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核酸研究。2010年8月；38（14）：e144。
2010年5月19日在线发布。 数字对象标识：10.1093/nar/gkq409
预防性维修识别码：项目经理2919731
PMID：20484377

使用显微镜载台Nickel-63微辐照器实时观察DNA双链断裂反应

真曹,1,2 温迪·库恩,1,三 詹妮弗·斯蒂布,4 马克·默克利,1 周云峰,2 吉里·贾纳塔,4和威廉·戴南1,*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

真核细胞在电离辐射照射后几秒钟内开始聚集离散的核质修复病灶。该组件的实时成像有可能进一步了解医疗和环境辐射暴露的影响。在这里，我们描述了一种微辐照系统，该系统可在不需要专门设施的情况下，将电离辐射定向传递给单个细胞。该系统由一个直径为25微米的电镀Nickel-63电极组成，电极封装在玻璃毛细管中，安装在微操作器中。由于β辐射的能量低，尖端的同位素总量很小，因此可以在最低限度的预防措施下安全操作该设备。我们演示了该系统用于实时跟踪活U2OS人骨肉瘤细胞中单个修复病灶的组装。结果表明，在暴露后约30分钟达到稳定水平之前，有一部分病灶迅速出现和消失。如果没有实时观察，这部分病灶是不明显的。与标准生物医学实验室兼容的微辐射系统的开发扩大了电离辐射生物效应实时研究的潜力。

简介

电离辐射通过沿离散的纳米级轨迹沉积能量，以独特的方式影响活组织。当一条轨道与DNA相交时，两条DNA链上的损伤可能同时发生，导致染色体彻底断裂。即使一次这样的突变也会导致慢性遗传不稳定或癌症相关基因重排。因此，电离辐射引发复杂的生物防御和修复机制就不足为奇了。辐射反应的一个中心方面是核质修复灶的自组装，其特征是特定组蛋白修饰、DNA损伤传感和信号转导蛋白的积累以及DNA修复机器本身从预先存在的成分中的组装。修复病灶在照射后不久开始出现，并在几个小时内消退(1,2)

激发这种辐射反应的传统方法需要将细胞或组织置于辐射源附近。这些“离线”方法需要将样品从辐照器物理转移到显微镜台上进行观察，这就排除了实时观察修复病灶的早期组装。此外，实验室辐照最常用的方法之一需要高活性137CsCl公司2来源。这些来源面临越来越多的限制，因为在发生事故或袭击时，它们被视为对公共健康和安全的威胁(三). 使用少量同位素的廉价替代技术将解决这一问题。

解决传统辐照方法缺点的一种方法是在显微镜台上靠近样品放置一个小型放射性同位素源。这种方法的第一个例子是使用涂有钋的钨微针向活细胞输送α粒子(4). 最近，Steeb等。(5)描述了基于在玻璃毛细管包裹的微电极上电镀同位素沉积的微辐照器概念的更新版本。重要的是，微电极的直径与哺乳动物细胞的大小顺序相同。同位素在这个小区域内的集中沉积允许高的局部辐射通量（106–109Bq/厘米2))使用亚纳米量级的同位素。此外，电镀表面可以嵌入毛细管中，这使得玻璃壁可以充当光束的准直器(5). 该概念是使用63镍，一种长寿命的低能β粒子发射器。在水中或组织中的最大发射范围仅为~60µm，这使得用户可以在没有特殊放射性预防措施的情况下操作设备。

在这里，我们描述了63生物应用中的镍微辐射器。我们将该设备安装在反褶积显微镜台上的微操作器中，并用它照射培养的人类细胞。用荧光标记53BP1的表达构建物转染细胞，53BP1是DNA双链断裂修复灶的一种广泛使用的标记物(6,7)]. 我们收集了实时图像数据，从而能够定量描述这些病灶的出现、消失和运动。初步研究表明，不均匀的形成速率和分辨率，这是使用常规离线辐射源无法观测到的。

