大脑研究。作者手稿;PMC 2011年9月24日发布。
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血脑屏障受损,而非实质白细胞受损,是癫痫发作活动的标志
,1,三,6 ,三,6 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,6 ,5和1,2,三,6,*
尼古拉·马奇
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
三神经外科,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
6美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号脑血管研究部,邮编44195
青山藤
三神经外科,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
6美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号脑血管研究部,邮编44195
查塔利·戈什
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
清远范
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
明·T·阮
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
尼拉夫·德赛
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
哈普雷特·巴瓦
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
彼得·拉斯穆森
6美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号脑血管研究部,邮编44195
托马斯·K·马萨里克
5美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号放射科,邮编44195
达米尔·贾尼戈
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
2美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号分子医学部,邮编44195
三神经外科,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
6脑血管研究部,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,Cleveland,OH 44195,美国
1细胞生物学系,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
2分子医学部,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,Cleveland,OH 44195,美国
三神经外科,9500 Euclid Avenue,Cleveland Clinic,OH 44195,USA
5美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号放射科,邮编44195
6美国俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所欧几里德大道9500号脑血管研究部,邮编44195
*通讯作者:克利夫兰临床基金会脑血管研究部Damir Janigro教授。俄亥俄州克利夫兰市欧几里德大道9500号NB-20,邮编:44195电话:216-4450561,传真:216-4551466;gro.fcc@drginaj 这些作者也做出了同样的贡献
- 补充资料
补充图1:人血脑屏障渗透开放与脑电图的相关性A)我们之前已经描述了BBB中断的致痫效应[三]. 通过颈内动脉皮下股动脉插管到达由前循环供应的脑区(红色箭头,ICA),同时通过椎动脉皮下股动脉插管进入后循环供应的区域(灰色箭头,弗吉尼亚州)。请注意,ICA(而非VA)的中断会影响传感器电机条。A1)通过右侧ICA注射甘露醇导致右颞叶BBB开放和造影剂外渗,而通过向VA注射甘露糖醇打开BBB导致仅限于枕皮质的外渗。B)在人体成功渗透打开过程中获得的代表性痕迹。注意脑电图活动减慢(箭头)在注射甘露醇期间和BBBD后逐渐出现棘波。B1)当显示为时间联合频率图时,心电图变化更明显。注意高振幅信号的出现(红色信号灯)以及BBBD后发作频率的广泛分布。如所示大鼠血脑屏障的破坏导致EEG变化的类似进展。 GUID:4877EB5F-126F-4A7F-B792-12AC77B55D
补充图2:毛果芸香碱诱导的SE与BBB渗漏有关,但与实质性WBC无关A)注射Evans Blue前立即记录的毛果芸碱SE的示例。B) 在硬膜下间隙的软脑膜表面检测到CD45阳性细胞。C) 虽然在急性SE时观察到严重的BBB泄漏(埃文斯蓝渗出表明),但CD45阳性细胞通常在血管间隙中检测到(箭头). 注意BBB毛细血管外实际上没有CD45免疫反应。
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摘要
长期以来,人们认为慢性癫痫发作会导致血脑屏障(BBB)损伤。最近的研究也表明,BBB损伤会引发癫痫发作。我们使用BBB渗透破坏程序(BBBD)检查了BBB开放、白细胞进入大脑的模式与癫痫发作之间的相关性。这些发现与颞叶癫痫(TLE)患者切除癫痫脑组织的结果进行了比较。
我们证实成功的BBB渗透开放(BBBD)导致急性癫痫样放电的发生。脑电图(EEG)和时间联合频率分析显示,EEG减慢后,10-20 Hz的频率范围增加。使用悬浮在Evans Blue中的绿色荧光蛋白(GFP)标记的WBC(GFP-WBC),我们发现在BBB诱发癫痫样放电时,WBC填充了泄漏BBB的血管周围空间。匹罗卡品发作时也得到了类似的结果。脑实质内未观察到明显的白细胞外渗。
在TLE脑标本中,CD45阳性白细胞仅在血管和血管周围间隙中检测到,而白蛋白和IgG渗出物是实质性的。这种模式与在大鼠身上观察到的模式相似。
我们的数据表明,急性或慢性癫痫发作均与白细胞脑实质迁移无关,而白蛋白和IgG脑渗漏是急性和慢性癫痫发作的标志。
关键词:癫痫发作、白细胞、白蛋白外渗、颞叶癫痫(TLE)、脑电图(EEG)、脑血管
介绍
癫痫和癫痫影响了相当一部分儿童和成人。其发病机制尚不完全清楚[1]. 除了广泛研究癫痫发作的神经机制外,最近的研究表明血脑屏障(BBB)损伤可能是癫痫发作发展的重要病因[2-6]. 然而,脑血管损伤和慢性癫痫发作的时间和因果定位仍存在争议。
血脑屏障将脑实质与血液分离。其主要功能是调节脑内稳态[7;8]. 关于BBB损伤导致癫痫发作或癫痫样放电的机制的报告表明,白蛋白或钾等血清成分可能参与了癫痫发作或痫样放电的发生[5;9]. 电子显微镜对人血清白蛋白在脑内尖峰区分布的研究表明,其渗入神经膜和血管基底膜[10;11]. 后者被定义为血管外或血管周围。也有人提出,血清白蛋白通过与特定胶质受体结合而导致迟发性癫痫,而细胞外钾增加,谷氨酸失衡导致突触易化[5;9].
