美国国家科学院院刊。2010年8月17日；107(33): 14727–14732.
激活白细胞整合素α对开放式头部构象的要求X（X）β2
,一 ,一 ,a、，1 ,b条 ,b条和a、，2
残雪（Can Xie）
一免疫疾病研究所、波士顿儿童医院和病理科
李宗礼
b条马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学研究所和细胞生物学系，邮编02115
托马斯·沃尔兹
b条马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学研究所和细胞生物学系，邮编02115
蒂莫西·斯普林格
一免疫疾病研究所、波士顿儿童医院和病理科
一免疫疾病研究所、波士顿儿童医院和病理科
b条马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学研究所和细胞生物学系，邮编02115
Timothy A.Springer撰稿，2010年6月18日（2010年4月24日送审稿）
作者贡献：X.C.和T.A.S.设计的研究；X.C.、C.X.、N.N.和Z.L.进行了研究和分析数据；X.C.、T.W.和T.A.S.撰写了这篇论文。
1现住址：日本东京113-0033文桥区弘澳东京大学。
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指南：506英尺1c-AE95-48EE-A918-91ED9248684B
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摘要
阴性染色电镜（EM）和粘附试验表明X（X）β2整合素激活需要打开头部和伸展。β的延伸诱导Fab2腿部，结合代表性激活和抑制Fabs，检查其对开放式和封闭式头部构象之间平衡的影响。两个激活的Fab稳定了开放式耳机的构造。相反，两种不同的抑制Fab稳定了封闭的头戴式构象。粘附试验显示X（X）β2在扩张头盖构象中，配体的亲和力较高，而弯曲构象和扩张闭合头盖构像均表现为低亲和力状态。中间整合素亲和力似乎不是来自单一构象状态，而是来自平衡构象状态的混合物。
整合素是αβ异二聚体、细胞表面粘附受体的一个主要家族，可双向跨膜传递化学信号和机械力(1). 整合素α和β亚单位均为I型跨膜蛋白，具有大的N端胞外结构域、单跨跨膜结构域和通常短的C端细胞质结构域(). β2整合素亚家族，αD类β2, αM（M）β2（CR3，Mac-1），αL（左）β2（LFA-1）和αX（X）β2（CR4，p150，95）仅在白细胞上表达。所有β2整合素在α亚基中包含一个插入的I结构域，即配体结合结构域。头部包括α-亚基β-螺旋桨和αI结构域，以及β-亚单位βI结构域(). 大腿由α-亚基大腿结构域、β-亚基PSI、杂种和I-EGF1结构域组成。头部和大腿一起被称为头部。小腿包括α-亚基calf-1和calf-2结构域，以及β-亚基I-EGF结构域2-4和β-尾结构域().
整合素构象状态与α的制备x个β2–Fab复合体。(一–C类)整合素三种构象状态示意图(D类)α的示意图x个β2本研究中使用的外结构域构造。(E类和F类)α的带状图x个β2伸缩式封头中的外畴(E类)和加长头戴式耳机(F类)构象。球体显示了表位映射到的残基的Cα原子。表位标记在头戴式构象中，本研究发现单克隆抗体对其具有特异性。模型基于弯曲αx个β2晶体结构(4)和打开αIIb类β三耳机(13). (G公司和H（H）)Superdex 200尺寸排除色谱图x个β2在指定Fab缺席和在场的情况下。
αI-less外畴的晶体结构(2,三)和含有αI的整合素(4)显示出弯曲的构造，其中较低的α和β腿向后折叠以抵住头部和大腿(). 据信，弯曲构象代表生理上的低亲和力状态，而在激活过程中，整合素以开关叶片样的运动延伸(5–9). αI-less整合素的EM图像V（V）β三，经Mn活化后呈扩展构象2+或配体结合(6).