材料和方法

微辐照器

微辐照器的制造如所述(5)修改如下。63Ni是一种低能β粒子发射体（最大能量67 keV，平均能量17 keV），半衰期为100年。水中β粒子发射的最大范围为60μm（平均范围为30μm）。将25-μm铂丝穿过孔径为0.5-cm的硼硅酸盐玻璃毛细管，该毛细管采用火焰密封，并在800°C的玻璃电极拉拔装置中拉拔，拉拔长度为3cm。将玻璃中拉拔铂丝的末端抛光，以形成光滑的圆盘。清洁后，使用50 mCi对电极进行电化学电镀63氯化镍2(1.6 × 1013Bq/g）来源（美国纽约州格兰德岛NRD LLC）。通过添加NiSO，将该电源转换为伪瓦茨槽4和H三BO公司4以获得最佳镍沉积。沉积Pt表面，并通过恒定电位（−0.75 V）进行监测，直到通过充足的电荷（10−4C） 表示63镍镀在表面上，略微延伸到毛细管上方。之后63镍沉积，沉积了微米级的聚（3,4-亚乙基二氧噻吩）（PEDOT），以确保镍不会与细胞介质相互作用。将0.1-mM PEDOT溶液在乙腈中的1mM四乙基高氯酸铵中溶解20 s，温度为0.25V。通过液体闪烁计数测量，微辐射器的总活度为2000 Bq。每次使用后都要清洗微辐射器，并将其储存在清洁剂溶液中。

报告质粒

从open Biosystems（美国亚利桑那州亨茨维尔）购买了含有人类全长53BP1开放阅读框（ORF；位点登录号BC112161）的PCR-XL-TOPO载体。用KpnI和XhoI消化后释放53BP1 ORF以及上游和下游非翻译区（UTR）。受体载体pENTR/D-TOPO（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）首先通过插入XhoI/KpnI多聚体进行修饰，并在这两个位点之间插入53BP1编码片段。为了删除不需要的5′-UTR序列，使用引物d（GGCGCTGAGAGAGACCCTACTGGAGT）和d（GGC GCATATGCACAGTTTTCC）扩增53BP1 ORF的520 nt N末端片段，用XhoI和NdeI消化以产生内聚末端，并替换天然cDNA中相应的XhoI–NdeI片段，产生无启动子pENTR/53BP1载体。为了插入N-末端荧光标签，使用引物d（GGCGGCGGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG）和d（GCGCTCGAGCTTGTACAGCTCGTCCATGC）扩增EYFP编码序列以及侧翼Kozak结果序列。用NotI和XhoI裂解产物，并插入pENTR/53BP1的NotI和XIHOI位点之间，在53BP1 ORF的上游和框架中。在CMV启动子/增强子的控制下，使用噬菌体λ重组酶将得到的构建物转移到pcDNA-DEST40（Invitrogen）中用于哺乳动物表达。表达式构造的完整序列在中提供补充数据.

细胞和电穿孔条件

U2OS 2-6-3电池(8)维持在补充有GlutaMAX-1（Invitrogen）、10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100µg/ml链霉素和0.25µg/ml两性霉素B的高糖DMEM中。使用3µg质粒DNA和40µg剪切的鲑鱼精子DNA载体（美国得克萨斯州奥斯汀市Ambion）进行电穿孔使用基因脉冲器II（BioRad，Hercules，CA，USA）。在含有120µl培养基的0.4-cm比色皿中进行电穿孔，设置为170 V和975µF，时间常数为60-90 ms。电穿孔后，将细胞接种到玻璃底培养皿（MatTek，Ashland，MA，USA）中，并在37°C下培养以允许蛋白质表达。电穿孔后24–48小时进行放射和成像。