虽然BBB功能的丧失会促进癫痫发作,但白细胞是否渗出到脑实质可能对癫痫的发病机制起作用尚不清楚。因此,尽管大脑中中性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用可能导致癫痫发作[12]白细胞在脑实质中的存在及其可能的意义仍存在争议。
我们用颈动脉注射高渗甘露醇来阻断大鼠的血脑屏障。我们使用Evans Blue和GFP转染的WBC分析了血清蛋白和WBC外渗的模式。在颞叶癫痫患者中,我们使用血清白蛋白和免疫球蛋白G检测BBB损伤,而白细胞标记物CD45用于识别WBC。我们量化了血管内、血管周围和脑实质中白蛋白的数量和白细胞的数量。还包括与毛果芸香碱诱导的癫痫状态(SE)时WBC外渗模式相关的结果。
结果
BBBD诱导大鼠脑电图异常
我们记录了颈内动脉注射高渗甘露醇前后的脑电图(). 通过大体解剖评估BBB开口()或荧光显微镜(). 20%的大鼠成功阻断了BBB,只有在这种情况下才能检测到急性脑电图改变(). 特别是,我们记录了短暂的脑电图减慢(箭头在里面)随后活动逐渐增加。EEG变化的示例如所示进行时间-联合频率分析,以可视化时域中不立即明显的变化。BBBD后频率和振幅均增加(). 在人体受试者的BBB开放后,观察到类似的频率和振幅增加模式(参见补充图1). 这与我们之前的结果一致[13;14]. 与BBBD与急性发作相关的假设一致,在这两种情况下(啮齿动物或人类),只有当BBB被动脉内甘露醇成功阻断时,才会出现癫痫样放电。
BBBD诱导大鼠痫样放电的描述A)BBB泄漏的实验设置和总体评估。颈内动脉(ICA)经颈外动脉(ECA)插管。BBBD成功后,通过目视检查,埃文的蓝色渗出物很明显。B-B1)脑电图描记和时间联合频率分析。注意脑电图活动减慢(箭头)在注射甘露醇期间和BBBD后逐渐出现棘波。当显示为时间联合频率图时,心电图变化更明显。注意高振幅信号的出现(红色信号灯)以及BBBD后发作频率的广泛分布。C)我们证实,在大鼠中,类似于人类BBBD程序(在20%的程序中,BBB被打开,并且检测到癫痫样放电[三]).D)频谱突出显示成功BBBD后10-20 Hz峰值的出现(红色记录道)。
癫痫样放电时缺乏白细胞脑外渗A)BBBD手术后进行荧光微血管成像。大鼠脑组织切片定位FITC-白蛋白。在成功的BBBD手术中,观察到注射半球的实质内有明显的白蛋白积聚。泄漏点的详细信息用星号表示(A3-A4)。对侧半球的荧光信号主要为血管内信号(A1-A2)。B)GFP-WBC主要留在血管内或位于血管周围间隙(B1)。埃文斯·布鲁外渗(红色)用于识别蛋白质泄漏和可视化脑微血管。注意到白细胞外渗,但细胞仍留在血管附近。在对侧半球或假手术中,GFP-WBC在血管内分离。量化如图所示和.