多年来，已经开发出一系列单克隆抗体，可以抑制、诱导或报告β2细胞表面的整合素激活。因此，将单克隆抗体对完整细胞的功能作用与其对EM揭示的整合素构象变化的影响联系起来，为研究整合素活化机制提供了一种强有力的方法。与埋藏在弯曲构象中的表位结合的单克隆抗体可以诱导延伸，如CBR LFA-1/2 Fab到I-EGF3；或报告扩展，如KIM127 Fab至I-EGF2(5,8,10). 伸展后，观察到两种头部形态：闭合，就像弯曲时一样()和开放，混合域已推出() (6,8).
由于配体结合诱导并稳定了开放式头盖构象，因此人们普遍认为开放式头头构象是对配体具有高亲和力的活化状态(6,11–13). 此外，稳定开放式头部构象的突变激活配体结合(14,15). 然而，直接证据表明，封闭式头部的延伸构造具有不同的功能作用()以及与开放式头部的延伸构造()此外，关于弯曲的低亲和力状态和激活的高亲和力状态之间的中间亲和力状态有很多猜测。在迁移T淋巴细胞的前沿，通过暴露不同的单克隆抗体表位，LFA-1的不同群体被定义为处于中间亲和状态(16). T细胞表面LFA-1的横向迁移率测量表明，LFA-1处于中间构象状态，具有明显的扩散轮廓(17). 体外流动室实验表明，固定化趋化因子可以诱导LFA-1对淋巴细胞的中等亲和力(18). 此外，根据抗体和金属离子对高亲和性配体ICAM-1和低亲和性配体ICAM-3结合的不同影响，提出了LFA-1的不同亲和性和构象状态(19–22). 然而，目前尚不清楚哪个构象状态对应于观察到的中间亲和力，以及扩口闭合头戴式构象代表的亲和力状态。最后，弯曲构象、延伸闭合头带构象和延伸开放头带构象的粘附性从未被比较过任何整合素。
我们在此研究了代表性激活和抑制Fabs对头盖结构和α功能的影响X（X）β2整合素。结果表明，在没有头部开口的情况下延伸不足以激活整合素，并且α需要打开的头部构象X（X）β2整合素激活。
结果
我们使用了一种先前描述的、分泌的、生理相关的αX（X）β2外结构域构造(4,8). 该结构包含附加到α和β亚基C末端的ACID/BASE螺旋线圈(). 线圈扣模拟了完整整合素中α和β亚单位跨膜和细胞质域之间的联系(). 下面，我们描述这个α的构象X（X）β2单独或与CBR LFA-1/2 Fab复合以诱导延伸，并与第二Fab复合，以测试对头部构造的影响。纯化αX（X）β2蛋白质与多余的Fabs孵育，复合物通过Superdex 200色谱分离()并立即用甲酸铀酰进行阴性染色(图S1一–D类) (23). 交互拾取了2000到6000个粒子，并进行了多参考比对K（K）-指指定50个类别的分类(图S2一–F类). 下面表示的每种构象中的粒子百分比是通过将给定构象的每类粒子相加并除以粒子总数来估算的。正文中显示了人口最多、结构细节最多的类。在没有Fab的情况下，95%以上的粒子采用相同的弯曲构象(和图S2一)如前面的α所示X（X）β2新兴市场(8)和晶体结构(4). 整合素αX（X）β2与CBR LFA-1/2 Fab采用扩展构象的复合物(和图S2B类)，如前所述(8). 观察到两种不同的头戴式结构，闭合和开放，比例相等(). 具有闭合头部构造的粒子的腿可以是平行的(第1行）或交叉(第2行）。具有开放式头部构造的粒子腿分开(第3行）。
α的代表类平均值x个β2单独，αx个β2带CBR LFA-1/2和αx个β2CBR LFA-1/2和MEM148 Fabs。(一)α的类平均值x个β2独自一人。大多数粒子呈弯曲构象。(B类)α的类平均值x个β2–CBR LFA-1/2复合体。粒子大多采用延伸构象，其中头部用平行的腿闭合（第1行），用交叉的腿封闭（第2行），或开放（第3行）。(C类)α的类平均值x个β2与CBR LFA-1/2和MEM148 Fabs复合。大约70%的颗粒是与两种Fab的复合物，这两种Fabs完全采用加长型头戴式构造（第1行）。其余30%的粒子是仅含α的粒子x个β2–CBR LFA-1/2 Fab，其表现出完全相同的构象状态（第2、3和4行），分别如第1、2和3行所示B类。在每组班级平均数的右侧，卡通显示了领域安排和Fab位置。（比例尺，10纳米。）