常规γ射线照射和细胞成像

用编码EYFP-53BP1和H2B-diHcRed（核标记物）的质粒电穿孔细胞(9). 使用自给式137Cs辐照器（Gammacell 40 Exactor，MDS Nordion，Ottawa，ON，Canada），剂量率为0.84 Gy/min，然后转移到Applied Precision Deltavision显微镜的WeatherStation环境室，在37°C下，在湿润的5%CO中继续培养2大气。从照射后25–30分钟开始，使用60X Plan Achro油物镜收集活细胞图像。过滤装置如下：EYFP，500nm激发/535nm发射；diHcRed，572 nm激发/632 nm发射。使用0.4微米步长收集15–24个图像的Z堆栈，并使用softWoRx软件进行反褶积。准备投影图像并手动对核病灶进行评分。分析仅限于EYFP和diHcRed核标记均阳性的细胞（>80%的人群）。为了确定剂量反应，使用SigmaPlot v11.0软件（Systat software，San Jose，CA，USA）进行回归分析。

63镍微辐照器β辐照

微操作器（美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）安装在Applied Precision Deltavision显微镜的气象站环境室内，以便于微辐射器尖端的精确定位。微辐射器探头固定在丙烯酸电极支架中。将细胞电穿孔，培养24-48小时，转移到环境室中，并将微辐射器直接放置在目标细胞上，通过Deltavision光学系统进行观察确定。进行延时曝光，每个时间点有15–24个Z堆叠部分，0.4µm部分厚度，0.5 s曝光时间，并在EYFP通道中自动聚焦。对图像进行反褶积，准备投影图像，并手动对病灶进行评分。排除照射前出现的病灶。

为了跟踪和量化单个病灶，在投影图像中定义了感兴趣的区域，以TIF格式导出，并加载到DeCyder 6.5软件中（英国白金汉郡GE Healthcare）。执行自动斑点检测，在延时图像中匹配焦点（“斑点”），确定斑点体积并绘制出随时间变化的曲线。

结果

显微镜载台辐照系统

微辐射器是通过电化学沉积一层～1-µm厚的63玻璃毛细管中25µm直径微电极丝上的镍(5). 此处使用的设备配置与之前报告的“嵌入式磁盘”设计类似(5)，除了该器件是在未蚀刻微电极尖端的情况下制备的63镍应直接镀在平整抛光的铂表面上。此设计更改消除了因“凹盘”配置腔中的介质或碎片被捕获而导致活动衰减的问题。同位素富集63镍含量较高，导致探针表面更加活跃。此外，还应用了聚合物PEDOT涂层，以防止镍表面和电池介质之间的直接接触。

微辐射器安装在应用精密三角镜的气象站环境室中(图1A） ，使用带丙烯酸电极夹的精密微操作器(图1B） ●●●●。微操作器允许沿三个正交轴精确手动调整位置。在毛细管中引入弯曲，使得毛细管尖端与光路同轴(图1C） ●●●●。显示冲洗尖端的解剖显微镜视图如所示图1D.微辐射器的位置应确保毛细管尖端略高于目标细胞，并通过显微镜光学系统可见(图1E） ●●●●。活性表面的平面与培养皿的平面平行。

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显微镜载台微辐照系统。(一)微辐照系统总图。该设备安装在一个微型操作器上，该操作器位于Applied Precision Deltavision显微镜的加热、加湿的环境室中。(B类)显示设备与微操作器连接的特写视图。(C类)显示封闭毛细管中弯曲的细节，可将活性表面直接定位在目标细胞上方。(D类)解剖显微镜中的微辐射器尖端视图。(E类)Deltavision显微镜光学特写。细胞已被EYFP-53BP1和H2B-diHcRed表达质粒转染，如“材料和方法”一节所述。比例尺，10微米。

生物报告系统的校准

EYFP-53BP1表达结构如“材料和方法”部分所述(图2A） 由一个与全长53BP1连接的固有荧光增强黄色荧光蛋白结构域组成。它与以前的活细胞成像研究中使用的结构基本相同[例如(10–12)]. U2OS 2-6-3受体细胞(8)来源于U2OS骨肉瘤细胞系，该细胞系已被广泛用于先前对53BP1病灶形成的研究(11,13).