大鼠癫痫发作时白细胞和血清蛋白脑外渗模式
如所示与对侧大脑相比,成功的BBBD手术导致注射半球FITC-白蛋白或伊文思蓝大量外渗。注意,对侧半球的FITC-白蛋白和Evans-Blue信号主要局限于血管内。假手术大鼠在两个半球的BBB血管中的蛋白质泄漏量可以忽略不计(参见示例:假手术和完整的容器).
人TLE脑显示出与大鼠BBBD相似的白蛋白在渗漏和非渗漏血管中的定量和定性分布模式A)定量了血管内外FITC-白蛋白的含量(详见方法)。注意,在完整的BBB血管外未检测到或量化荧光信号,而在泄漏血管外量化了大量荧光信号(A1-A2)。泄漏和非泄漏容器中荧光密度线剖面的代表图如A1所示。B)注意,与大鼠BBBD相似,TLE中泄漏血管外存在大量白蛋白(使用初级抗体检测)。注意,在存在血管内白蛋白(B1-B2)的完整血管中,信号在血管壁处急剧减弱。当观察到渗漏时,信号逐渐变细,反映渗出。*表示p<0.05。
为了确定BBBD诱导的脑电图异常时WBC脑外渗的模式,我们注射了一个含有GFP转染的自体WBC的丸(详见方法)。表明尽管血清蛋白大量泄漏(Evans Blue,红色荧光)大多数GFP-WBC留在血管内或分布在血管周围的直接空间。这些结果的量化见注意,在毛果芸香碱急性SE期间,通过CD45染色评估,BBB损伤(Evans Blue渗漏)并没有伴随显著的WBC脑外渗(补充图2). 硬膜下间隙检测到CD45阳性细胞(补充图2B).
GFP-WBC和CD45阳性细胞的定量A)成功BBBD后大鼠大脑中渗漏和非渗漏血管的总数。B-C)我们确定了白细胞在两组血管中的分布(例如。,泄漏与完整)。注意,与脑实质和血管内空间相比,在渗漏血管中,血管周围空间的WBC数量显著更高。在完整的血管中,大多数白细胞位于血管内空间。D)慢性人TLE脑的特征是缺乏WBCs的实质归巢。请注意,血管周围间隙中存在大量白细胞或CD45。*表示p<0.05。
为了定位脑内GFP-WBC并确定其与脑血管的关系,我们首先确定并量化了大鼠颞、额叶和丘脑区域泄漏和非泄漏血管的数量。我们在1mm的区域内平均发现2个泄漏的血管和6.5个完好的血管三在这三个地区(). 接下来,我们量化了同一地区GFP-WBC的数量。如中所量化在渗漏血管中,大多数GFP-WBC位于血管周围间隙。在所有三个测试区域的脑实质中几乎没有检测到GFP-WBC。与完整血管(对侧半球到BBBD程序和假手术大鼠)相对应,大多数WBC包含在血管内空间().
TLE患者白细胞脑和血清蛋白外渗模式
我们研究了接受切除手术的TLE患者脑标本中的BBB损伤(). 从手术室获取脑标本并进行护理(例如。,正确的氧合和固定程序)以避免损伤(另请参阅方法和讨论)。如所示、IgG和白蛋白靶向抗体显示血管周围和脑实质中存在渗出物。注意,癫痫人脑中IgG(3A1-A3)或白蛋白(3A4-A9)的渗出模式与BBBD后在大鼠中观察到的模式相似()或毛果芸香碱癫痫发作(补充图2). 除了点状渗漏外,人类TLE大脑还显示出较大的渗出区域(由虚线A3和A5)。
TLE受试者脑内白细胞外渗不足A)使用抗IgG和白蛋白抗体对TLE脑切片进行染色。检测到IgG阳性信号(星号)泄漏血管周围(A1-A3)。丰富的白蛋白阳性信号(绿色)在检测到IgG的相同区域发现(A4-A9)。还显示了完整血管的示例(A6中的菱形表示)。B)CD45阳性细胞(WBCs)通常在以血脑屏障渗漏为特征的区域的血管周围间隙(B1-B3)中观察到。广泛的小胶质细胞染色也可见(B4)。箭头指向血管周围CD45阳性细胞。观察到瘢痕实质WBCs。量化如图所示和.