MEM148是一种激活依赖性单克隆抗体，其表位映射到β2面向α亚单位的杂交结构域，即杂交结构域的内表面(). MEM148已被用于激活β2整合素和/或报告活化构象(21,24). αX（X）β2与仅含CBR LFA-1/2 Fab的复合物相比，CBR LFA-1/2 Fab和MEM148 Fab在凝胶过滤中提早洗脱(). 大约70%的颗粒是与两种Fab复合的整合素(第1行）。MEM148绑定到杂交结构域的内侧，靠近其与βI结构域的接合处(第1行），与表位到Pro-374的映射非常一致(). 重要的是，所有与MEM148结合的颗粒都采用了开放的头片构象(第1行和图S2C类).
其余30%的颗粒产生的平均等级仅包含CBR LFA-1/2 Fab(第2-4行和图S2C类). 在制备EM的过程中，Fab与配合物分离并不罕见。这可能发生在凝胶过滤中的配合物与游离Fab分离过程中，也可能发生在EM网格制备之前或期间。类似于α的制备X（X）β2–CBR LFA-1/2综合体如所示，含有CBR LFA-1/2 Fab且不含MEM148 Fab的颗粒比例大致相等，采用了闭合（14%）和开放（16%）的头盖构象(第2–4行）。对于头部闭合的粒子，两条腿要么平行(第2行）或交叉(第3行），与αX（X）β2–CBR LFA-1/2 Fab准备(第1-2行）。无MEM148且含有CBR LFA-1/2 Fab的开放式头部构造颗粒(第4行）也与αX（X）β2–CBR LFA-1/2 Fab准备(第3行）。因此，不含MEM148的颗粒可作为内部控制，并证明在含有MEM148颗粒中仅存在开放式头部是结合MEM148 Fab的特定结果。
单抗7E4也与β结合2杂交结构域，但与MEM148相反是抑制性的(25,26). 7E4与残基Val-385结合，残基位于与βI结构域的界面上杂交结构域外表面上的一个环上(). 在与CBR LFA-1/2和MEM148 Fabs络合物类似的位置洗脱带有CBR LFA-1/2和7E4 Fabs的络合物(). 然而，具有CBR LFA-1/2和7E4的复合体仅假设了延伸闭合的头部构造(和图S2D类). 7E4 Fab绑定到远离α的混合区外表面X（X）亚单位，与表位映射一致(). 综合体的两条腿要么是平行的(第1行）或交叉(第2行）。未观察到7E4 Fab的显著分离（小于5%）(图S2D类).
α的代表类平均值x个β2与CBR LFA-1/2和7E4 Fabs复合。颗粒大多采用伸缩式封头构造。腿部构象要么平行（第1行）要么交叉（第2行）。在每组班级平均数的右侧，卡通显示了领域安排和Fab位置。（比例尺，10 nm。）
m24是一种与βI结构域结合的活化报告单克隆抗体(27,28). m24的表位定位于βI特异性决定环（Glu-175）和α1-螺旋（Arg-122）中的残基，靠近α-亚单位界面的βI MIDAS(). 同时含有CBR LFA-1/2和m24的络合物比仅含CBR LFA-1/2的络合物提早洗脱(). α凝胶过滤X（X）β2在没有CBR LFA-1/2的情况下加上m24 Fab，表明绝大多数αX（X）β2在洗脱位置未移动；然而，路肩可能表示少量复杂的构造(). 班级平均成绩(图S2E类)包含结合到α的m24和CBR LFA-1/2 FabX（X）β2独家展示了加长型耳机构造(第1行）。m24 Fab结合到邻近αI结构域的βI结构域表面，与表位定位非常一致(). 约24%的颗粒中观察到m24解离。这些粒子表现出接近相等比例的闭合和开放式头部构象(第2行和第3行），与α的结果一致X（X）β2–CBR LFA-1/2 Fab准备().