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校准EYFP-53BP1报告系统。(一)EYFP-53BP1主要结构。EYFP编码序列连接到全长53BP1，显示Tudor和BRCT域。EYFP1-53BP编码序列插入到pcDNA-DEST40（Invitrogen）中，在CMV启动子的控制下进行表达。(B类)校准剂量的剂量反应137Cs参考辐射。用EYFP-53BP1 WT和H2B-diHcRed联合转染细胞。在照射后30分钟收集活细胞图像。(C类)剂量反应的量化。在每个剂量点使用8–24个单个细胞核对Foci进行评分，并进行线性回归以获得剂量-反应曲线的斜率。

为了校准该系统中每单位剂量辐射的病灶数量，将细胞暴露于0-3 Gy的137Cs辐射，并在曝光后25–30分钟成像，此时响应达到最大值。H2B-diHc红色(9)作为注册标记共同表达(14). 收集了活细胞图像(图2B） 每个剂量点使用8–24个核手动对核病灶进行评分(图2C） ●●●●。回归分析表明，每Gy每个细胞核形成27.4个病灶。53BP1剂量-反应曲线的斜率是先前活细胞成像研究报告的1.4倍(12). 这与之前研究中超三倍体U2OS细胞的每个核DNA含量约为准二倍体HT1080细胞的1.5倍这一事实相一致，因此辐射损伤的靶点更大。

实时观测微辐射诱导的病灶形成

几项微辐射器实验的结果如所示图3用EYFP-53BP1和H2B-diHcRed表达构建物电穿孔细胞。24-48小时后，将其转移到Deltavision显微镜阶段，并将其保存在加湿5%CO的生长培养基中2大气温度为37°C。将微辐射器放置在目标细胞上方，并在1分钟内开始图像采集(图3A） ●●●●。每隔5分钟采集一次Z轴叠加图像。在16分钟的时间点后，取出辐照器，让细胞再恢复46分钟。对图像进行反卷积，准备投影，并手动计数病灶。三个单独单元格的结果显示在图3在所有三种情况下，病灶都没有明显的延迟，并在拔出探针后增加至最大约35分钟，在实验开始后增加至50分钟。在不同的实验中，焦点的绝对数量不同，这可能反映了探针位置的细微差异。为了汇集三个实验的数据，我们将数据归一化为每个实验中最大响应的百分比。我们计算了平均值和SD，以获得最右侧面板中的数据图3结果是一条平滑的曲线，显示出近似线性动力学的增加，直到达到平台。在没有微辐射器的情况下，在相同条件下成像的对照细胞中没有发现病灶(补充图S1)

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微辐射诱导53BP1病灶的实时成像。(一)在指定时间点采集的同一细胞的代表性图像。在第一个时间点前1分钟引入微辐照器，并在16分钟后取出。在每个时间点收集包含15–24个单独图像的Z堆叠，并进行去卷积。将显示投影。PO，探测；PF，探头关闭(B类)从三个独立实验中量化微辐照诱导的焦点。单元格1对应于面板A中的图像。最右边的面板显示了三个实验的汇总数据。将数据归一化为最大响应=100%，求平均值并绘制图表。误差条表示SD。

为了根据焦点数和辐射剂量估算辐射剂量，我们比较了图3校准曲线图2我们没有对不同的辐射类型（高能γ射线与β粒子）进行调整，因为它们可能被视为放射生物学等效物。我们也没有调整剂量率。正因为如此图3可能被略微低估（即较低的剂量率为在达到最大值之前解决最早的病灶提供了更多的时间）。根据这些警告，与标准曲线的比较表明，微辐射器在16分钟暴露中对细胞1、2和3的表观剂量分别为2.8、2.0和3.6 Gy。细胞之间的差异可能是由于不同细胞固有敏感性的差异（例如，在细胞周期中的位置，或者可能是探针位置的微小差异。这些剂量相当于0.12–0.22 Gy/min的剂量率范围。这大约比用此活动和几何建模震源所预测的要小一个数量级（“讨论”部分），差异的原因尚待确定。

尽管在成像过程中努力减少光暴露，但我们意识到光毒性本身可能导致修复病灶的形成。因此，我们在相同的条件下进行了模拟辐照，但没有使用微辐照器。在实验开始时出现的背景之上，没有发现与时间相关的病灶积聚(补充图S1).