表1
TLE患者 | 年龄(年) | 性别 | 分类 | 病因学 |
---|
| | | | |
第1列 | 14 | F类 | 右半球癫痫 | 的畸形 大脑皮层发育 |
TLE 2级 | 15 | M(M) | 左额叶癫痫 | 皮质发育不良 |
TLE 3级 | 15 | M(M) | 右侧颞叶 癫痫发作 | 右侧海马 硬化 |
TLE 4级 | 5 | F类 | 右半球癫痫 | 远程症状 癫痫 |
TLE 5级 | 39 | M(M) | 局灶性癫痫 | 未知 |
TLE6型 | 1 | F类 | 半球性癫痫 | 的畸形 皮层发育 (右半球) |
TLE 7级 | 43 | F类 | 右内侧颞叶 癫痫 | 中颞叶 硬化 |
TLE 8级 | 37 | M(M) | 左内侧颞叶 癫痫 | 中颞叶 硬化 |
在TLE患者的大脑中,通过检测CD45免疫反应性来评估白细胞的外渗(). CD45阳性细胞的数量是根据那些显示白蛋白外渗的脑区的渗漏血管进行测量的(例如,相邻切片)。在急性癫痫发作的大鼠大脑中,我们发现TLE中有几个细胞积聚在小口径或大口径血管的血管周围空间(). 薄壁组织中的细胞数量较少().
BBB损伤的量化
我们定量了BBBD大鼠脑和TLE人脑样本中血管内外的白蛋白含量。如所示对于大鼠和对于TLE脑标本,FITC荧光信号在泄漏的血管外扩散,表明白蛋白通过受损的BBB扩散到脑实质。在大鼠和人类的渗漏血管和非渗漏血管周围的脑实质中测得的荧光单位之间存在统计差异。在BBBD手术和假手术大鼠(完整的BBB,).
讨论
本文所述工作的主要发现是,在急性癫痫样放电或SE(BBBD和匹罗卡品)和TLE标本中未观察到白细胞显著渗入脑实质。白蛋白或IgG泄漏是急性和慢性癫痫发作的标志。
我们的结果显示血管(例如,BBB损坏)和蜂窝(例如自发(TLE)或激发(BBBD,匹罗卡品)癫痫样放电或癫痫发作时的WBC外渗模式。此外,老鼠和人类数据的相似性(和补充图1)验证了在大鼠中使用BBBD作为研究医源性癫痫发生的一种手段。本研究的一个推论是通过比较接受渗透性血脑屏障破裂患者和接受相同程序的大鼠的脑电图数据得出的(补充图1,另请参阅我们以前的研究[13;14];[15;16]. 脑电图的减慢和沉默(和补充图1,箭头)很明显。甘露醇诱导脑电图减慢的机制目前尚不清楚。
血脑屏障和白细胞与癫痫病因的相关性
几项研究支持BBB损伤是癫痫发作的病因机制[三-5;17]. 最近的研究表明,干扰BBB和WBC相互作用的外周炎症过程是癫痫的诱导剂[12;18;19]. 最近的一些报告调查了癫痫人脑组织脑实质中白细胞的存在[12;20-23]. 然而,所有积累的证据都没有表明癫痫患者的脑实质中主要存在白细胞。除了死后或切除的脑组织外,我们还评估了急性医源性癫痫发作时白细胞外渗的存在。在我们用GFP标记的自体WBC进行的实验中,我们发现急性癫痫发作后脑实质中存在少量WBC。在人类TLE大脑中,我们使用了抗CD45(白细胞标记物)的抗体。我们发现与急性诱发性癫痫发作后的结果相似,即。,脑实质中归巢细胞的最少数量(,补充图2和补充表2). 这也符合以下事实:不育的情况是不常见的[24;25].补充表2这表明,尽管存在明显的物种和时间相关的差异,但白细胞血脑分布的共同线索是可以假设的。因此,本文总结的人类和动物研究的共同点是,与血管周围积聚相比,存在罕见的实质WBC[23].