α的代表类平均值x个β2与CBR LFA-1/2和m24 Fabs复合。大约76%的颗粒含有两种Fab，它们都具有延伸的头部构造（第1行）。其余24%的颗粒仅含有CBR LFA-1/2 Fab（第2行和第3行）。在每组班级平均数的右边，卡通显示了领域排列和Fab的位置。（比例尺，10 nm。）
TS1/18与βI结构域结合，但与m24相比，变构抑制β2整合素激活(27,29). 表位映射到βI结构域（Arg-133和Gln-332）的α1和α7-螺旋中相邻的残基(). α的形成X（X）β2通过凝胶过滤证实了CBR LFA-1/2和TS1/18的复合物(). TS1/18也与α结合X（X）β2在不存在CBR LFA-1/2的情况下，如复合物比α更早洗脱所示X（X）β2独自一人(). 班级平均成绩仅显示了延长的封闭式耳机构造(和图S2F类). 未观察到CBR LFA-1/2 Fab的显著分离。TS1/18 Fab结合到αI结构域附近的βI结构域。αI结构域和TS1/18 Fab之间的空间略大于m24 Fab（相比之下第1行和)与TS1/18与α1-螺旋（Arg-133）中残基的结合相一致，与m24结合的α1-螺旋中残基相比，其C末端更多。与7E4不同，TS1/18仅观察到交叉腿构象。
α的代表性类平均值x个β2与CBR LFA-1/2和TS1/18 Fabs复合。颗粒大多采用伸缩式封头构造。粒子只表现出交叉腿的构象。在班级平均水平的右侧，卡通显示了领域安排和Fab位置。（比例尺，10 nm。）
最后，我们比较了α的粘附性X（X）β2Fabs稳定的不同构象。纯化αX（X）β2用兔抗酸性/碱性卷曲线圈的多克隆抗尼龙粘扣抗体将蛋白质捕获在塑料板上。捕获的αX（X）β2然后与EM中使用的相同单个Fab和成对Fab孵育。用iC3b调理羊红细胞测量配体结合(). αX（X）β2在没有刺激的情况下，仅显示背景与iC3b结合，证实弯曲构象亲和力低(). αX（X）β2用2 mM锰活化2+与E-IgM-iC3b强结合(). αX（X）β2–CBR LFA-1/2复合物显示出与E-IgM-iC3b的显著结合，尽管低于αX（X）β2单位：Mn2+(). 如所示，αX（X）β2–CBR LFA-1/2复合物是延长开放式头戴和延长封闭式头戴构象的混合物。αX（X）β2含有CBR LFA-1/2和MEM148，或CBR LFA-1/2和m24的配合物显示E-IgM-iC3b结合率最高(). 在这两种条件下，αX（X）β2EM发现其处于加长型耳机构造中(和). 相比之下，αX（X）β2含有CBR LFA-1/2和7E4 Fabs或CBR LFA-1/2和TS1/18 Fabs的复合物的粘附性显著低于αX（X）β2–CBR LFA-1/2综合体(). 这些结果表明，延伸本身不足以实现高亲和力，并且延伸的开放式头带构象是激活的高亲和力状态。因此，粘附性水平与延伸整合素与开放头戴构象的比例相关。
E-IgM-iC3b结合试验。(一)E-IgM-iC3b与α的结合x个β2使用EM.Mn中使用的相同Fab组合2+（1 mM）作为阳性对照。*，P（P）< 0.01. (B类)在CBR LFA-1/2 Fab存在的情况下，TS1/18 Fab浓度对结合的影响。(C类)单个Fab对E-IgM-iC3b结合的影响。~255个单元格/mm的背景绑定2已经减去了E-IgM-iC3b与BSA阻断的表面的结合。
