核酸研究。2010年8月；38(14): 4722–4730.
WRN解旋酶在人DHX9解旋酶刺激的反应中解扩冈崎片段样杂种
1和1,2,*
Prasun Chakraborty公司
1莱布尼茨年龄研究所（弗里茨·利普曼研究所），Beutenbergstrasse 11，D-07745 Jena和2德国耶拿Friedrich-Schiller大学分子生物医学中心，D-07745
弗兰克·格罗斯
1莱布尼茨年龄研究所（弗里茨·利普曼研究所），Beutenbergstrasse 11，D-07745 Jena和2德国耶拿Friedrich-Schiller大学分子生物医学中心，D-07745
1莱布尼茨年龄研究所（弗里茨-利普曼研究所），位于耶拿州比滕贝格大街11号，D-07745和2德国耶拿Friedrich-Schiller大学分子生物医学中心，D-07745
2010年1月14日收到；2010年3月23日修订；2010年3月23日接受。
- 补充资料
【补充资料】
GUID:F32FBE87-C97A-468A-B7A7-A4ED0F83D905
GUID:35AEB4D0-F3A9-4E69-A04E-7996820FF79C
摘要
Werner基因突变可促进节段性前体Werner综合征（WS），增加基因组不稳定性和癌症。沃纳基因编码一种DNA解旋酶（WRN），该酶可以与DHX9直接进行蛋白-蛋白质相互作用，也称为RNA解旋酶a或核DNA解旋酶II，它是一种参与转录和DNA修复的基本酶。通过使用几种合成核酸底物，我们证明WRN最好解扩含有RNA-冈崎片段的底物，这表明它在DNA复制的滞后链成熟中起作用。相比之下，DHX9最好解舒RNA-RNA和RNA-DNA底物，但不能解舒冈崎片段状杂种。我们进一步表明，DHX9刺激了WRN对RNA底物的优先解旋在体外在冈崎片断状杂种和含RNA的“鸡脚”结构上。总之，我们的结果表明WRN和DHX9也可能合作体内例如，在正在进行和暂停的复制分叉处。在后一种情况下，两种解旋酶之间的合作可能有助于形成和溶解退化复制叉的Holliday连接类中间产物。
简介
进行性人类疾病沃纳综合征（WS）是一种广泛使用的模型，用于研究人类衰老的分子方面[最近的综述参见(1,2)]. WS代表一种单基因疾病警告该基因编码RecQ解旋酶超家族2（SF2）亚群的一个成员，具有3′-5′解旋和独特的3′-5〃核酸外切酶活性[参见(三)]. 最初记录Q细菌中的基因产物被认为是一种酶，被认为参与重组修复，除其他外，可以清除停滞或崩溃的复制叉中的复制障碍(4,5). 类似地，SGS1基因中的突变，该基因是酿酒酵母，显示复制体不稳定和复制分叉崩溃(6). 此外，Sgs1解旋酶对于保持DNA聚合酶α和ε在停滞的复制分叉处是必要的(7). WS患者的细胞在细胞周期的S期表现出缓慢进展(8,9)在正常增殖的原代人成纤维细胞中，约60%的复制病灶含有WRN(10,11). 总之，这表明在未受干扰的DNA复制中有一个重要但不重要的作用。然而，每当复制分支停止时，WRN都会优先吸引这些站点(12). 与此相一致，WRN综合征细胞对阻断正在进行的复制分支的药物（如4-硝基喹啉-N-氧化物（4-NQO）或喜树碱）过敏(13,14). 显然，WS细胞在同源重组中间产物的解析中表现出缺陷，尤其是Holliday连接（HJs）和“鸡爪”结构，这些结构是由复制叉折叠引起的(15,16).
最近我们证明了WRN在功能上与DHX9合作(17)[使用非官方的HUGO命名法；其他名称为核DNA解旋酶II（NDH II）或RNA解旋酶A（RHA）]，SF2家族解旋酶的另一个成员，具有3′-5′方向性(18). DHX9与WRN共沉淀并刺激其3′-5′核酸外切酶活性，而DNA解旋被抑制(17). 此外，在间期，部分WRN和DHX9共同定位于中心体(19)并且这两种酶都与同源重组BRCA1的介体相互作用(20,21). 此外，WRN和DHX9与DNA依赖性蛋白激酶相互作用(22,23)和Ku70/Ku80(24,25)共同形成一个参与DNA损伤信号传导的检查点激酶。这两种解旋酶也与复制DNA聚合酶PCNA的滑动夹结合(26,27)到目前为止，只有WRN与DNA聚合酶δ相互作用(28)，皮瓣核酸内切酶I（FEN-1）(29)和单链DNA-结合蛋白RPA(30)，所有这些都是冈崎碎片成熟装置的组成部分[参见例如(31)]. 总的来说，这些发现表明这两种酶在链成熟滞后和拯救停滞的复制叉中发挥着共同作用。因为每个冈崎片段都是从一小段RNA开始的，通常长度为8-12 nt(32)，我们试图通过设计合适的模板-前体并探索5′-RNA对WRN解旋动力学的影响来模拟这种情况。使用这种方法，我们可以表明WRN在DHX9刺激的反应中优先解旋Okazaki片段状杂合物。虽然WRN在酶学上有很好的特征，但这种新功能进一步阐明了WRN在DNA复制和延迟链成熟中的作用。根据我们的数据，我们还提出了一个通过WRN和DHX9的联合作用形成和溶解鸡爪结构的模型，该模型可能有助于DNA损伤的重组旁路。
材料和方法
重组蛋白的表达与纯化
如前所述，从杆状病毒感染的High-Five™细胞中生产和纯化重组人DHX9和WRN蛋白(17).