然而,这一分析并非没有陷阱。一个核心问题是,细胞外渗到大脑中是否是癫痫发作的必要条件。在我们的实验中,即使在癫痫样放电发生后对脑样本进行处理,实质白细胞的缺乏也符合这样一种假设,即脑电图异常的发生不需要外渗。有可能是所选择的时间窗口太短,不允许白细胞进入大脑。然而,这与BBBD发作的发展无关,因为取样时已经记录到癫痫样放电。此外,似乎大脑外渗事件非常短暂。换句话说,可能是在脑电图异常和牺牲之间的几分钟内,细胞渗出,然后回到血流中。后者可能不太可能,因为细胞跨壁运动的过程需要时间和分子触发物[21]. 然而,还需要进一步的研究来排除这种可能性。
此外,我们没有使用WBC亚群标记物评估BBB相互作用和大脑进入的模式。然而,由于几乎所有白细胞都表达这种抗原,因此脑实质中缺乏一般的CD45免疫反应并不支持进一步的研究。进一步的研究(如电子显微镜)将更好地阐明癫痫发作期间白细胞在血脑屏障的准确定位。
另一个关注点是手术操纵和术中监测操作(例如。,硬膜下格栅)可能导致促炎过程和BBB泄漏。此外,患者的术前状况(例如,先前存在的炎症)。再切割后的步骤(例如固定方式)也可能影响组织完整性和结果。虽然进行了适当的组织处理(另请参阅方法),但我们认为,这些问题对这项特定的研究并不重要,因为我们没有发现组织中有任何炎症迹象,只有少数细胞似乎滞留在血管周围空间。
BBB癫痫发作机制的相关性
近年来,血脑屏障损伤与癫痫发作发展的关系一直是广泛研究的课题。众所周知,创伤性脑损伤、缺血性或血管炎症事件会破坏血脑屏障的完整性,通常会导致癫痫发作[6;26]. 有人提出,与血脑屏障损伤相对应的是,血液成分(如钾和血清白蛋白)渗入脑实质[三;9;17]. 有趣的是,抗药性癫痫患者有血管生成和渗漏血管形成的报道[27]. 我们的结果证实了这些研究[27].
研究表明,创伤性脑损伤会导致大脑中钾浓度的改变,这可能有助于癫痫的发展。有趣的是,大脑中的间质钾浓度低于血清中的钾浓度[28;29]. 因此,血脑屏障的开放可能导致细胞外钾水平的快速升高。钾的快速增加可能会触发急性癫痫发作[三;17;28;29].
最近有报道称,星形胶质细胞通过TGF-β受体介导的途径吸收渗出的白蛋白,进而下调星形胶质细胞内的内向调节钾(Kir 4.1)通道[30]. 钾通道的下调导致钾缓冲能力受损和细胞外钾升高。在这些研究中,在白蛋白暴露几天后观察到了白蛋白诱导的癫痫事件。在我们的研究中,血脑屏障开放后立即记录到癫痫样放电。事实上,在我们的实验中,不需要延迟时间,这可能是由于BBB打开的程度,例如.在我们的实验中是半球形的,而在弗里德曼小组的实验中则是局部的[9]. 然而,这两项研究都证实BBB开放与脑电图活动改变有关,都表明钾是癫痫发作的最终触发因素。
从中枢神经系统到非中枢神经系统癫痫发作和癫痫的机制
非中枢神经系统癫痫发作机制正在被接受。最近证实了外周循环淋巴细胞的激活与癫痫发作的发展之间的联系[18;19;31]. 外周炎症诱导的BBB泄漏导致癫痫发作阈值降低[18;19;21]. 因此,BBB在防止人脑中不必要的电活动方面发挥着重要作用。急性癫痫大鼠和慢性癫痫患者的白蛋白和白细胞外渗模式的相似性表明,这两种疾病的发病机制可能是相似的。
总之,在癫痫动物模型和TLE中,我们发现白细胞脑实质分布不明显。我们的研究结果表明,白细胞渗入实质可能不是急性或慢性癫痫发作的先决条件。
实验程序
啮齿动物
将大鼠置于受控环境中(21±1°C;湿度60%;8AM–8PM照明;食物和水可用随意). 涉及动物及其护理的程序按照符合相关法律和政策(美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》,1996年)的机构指南进行,并得到机构动物护理和利用委员会的批准。
脑电图记录
大约一半的大鼠被植入进行脑电图记录。手术和注射期间持续进行记录(例如。,全麻下),手术完成后1小时内。数字脑电图记录(例如。,皮层电极)使用Pinnacle Technologies 8206型EEG视频记录设备进行,该设备包括一个记录工作站和一个连接到21英寸显示器的审查系统。EEG数据以200 Hz的频率采样。实验结束后进行频谱和尖峰幅度分析。Origin FFT软件与采集系统一起用于数据分析。对于时间联合频率分析和频谱图的准备,我们使用了Diadem(德克萨斯州奥斯汀国家仪器公司)。