我们很好奇E-IgM-iC3b的结合率高于αX（X）β2与CBR LFA-1/2和TS1/18或7E4 Fabs孵育，而不是αX（X）β2没有刺激。这可以通过E-IgM-iC3b与扩展闭合α结合来解释X（X）β2与TS1/18 Fab结合，表明扩闭式头戴构象可能具有中等亲和力。或者，E-IgM-iC3b可能会与TS1/18 Fab竞争，并稳定与扩展开放式耳机构造的结合。如果这是真的，那么扩展的封闭式耳机构造将代表低亲和力状态。为了区分这些替代品，我们改变了TS1/18 Fab的浓度，同时将CBR LFA-1/2的浓度保持在10μg/mL。随着TS1/18 Fab浓度的增加，E-IgM-iC3b的结合呈剂量依赖性降低，直到达到类似于弯曲构象中非模拟控制的水平(). 这些结果表明，延伸的封闭头状构象与弯曲构象类似，对配体的亲和力较低。
我们还研究了Fabs如何单独影响α的粘附性X（X）β2(). α的孵化X（X）β2使用MEM148不会增加E-IgM-iC3b的结合，这与凝胶过滤结果一致，表明MEM148不与α结合X（X）β2不存在CBR LFA-1/2(). 尽管绝大多数αX（X）β2未与m24结合，肩部洗脱早于αX（X）β2()可能与少量络合物形成相对应，并与m24单独对配体结合的轻微增强有关(). KIM127，一种已知的扩展报告单克隆抗体，只能与扩展α结合X（X）β2(5,8)，E-IgM-iC3b结合无明显增加。凝胶过滤表明7E4和TS1/18能够与α结合X（X）β2在没有CBR LFA-1/2的情况下；αX（X）β2–7E4络合物和αX（X）β2–TS1/18在α之前洗脱X（X）β2独自一人(). αX（X）β2与抑制性7E4和TS1/18 Fab孵育后，仅显示E-IgM-iC3b的背景结合().
讨论
αI-less整合素αV（V）β三和αI整合素αX（X）β2显示了三种总体构象状态：一种是带有闭合头片的弯曲构象（弯曲），一种是具有闭合头片（伸展、闭合）的伸展构象，另一种是带开放头片的伸展构像（伸展、开放）(2,6,8). 延长的开放构象被推断为具有高亲和力，因为配体结合诱导头部开放(6,11–13)与关闭的耳机相比，稳定打开的耳机的突变正在激活(14,15,30). 然而，延伸-闭合构象的亲和状态尚不清楚。
过去30年产生的整合素单克隆抗体是一种宝贵的资源，因为它们对完整细胞上整合素功能的影响具有很好的特征(31). 以前，我们使用了抗体CBR LFA-1/2和KIM127，它们与较低的β2腿部显示延伸与β密切相关2整合素激活(8). 在这里，我们通过对整合素头戴的激活和抑制单克隆抗体，探讨了延长-闭合和延长-开放构象的相对重要性。这些抗体识别整合素头带中两个结构域的表位，这两个结构域在开放和闭合构象、βI和杂交结构域之间发生形状变化。
我们在本研究中使用CBR LFA-1/2诱导整合素延伸。CBR LFA-1/2的表位位于I-EGF3结构域，以弯曲构象埋藏在与杂交结构域的界面中，但在整合素延伸时暴露() (4,5). CBR LFA-1/2结合扩展开放构象和扩展闭合构象，并与定向到杂交和βI结构域的激活相关抗体和抑制抗体的结合相容。
此处使用的C端子线圈卡环是为了模拟自然α中施加的约束X（X）β2通过结合α和β亚基跨膜结构域。四个αX（X）β2先前在阴性染色EM中比较了带有不同C端卡环的外结构域(4). 当C端螺旋线圈存在时，如本文所研究的构造，所有粒子都处于弯曲构象；然而，Fabs或其他试剂很容易诱导延伸(4,8).