单个病灶的动态行为

时间进程图3B表明，从辐射轨迹的初始穿越到出现病灶的时间是可变的，因为一些病灶在照射开始后立即出现，而其他病灶直到微辐射器移除后30分钟才出现。根据对曲线形状的检查，焦距分辨率所需的时间也必须是可变的。如果病灶在暴露后的可变时间出现，但都是长寿命的（即在整个实验过程中持续存在），那么病灶与时间的关系曲线应该是强S形的。事实并非如此。相反，系统迅速接近稳定状态，在最初的50分钟内显示出准线性响应。为了解释这种稳定状态，一些快速出现的焦点也必须迅速消失。

为了测试这一预测，我们跟踪了单个病灶随时间的变化。图4A显示了与中相同的核图3A、 但随着关注区域的扩大。在时间序列中手动匹配了18个病灶（“斑点”），并按照“材料和方法”一节中的描述对强度进行了量化（另请参阅补充图S2).图4B显示了点体积随时间变化的曲线图。在这些数据中可以看到几个模式。Foci 7、9和11出现并迅速消失，在10分钟内至少失去一半的峰值强度。Foci 1、2、5、10、12和15以中间动力学衰减，在15–30分钟内失去一半的峰强度。Foci 3、6、14、16、17和18在实验期间保持稳定。Foci 4、8和13的行为有些不规则。

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追踪单个53BP1病灶。(一)图像来自中细胞1的细胞核图3。插入面板显示由白色矩形标记的感兴趣区域的放大。人工识别并标记了18个单独病灶。(B类)单个病灶的图像强度量化。在DeCyder v6.5（英国白金汉郡GE Healthcare）中加载2D图像投影，并执行自动斑点检测(补充图S2). 量化了每个点对应于集成信号的体积。图表显示了单个焦距的图像强度随时间的变化。所有面板中都使用相同的任意单位。时间以分钟表示。

显然，收集较长且细粒度的时间序列，分析更多的焦点，并使用原始3D成像数据（而非此处分析的2D投影）进行更为密集的计算分析，将是一件很有意义的事情。然而，即使是这种有限的分析也表明，病灶可分为几类，其中一些快速出现和消失，而另一些则在观察期间保持稳定。

讨论

我们在这里描述了一种新型微辐照器的首次生物应用，这种微辐照器是专门为与标准细胞生物学实验室环境兼容而设计的。该装置的特点是物理尺寸小，辐射通量足以进行多种生物实验，辐射危害最小。我们展示了在实验中使用该设备来跟踪和表征辐照细胞中修复病灶的诱导。微辐射器是自给式的潜在替代品137CsCl公司2辐照器在某些细胞和分子生物学研究中的应用，特别是在单细胞水平上测量生物反应的应用。该设备由廉价的商用材料制成，总活性较低，缓解了因高活性而引发的公众健康和安全问题37CsCl公司2辐射源(三).

由于微辐射器可以直接安装在显微镜工作台上，因此它能够实时观察辐射反应的早期阶段。这种早期反应还没有得到很好的研究，特别是对于γ射线和X射线等稀疏辐射。初步分析揭示了修复病灶的异质性行为。特别是，有一类快速分辨的焦点，在使用传统辐照方法的实验中不明显。快速解决的病灶子集的存在意义重大，因为它可能解释了物理方法测定的双链断裂数量的最佳估计值之间的微小但无法解释的差异（每二倍体基因组约30 DSBs/Gy）(15,16)以及通过仔细计算电离辐射诱导的焦点（每二倍体基因组每Gy约10–25个焦点）估计的断裂数(6,12)已在中审阅(1). 修复病灶的异质性行为可能有多种解释，包括辐射诱导DNA断裂结构的异质性以及竞争性修复或信号通路的存在。潜在地，这些解释可以通过选择性敲除靶细胞中的单个DNA加工和修复酶来进行研究。

