGN3不稳定相关。胞质分子伴侣表现出不同的行为；HSP90仅与突变蛋白相互作用，而HSP70与WT蛋白密切相关。这些数据表明，天然NLGN3新生蛋白的折叠招募了几个伴侣蛋白，并且突变的新生蛋白在内质网中的保留是由于与不同类别的内质网寄居伴侣相关。

还使用质谱分析研究了ER伴侣与WT和突变NLGN3蛋白的关联。与免疫印迹一致(图3)数据收集表明，Grp78/BiP是与R451C和G221R突变蛋白相关的最丰富的ER伴侣，但与WT蛋白无关。⁶

蛋白质水解消化显示NLGN3突变体中不同程度的错误折叠

我们使用了有限的胰蛋白酶蛋白水解(29)探测R451C和G221R NLGN3的潜在错误折叠。通过免疫沉淀法从稳定转染的HEK293细胞的细胞提取物中纯化等量的WT和突变蛋白，并在室温下暴露于胰蛋白酶不同的培养时间(图4). 在胰蛋白酶浓度为3μg/ml时，在60分钟内分析R451C突变蛋白的蛋白质降解程度(图4B类). 对于G221R突变蛋白，在1μg/ml的浓度下，在30分钟内几乎完全降解(图4一). 相比之下，使用这些消化条件，WT NLGN3未表现出降解(图4,一和B类). 在没有胰蛋白酶的情况下平行孵育显示突变蛋白没有蛋白质降解。R451C NLGN3的蛋白酶敏感性表明，这种突变导致蛋白质呈现局部扩张和灵活的构象，导致胰蛋白酶敏感位点的暴露。G221R NLGN3对胰蛋白酶的敏感性甚至高于R451C，这表明α/β-水解酶折叠结构域核心中体积庞大、带电荷的精氨酸侧链极大地影响了整体蛋白质折叠，可能会产生熔融的球状物状态(30).

R451C和G221R突变对加工速率的影响不同

我们在表达NLGN3蛋白的HEK293细胞中进行了代谢标记实验，以监测蛋白质成熟和降解速率(图5). 在30分钟脉冲后³⁵S标记氨基酸和与未标记氨基酸的可变追逐间隔，我们观察到WT蛋白的加工在不到3小时内完成，正如缓慢迁移物种的出现所表明的那样(图5一,顶部面板)SDS凝胶中。在6小时时，WT NLGN3蛋白达到最大蛋白表达水平，缓慢衰减，在～48小时内降至最低检测水平。R451C突变的存在大大减少了NLGN3的处理(图5一,中间面板). 事实上，经过3小时的追踪，突变蛋白基本上保持未加工状态，只有一小部分出现在与完全加工的WT蛋白对应的带中。这一比例似乎在6小时后增加，并以比WT蛋白质稍快的速度消失。较低的分子质量带（可能是降解产物）在～24小时内累积。

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图5。

WT、R451C和G221R NLGN3蛋白质的细胞内处理。将稳定转染WT、R451C或G221R NLGN3 cDNA的HEK293细胞脉冲标记为[³⁵S] 蛋氨酸和[³⁵S] 半胱氨酸。标记后，用未标记的氨基酸培养指定的时间。用抗FLAG抗体从细胞裂解液中免疫沉淀标记的NLGN3蛋白，并用SDS-PAGE进行分析。一WT、R451C和G221R NLGN3蛋白在标记后0至48小时内的生物合成和加工。未处理(实心箭头)并已完全处理(开放箭头)蛋白质被标记。与WT相比，这两种突变蛋白在前6小时的糖基化过程较慢，新生蛋白的周转速度更快。B类，在缺少的情况下处理WT和G221R NLGN3蛋白(Ctrl键)或存在5μ米蛋白酶体抑制剂，乳酸菌素(乳酸)或MG132。显示了一个时间点，即标记后3小时。

当分析G221R蛋白的加工时，观察到更显著的差异(图5一,下部面板). 实际上，所有G221R突变蛋白都未经处理，并且比R451C蛋白降解得更快。然而，由于脉冲相技术与稳态免疫荧光和Western blot方法相比具有较高的灵敏度(图2)，我们确实看到成熟G221R蛋白的浓度非常低，在最初的1.5小时内变得明显。当在蛋白酶体抑制剂（乳酸菌素或MG123）存在的情况下进行代谢标记时(图5B类)G221R蛋白在3小时追踪后的表达分数增加显著高于WT蛋白，表明突变蛋白优先通过蛋白酶体途径降解。这些数据表明WT和突变体蛋白质的周转率存在显著差异，并表明G221R NLGN3突变体的优先降解途径涉及蛋白酶体。