两种激活相关抗体与开放式耳机结合，而不是与封闭式耳机结合。MEM148是LFA-1在完整细胞上激活的报告者，与镁结合可以增强LFA-1的粘附性2+/乙二胺四乙酸(21,24). 该抗体与杂交结构域内表面上的Pro-374结合，即与α-亚单位β-螺旋桨结构域最接近的表面(21) (). 该残基位于混合结构域中的两条β链之间的环中，在头部打开时不会发生构象变化(三,13). EM类平均值表明，MEM148 Fab占据了β2杂交结构域与αX（X）开放式头部构造中的β-螺旋桨和大腿区域。似乎在关闭的耳机中()，这些域之间没有足够的空间供MEM148 Fab结合。MEM148没有结合到弯曲αX（X）β2，与研究表明在α的弯曲构象中存在闭合头带的结果一致X（X）β2(4). m24也是β的记者2整合素激活，广泛用于检测完整细胞上的高亲和力LFA-1(16,32,33). m24与MIDAS附近和βI结构域中的残基结合，包括Arg-122和Glu-175() (27). Arg-122位于α1-螺旋中，其中包括结合MIDAS和ADMIDAS金属离子的残基，并向开放构象移动。这些残基在开放式和封闭式顶盖以及弯曲整合素构象中都能很好地暴露于溶剂中(4). 因此，m24对开放式头部构象的绝对选择性必须反映其表位构象的特异性，即这些残基的确切形状和Fab结合的周围区域，这是开放式头部所特有的。与弯曲α结合的m24缺乏或很少X（X）β2再次与弯曲α的证据一致X（X）β2有一个封闭的耳机(4).
两种抑制性抗体对封闭头戴式构象具有完全特异性。7E4抑制完整细胞上LFA-1的激活，并能消除佛波酯或活化的单抗KIM185，β2整合素介导的细胞粘附(26,34). 7E4识别与βI域接口相邻的混合域循环中的Val-385() (26). Val-385及其周围区域在弯曲、延伸-闭合和延伸-开放整合素构象中很好地暴露于溶剂中(4). 然而，Val-385位于与βI结构域界面的混合结构域的一个环中，并且在混合结构域向外摆动到开放构象时被完全重塑。7E4可能与弯曲α结合X（X）β2，与α的弯曲构象中存在的封闭头罩一致X（X）β2(4). TS1/18也阻断β2完整细胞上的整合素激活(27,35). 该单克隆抗体与βI结构域中α1-和α7-螺旋上的残基结合() (27,29). 尽管TS1/18识别的残基暴露在开放和封闭的头罩中，以及弯曲的整合素构象中(4)，这些残留物的处置在形状向开放式头部移动时发生了显著变化(13); 解释了TS1/18对封闭式头部构造的特殊性。TS1/18可与弯曲α结合X（X）β2众所周知，它的头戴式耳机是封闭的(4).