目前的剂量率估计在0.12–0.22 Gy/min的范围内，足以用于许多研究低剂量辐射反应生物学的实验。较高的剂量率对于需要同步诱导大量DSB的实验很有用。镍层的厚度足以使自吸收成为控制表面通量密度的限制因素，从而使更多放射性同位素的沉积不会导致剂量率相应增加。此处使用的镍63的比活性是市面上最高的。然而，供应商所述的放射性相当于<10%的同位素富集，因此理论上可以改进。

我们尝试将根据生物反应估算的剂量率与基于探针活性（由液体闪烁计数确定）和建模的预测剂量率进行比较，如(5)（请参阅补充数据详细信息）。该预测剂量率（2.65 Gy/min）与基于生物反应的估计剂量率之间的差异表明，建模中存在缺陷，或者β辐射以某种意料之外的方式衰减。目前正在进行的利用固态闪烁计数表征β粒子通量和发射光谱的实验可能会提供进一步的见解（J.S.和J.J.，未发表的数据）。

将微辐照器与目前用于在显微镜台上将靶向DNA损伤引入样品的其他两种方法进行比较是有用的。其中之一就是粒子微束。50多年前，Zirkle和Bloom(17)描述了使用范德格拉夫发生器和微孔径将强质子束传输到活细胞内直径为2.5微米的点。据估计，全世界有30个可运行的微束设施(18). 微束设备已经开发出来，能够精确地传送目标重粒子、电子或超声波X射线光子，具有不同程度的实时成像能力[例如(19–23)]. 按照目前的配置，微辐射器缺乏最先进的微束设施所具备的精确定位和粒子计数能力。然而，微辐照器的便携性及其潜在的低制造成本为许多应用提供了抵消优势。局部紫外线照射（或相当于近红外范围内的双光子吸收）提供了另一种在DNA损伤反应分析中有用的方法(24)，另请参见(25)]. 该方法的价值在于能够在精确定位的区域内诱导密集的近瞬时损伤。然而，这也是其主要局限性，因为密集的DNA损伤没有明确的生理等效物，而来自镍-63微辐照器的低能β粒子预计会产生与普通医疗和环境暴露源相似的损伤类型和分布。因此，Ni-63微辐照器的特性使其成为目前使用的其他技术的有用补充。

原则上，应该可以采用相同的电镀技术，使用其他放射性同位素建造类似的微辐照器。例如，252Cf可以用作裂变中子源或241Am是α粒子的来源。这两种同位素都在工业上使用，有可能用于建造研究微辐照器。细胞和分子对高LET辐射（如中子和α粒子）的反应尚未像低LET辐射那样得到广泛研究，部分原因是在辐射社区之外无法获得方便的辐射源。同位素在微辐照器中非常小的表面上集中沉积，可以使用非常少量的同位素进行实验，缓解对获取核材料构成障碍的健康和安全问题。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

基金

美国国立卫生研究院生物医学研究路线图（美国公共卫生服务奖EY018244）；美国能源部低剂量辐射研究计划（DE-SC0002343）；国家卫生研究院国家研究服务奖（ES015663 to W.K.）；佐治亚研究联盟（GRA）杰出学者挑战奖（授予W.S.D.和J.J.）。开放获取费用的资金来源：美国公共卫生服务。

利益冲突声明。未声明。

补充材料

【补充资料】

致谢

我们感谢David Spector博士和Ileng Kumaran博士（纽约冷泉港冷泉港实验室）赠送U2OS-2-6-3细胞，感谢核蛋白机器纳米医学中心成员的有益讨论，感谢Rhea-Beth Markowitz博士的科学编辑支持，以及乔治亚医学院影像核心设施。

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来自的文章核酸研究由以下人员提供牛津大学出版社