BBBD、WBC和Evan’s Blues注射
用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉大鼠(雄性Sprague-Dawley 350-450 g)。我们总共使用了15只老鼠。麻醉后,从胸骨上切迹到下巴下方做一个2-3厘米的垂直切口。暴露胸骨肌后,暴露颈总动脉,并将其与迷走神经尾侧部分分离。暴露颈内动脉和颈外动脉分叉后,在颈外动脉(ECA)的外支周围缠绕一条丝带(3-0,Ethicon,24〃,Ethicon,Sommersville,NJ),同时在颈总动脉(CCA)处放置一个微型灯。显示了手术场的外观。在时间序列中,然后在2-3分钟内执行以下步骤:(1)夹紧CCA;(2) 结扎远端ECA,留下近端约5 mm的残端;(3) 向颈总动脉分叉处逆行将聚乙烯导管(PE-2P)插入颈外动脉;(4) 拧紧导管周围的丝带;(5) 注射高渗甘露醇溶液(盐水中1.4摩尔药丸,0.1 ml/s,总计2 ml);(6) 取出导管,结扎ECA近端残端;以及(7)释放CCA处的夹具。
甘露醇后立即注射含有GFP-WBCs和Evans Blue(确切成分见下文)的溶液通过ICA导管。注射后一小时内处死动物。没有观察到疼痛或不适的迹象,呼吸模式改变或其他与手术引起的损伤一致的行为变化。
GFP-WBC的制备
从供体大鼠身上采集白细胞。简单地说,从用1%异氟醚麻醉的Sprague-Dawley大鼠的腹主动脉中获得血单个核细胞。通过密度梯度离心法(histopaque-1077)制备单核细胞悬浮液(Sigma-Aldrich,ST.Louis,MO)。培养前用台盼蓝确认细胞活力。对细胞进行计数,3-4×109细胞在DMEM中培养24小时,然后用腺GFP病毒载体治疗(克利夫兰诊所马克·佩恩博士实验室)。在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下,将GFP序列克隆到该载体中。用Adeno-GFP载体处理细胞24小时,然后再让其生长24小时。荧光显微镜证实GFP表达。收集细胞并将其悬浮在2%Evans Blue无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶液中,在甘露醇注射后注入颈内动脉(ICA),如下所述。这将允许同时确定BBB泄漏(Evans蓝)和细胞外渗(GFP)的存在。
SE的毛果芸香碱模型
大鼠(雄性Sprague-Dawley 250-300g)注射甲基东莨菪碱(0.5 mg/kg,i.p.,Sigma-Aldrich),30分钟后注射毛果芸香碱(340 mg/kg,Sigma-Aldrich)。通过行为(拉辛量表)和脑电图评估评估癫痫发作和癫痫持续状态的发展。SE后数小时处死大鼠。
大鼠免疫组织化学
过量使用异氟醚处死大鼠。将大脑在pH 7.4的4%多聚甲醛中浸泡固定48小时,然后在20%蔗糖溶液中冷冻过夜,在异戊烷中冷冻,并在−80°C下保存。冠状切片在低温恒温器上切割。然后用生理盐水清洗切片,并将其安装在含有0.1%对苯二胺盐酸盐的Mowiol基安装介质中,并对细胞核进行DAPI染色。使用徕卡共焦激光扫描显微镜检查Evans蓝和GFP-WBC切片。如下所述,对毛果芸香碱大鼠的TLE标本进行CD45染色。
TLE受试者免疫组织化学
根据克利夫兰诊所基金会的机构审查委员会协议和赫尔辛基宣言,所有患者都签署了知情同意书。从8名接受颞叶切除术以缓解耐药性癫痫发作的患者身上获取脑标本(参见). 从手术室到实验室,对组织进行氧合,并在从手术室运输到实验室操作(如固定)的整个过程中保持在4°C。组织被切割成较小的样本,以使固定剂渗透到深层。