结合之前对完整细胞上四种抗体的功能研究，EM结果表明，当细胞表面的整合素具有开放的头戴时，粘附被激活，当细胞曲面上的整合蛋白具有封闭的头戴，粘附被抑制。此外，我们将抗体对EM中头部构象的影响与其对E-IgM-iC3b与相同α结合的功能影响联系起来X（X）β2构造。α的扩开构象X（X）β2结合iC3b，而α的bent-close和extended-close构象X（X）β2没有结合配体。
在功能分析中，整合素的构象状态不仅受特定头部构象的抗体的存在影响，还受配体的存在影响。众所周知，配体结合可以稳定整合素α的开放头戴状态V（V）β三, αIIb类β三、和α5β1(6,11–13). 存在针对开放式耳机的抗体，配体与α结合X（X）β2有望通过延长开放构象来稳定和加强活化状态。当αX（X）β2在延长-闭合构象中稳定，配体的存在预计会与抑制性Fab竞争，以利于开放的头戴式构象。我们发现了在配体存在的情况下需要更高浓度的抑制性Fab的证据。因此，与EM实验相比，根据完全抑制所需的浓度推断，在iC3b结合分析中，需要更高浓度的TS1/18 Fab才能保持闭合的头部构象。
我们的研究表明，扩展的αX（X）β2带封闭式耳机并不代表中间亲和状态。使用适当的TS1/18 Fab浓度表明，延伸的闭合整合素不与配体结合，并且在其对配体的低亲和力方面与弯曲构象没有区别。
我们的结果定义了整合素α的三个主要构象态的亲和态X（X）β2开放式和封闭式头戴分别对配体具有高亲和力和低亲和力。虽然扩合构象在本构和扩开构象之间是构象的中间产物，但在亲和力方面不是中间产物。与弯曲闭合构象一样，延伸闭合构象对配体的亲和力较低。然而，观察到的整合素在细胞表面的亲和力或粘附性将反映整合素处于每个特定构象状态的比例。因此，我们的数据表明，伸展闭合构象仅作为弯曲构象和伸展开放构象之间的构象转换状态。
我们的数据表明，在文献中观察到的相关β2整合素LFA-1(16–20)不一定来自单个构象状态，而是可能来自构象状态的混合。先前的研究表明，与ICAM-1相比，LFA-1与ICAM-3结合需要更多的活化剂，如所需的活化剂数量所定义(19–21). 研究表明，Mg/EGTA足以激活与ICAM-1的结合，但ICAM-3需要额外的活化单克隆抗体。进一步的实验表明，一个LFA-1突变体（D790R）可以与ICAM-1结合，但不能与ICAM-3结合(22). 这些结果被解释为支持LFA-1的扩展-闭合构象具有中间亲和力的假设。然而，LFA-1在与ICAM-1结合后的构象在这些实验中没有定义。关于α的结果X（X）β2提出了另一种解释，即ICAM-1配体的存在使平衡向扩展开放构象转移，ICAM-3的亲和力不足以将平衡转移到开放的头部，因此需要额外的活化剂来结合ICAM-3。
有趣的是，之前已经发现杂交结构域的7E4抗体可以抑制由作用于βI结构域远端但不直接作用于该结构域的药物刺激的粘附性(26). 这里，激活αX（X）β2在CBR LFA-1/2 Fab的远端诱导下，7E4和TS1/18均能稳定EM中封闭的头盖构象，并消除与iC3b的粘附性。镁的能力2+/EGTA和aβ2N351S突变，两者都作用于βI结构域(26,36)，通过7E4绕过抑制(26)表明βI结构域的开放构象，如βI结构区中金属结合位点的构象所定义的，可以从混合结构域摆动所定义的头部开放构象中解耦。已经观察到β的这种解耦三整合素。浸入晶体中的类配体拮抗剂可以诱导金属和配体结合位点周围的βI结构域环发生实质性重塑，即使杂合结构域摆动被晶格接触所阻止(13,37). 此外，β2整合素，α的突变L（左）I域可以解偶联αL（左）I域从β开放2I域名开放(27). 换言之，存在将杂交结构域摆动耦合到βI结构域高亲和力状态的构象平衡，以及将βI结构区的高亲和力态耦合到αI结构域的高亲和力状态的构型平衡。这个耦合平衡和构象变化系统一端的能量输入应该可以预测地流向另一端。然而，当能量在系统中的两个位置输入时，这两个位置倾向于相反的构象状态，可能会出现高能状态，而存在的构象态不与低能状态共存，如上述示例所述。因此，尽管我们的研究表明整合素α的头部处于闭合状态X（X）β2耦合到α的低亲和力状态X（X）在我看来，必须始终记住，耦合不是绝对的，而是通过平衡的。