单个海马神经元中WT、R451C和G221R NLGN3的运输

为了研究NLGN3突变对神经系统细胞内贩运的影响，我们将WT和突变的NLGN3蛋白融合到一种新的荧光报告物中，转染到能够在培养中形成突触连接的分离海马神经元中。荧光报告器标记TimeSTAMP2-YFP由一个顺式-HCV和YFP中具有HCV裂解位点的作用蛋白酶。新合成的标记蛋白没有荧光，因为YFP被切割-顺式HCV。添加BILN-2061通过抑制HCV拯救YFP荧光；添加BILN-2061后的标记蛋白（WT或突变NLGN3）是荧光蛋白(28). 利用该报告器的时间推移显微镜，可以在新合成的NLGN3蛋白到达最终目的地时对其进行可视化。

我们将NLGN3与TimeSTAMP2-YFP标签（NLGN3-TimeSTAMP2-YFP）和橙色荧光蛋白mOrange2（作为转染标记）融合，共同转染出生后第1天的大鼠海马神经元，并使神经元在2周内分化。在不接触蛋白酶抑制剂BILN-2061的情况下，神经元仅显示红色荧光(图6一,左列). 然后我们添加了5μ米BILN-2061，并在接下来的18小时内观察到新合成的蛋白质。在18小时时定量ER高尔基体区域和树突（距离细胞体超过30μm）中的荧光，并比较野生型、R451C和G221R版本的NLGN3-TimeSTAMP2-YFP(图6B类). NLGN3 G221R对枝晶的出口量最小，而NLGN3 R451C的出口量介于WT和G221R之间(图6B类,n个=13个，第页< 10⁻⁶通过方差分析，第页成对分组之间<0.03t吨测试）。可视化新的蛋白质定位显示，WT NLGN3-TimeSTAMP2-YFP可以有效地插入突触，如神经元点状绿色染色所示图6一(顶行). 与WT蛋白相比，NLGN3中的R451C突变导致蛋白向树突状位置的输出减少(图6一,中间一排). 高水平表达R451C的神经元表明，一些突变蛋白被转运到树突，但效率很低(图6一,中间一排,右立柱).

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图6。

NLGN3在大鼠海马神经元中的贩运。 一，显示了使用TimeSTAMP2-YFP标记技术在海马神经元中新合成的NLGN3的代表性图像。将出生后第0天大鼠的神经元转染并培养14天，并在给药BILN-2061后18小时收集数据。新合成NLGN3的梯度(绿色)18小时后，观察到从胞体到树突的WT蛋白。R451C和G221R突变蛋白通过轴突主干向树突移位时出现缺陷。m橙色2(红色)是转染的标记。这个左列显示BILN-2061给药前的细胞。这个中间立柱显示给药BILN-2061后18小时的细胞。这个右立柱显示高表达细胞的放大倍数更大。B类，定量分析BILN-2061给药后18小时从ER-Golgi区室到树突的蛋白质易位。分析每个NLGN转染、WT、R451C或G221R的13个细胞；WT的树突状/ER-Golgi比率与突变体显著不同，第页= 0.023, **,第页<0.000001，方差分析第页< 0.000001.酒吧代表S.E。

NLGN3 G221R蛋白的贩运受损程度最高。在这种情况下，我们在轴突干和树突状轴中发现了最少的蛋白质，而树突状突触几乎没有定位，甚至在强表达神经元中也是如此(图6一,最下面一行). 神经元的这些结果与我们在HEK293细胞中的观察结果一致，其中G221R和R451C突变阻碍蛋白质处理，G221R突变导致最严重的缺陷。

为了了解上述突变对处理速度的影响，我们在30小时内进行了延时成像(图7一). ER-Golgi和树突状荧光分析表明，在18小时内，R451C通过与WT相关的分泌途径减缓蛋白质的进展，接近稳态分布(图7一). 请注意，R451C在3小时时完全没有树突状蛋白，而WT NLGN3的进展大约完成了三分之一。G221R突变更显著地减少了离开体细胞的蛋白质数量(图7一). 有趣的是，少量G221R蛋白被输出到树突中，并毫不迟延地出现；这种微小的增加与我们代谢脉冲期结果的初始峰值有关(图5,一和B类).

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图7。

大鼠海马神经元中NLGN3的处理和降解速率。 一量化WT、R451C和G221R NLGN3在不同时间的出口。树突中的荧光NLGNs与ER高尔基体区域中的荧光NLGNs的比率随着时间的推移而定量。B类在蛋白酶体抑制剂MG132存在和不存在的情况下，ER-Golgi区域中荧光WT、R451C和G221R NLGNs随时间的推移而降解。初始荧光任意设置为1.0。酒吧代表S.E。