使用二氨基联苯胺(DAB)或荧光进行免疫染色以鉴定白细胞(CD45)、IgG和白蛋白。在磷酸盐缓冲液(PBS,1X)中清洗切片,然后用0.3%TWEEN/PBS渗透1小时,并在PBS中冲洗一次5分钟。用0.3%过氧化氢在甲醇中封闭内源性过氧化物20分钟。切片用PBS清洗,然后在5%的山羊血清中孵育1小时。将小鼠单克隆抗人CD45、白细胞共同抗原(1S751)(1;100,Dako,North America,Inc.Real Carpintia,CA)在4°C的摇床中隔夜培养,然后用PBS冲洗3次5分钟,用生物素化抗鼠IgG(1:600)培养1小时。载体实验室(加利福尼亚州伯林盖姆)用0.4%Triton-X制备。也使用人类IgG(1:2000;宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.)对连续脑切片进行IgG染色。随后再次用PBS冲洗。因为用抗生物素进行生物素扩增可以增强反应产物的可视化,所以将切片与抗生物素/生物素复合物(Elite Vectastain ABC试剂盒;Vector Labs,Burlingame,CA)一起孵育1小时。用PBS再冲洗3次后,用DAB(加利福尼亚州伯林盖姆向量实验室过氧化物酶底物试剂盒)观察抗体结合位点。然后将载玻片脱水,并使用Permount溶液安装载玻片。
人脑切片中白蛋白的免疫荧光染色如下。通过在5%山羊血清中封闭,然后用第一抗体、小鼠单克隆抗人白蛋白(1:1000,Sigma,Saint-Louis,MI)和第二抗体异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的亲和驴抗小鼠IgG(1:100,Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)处理相邻的游离漂浮切片.用苏丹黑B阻断自体荧光,最后用带有DAPI(加利福尼亚州伯林盖姆Vector Labs)的Vectashild固定介质将切片覆盖在玻璃载玻片上,并用荧光显微镜进行分析。
白蛋白和白细胞外渗的定量测量
使用徕卡共焦激光扫描显微镜采集图像。细胞使用Phoretix计数,而QCapture软件用于量化与白蛋白脑外渗对应的荧光信号。WBC根据解剖位置分为血管内、血管周围间隙或实质。使用了三个字段/切片(每个条件n=5个切片)。特别是,对于大鼠BBBD,我们使用20X图像计算WBC/血管的数量(例如额叶、颞叶皮质和丘脑)。对于人类TLE,我们使用n=3个切片/患者来量化CD45阳性细胞/场(20倍)的数量().
统计分析
数据表示为平均值±SEM(显著性p<0.05)。双向方差分析用于多个观察结果的比较。使用JMP统计软件进行分析和数据比较。
补充材料
补充图1
人类受试者的BBB渗透性开放与EEG相关:A)我们之前已经描述了BBB中断的致痫效应[三]. 通过颈内动脉皮下股动脉插管到达由前循环供应的脑区(红色箭头,ICA),同时通过椎动脉皮下股动脉插管进入后循环供应的区域(灰色箭头,弗吉尼亚州)。请注意,ICA(而非VA)的中断会影响传感器电机条。A1)通过右侧ICA注射甘露醇导致右颞叶BBB开放和造影剂外渗,而通过向VA注射甘露糖醇打开BBB导致仅限于枕皮质的外渗。B)在人体成功渗透打开过程中获得的代表性痕迹。注意脑电图活动减慢(箭头)在注射甘露醇期间和BBBD后逐渐出现棘波。B1)当显示为时间联合频率图时,心电图变化更明显。注意高振幅信号的出现(红色信号灯)以及BBBD后发作频率的广泛分布。如所示大鼠血脑屏障的破坏导致EEG变化的类似进展。
补充图2
Pilocarpine诱导的SE与血脑屏障渗漏有关,但与实质WBCs无关:A) 注射Evans Blue前立即记录的匹罗卡品SE示例。B) 在硬膜下间隙的软脑膜表面检测到CD45阳性细胞。C) 虽然在急性SE时观察到严重的BBB泄漏(埃文斯蓝渗出表明),但CD45阳性细胞通常在血管间隙中检测到(箭头). 注意BBB毛细血管外实际上没有CD45免疫反应。
致谢
这项工作得到了国家卫生研究所(R01 NS049514和R21HD057256)对DJ的资助。
脚注
出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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