αX（X）β2通过α结合配体X（X）I域(38). 孤立整合素αI结构域的结构显示出三种构象状态，称为闭合、中间和开放(1). 尽管α的构象状态X（X）在我们的EM实验中无法解析I域，我们的泛函和EM结果表明αX（X）配体的I域和头部的闭合和开放状态。最近观察到的αI和β-螺旋桨区域之间的柔性界面X（X）β2表明αI结构域的中间态和开放态都与开放的头部构象相兼容(4). 目前，假设在头部打开的情况下，αI结构域在没有配体结合的情况下主要处于中间构象，在存在配体结合时主要处于开放构象。迄今为止，还没有机制通过内-外信号在三种不同状态下稳定αI结构域，因为只知道耳机的两种构象状态。对LFA-1的进一步研究对于证明αX（X）β2可以扩展到αL（左）β2此外，激活状态下αI整合素的X射线晶体学研究对于进一步解决αI结构域构象状态与头部之间的耦合非常重要。
材料和方法
蛋白质制备。
可溶性α的构建与纯化X（X）β2包含TEV蛋白酶位点、ACID/BASE卷曲线圈、Strep-II和His6标记的胞外域如前所述(8). 小鼠单克隆抗体CBR LFA-1/2(10)，KIM127(39)和TS1/18(40)前面已经描述过。MEM148型(24)，7E4型(41)和m24(32)分别来自瓦茨拉夫·霍雷西（捷克布拉格查尔斯大学）、卡尔·加姆伯格（芬兰赫尔辛基大学）和南希·霍格（英国伦敦研究所癌症研究所）的慷慨礼物。用蛋白a柱纯化IgG。使用Pierce Fab制备试剂盒（Pierce Chemical），用珠固定化木瓜蛋白酶制备Fab片段(8).
整合素-Fab复合物的阴性染色电镜。
制备整合素-Fab复合物，αX（X）β2（0.2μg/mL）与每种Fab的六倍摩尔过量量（0.25μg/mL2，1.0 mM氯化镁2). 峰组分被吸附到辉光碳涂层铜格栅上，用甲酸铀酰染色，低剂量图像由FEI Tecnai 12电子显微镜在120 kV和67000倍标称放大率下使用–1.5μm的离焦获得。
使用SPIDER和EMAN进行图像处理。在EMAN中使用BOXER交互式收集每个样品的2000–6000个粒子(42)并使用SPIDER进行多参考对准和分类(43). 该过程与前面描述的过程相似(8)进行了一些更改，以提高分类和对齐的准确性以及类平均值的质量。简而言之，拾取的粒子的坐标被转换为SPIDER格式，并在窗口粒子中使用，以创建装箱的图像堆栈。堆栈中的每个图像均归一化为平均强度0和SD 50。标准化图像经过10次中心化、多元统计分析、，K（K）-表示分类、类平均和多引用对齐，类平均值用作下一次迭代中多引用对齐的输入引用。在K（K）-采用分类步骤，随机选取种子。在多参考对准步骤中，使用组合平移和旋转搜索来对准粒子。
E-IgM-iC3b粘附测定。
用抗Forssman IgM和C5缺乏的人补体致敏羊红细胞(44). 在4°C下用50μL的5μg/mL兔多克隆抗尼龙搭扣（ACID/BASE线圈）抗体在微量板孔上涂布过夜(45)在PBS中用1%热处理过的BSA封闭X（X）β2在20°C下添加2 h。三次洗涤后，50μL Fabs（10μg/mL）或MnCl2在37°C下添加（2.0 mM）30 min。然后混合E-IgM-iC3b（50μL），并在37°C下培养平板1 h。轻轻旋转缓冲液并翻转平板，去除未结合的红细胞，然后用HBSS/15 mM hepes（pH 7.3/1 mM MgCl）洗涤两次2/1 mM氯化钙2结合的E-IgM-iC3b通过DIC显微镜成像，并使用来自美国国立卫生研究院的ImageJ版本1.41计数。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款AI72765的支持。X.C.是辉瑞生命科学研究基金会的研究员。T.W.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
工具书类
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