放射性标记和退火
5′末端标记是通过来自Fermentas（德国St.Leon-Rot）的T4多核苷酸激酶和γ-33“正向”反应缓冲液中的P-ATP（5000 Ci/mmol）（哈特曼分析公司，德国布伦瑞克）（80 mM Tris–HCl，pH 7.4，10 mM MgCl2和5 mM DTT）。使用GE（Amhearst，UK）的Microspin TM-25柱从标记的寡核苷酸中去除未结合物质，如有必要，通过连续运行无RNase Micro-Bio-Spin P-30柱（德国慕尼黑Bio-Rad），用pH 8.0的10 mM Tris缓冲液平衡。
螺旋状基板
高纯度寡核苷酸（列于)从Purimex（德国格雷本斯坦）购买。寡核苷酸以1000 nmol的规模合成，然后通过聚丙烯酰胺电泳（RNA）或HPLC（DNA）纯化。设计寡核苷酸引物形成一系列DNA结构如下：简单杂交：1–10 pmol/µl M1、M2、R1、R2、R1D、R4D和R8D()用[γ]标记5′-33P] ATP并退火为包含17 nt互补区和3′-悬垂的寡核苷酸。HJ是通过将标记的寡核苷酸与互补的未标记链的2倍摩尔过剩量混合而制备的。将样品加热至100°C 5分钟，然后在25°C下培养3-4小时，或冷却过夜至室温。
表1。
| 寡核苷酸名称 | 长度 | 顺序 |
|---|
| DNA M1 | 17 | 5′CCTGCAGGCATGCAAGC3′ |
| DNA M2 | 34 | 5′gcttgcatgcctgcaggcctcaatctcatc3′ |
| DNA M3 | 34 | 5′CTACTCTAACTCGACCGCTTGCGCCTGCAGG3′ |
| DNA M4 | 34 | 5′在ccctctagagtccctgcaggcatgccagc3′ |
| 挪威船级社-S1 | 34 | 5′GATGAGAGGCTGGGAAAGAGTTACTAGCC3′ |
| DNA-S2 | 34 | 5′GGCTACGTAACTTTCGACTCTAGAGAGGAT3′ |
| RNA R1 | 17 | 5′CCUGCAGCAUGCAAGC3′ |
| RNA R2 | 34 | 5′gcuugcauccucgcaggccucaucacauc3′ |
| RNA–DNA R8D | 17 | 5′rCrCrUrGrCrArGrGdCdAdTdGdCd AdGdC3′ |
| RNA–DNA R4D | 17 | 5′rCrCrUrGrdCdAdGdGdCdADTdGdCDAdGdC3′ |
| RNA–DNA R1D | 17 | 5′rCdCdUdGdCdAdGdGdC′ |
| RNA–DNA R8M4 | 34 | 5′rArUrCrCrUrCrUrCdTd AdGdAdGdTdCdGdAdC dCdTdGdCdAdGd GdCd AdGd CdAdTdGd Cd AdAdGdC3′ |
螺旋酶分析
解旋酶分析含有33在10µl 20 mM Tris–HCl中加入P标记底物，pH 7.5，3.5 mM MgCl2、3.5mM ATP、0.1 mg/ml BSA、5mM二硫苏糖醇和10%甘油。通过添加酶引发反应；在37°C下孵育0至30分钟。通过在冰上快速冷却和添加3.5µl停止缓冲液（0.2%SDS、50 mM EDTA、0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯氰醇、40%甘油）以及添加10倍多余的未标记寡核苷酸来终止DNA解链，以防止解链的再退火。产品在4°C下通过10–12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用PhosphorImager进行可视化，并使用ImageQuant软件进行量化（GE Healthcare）。使用50 mM N-乙基马来酰亚胺使WRN和DHX9解旋酶失活，通过形成不可逆半胱氨酸键，使解旋酶活性降低(33). 解舒速率计算为（ssDNA/总DNA）×nM底物/µM酶/时间。未缠绕衬底的百分比确定为[（%展开）=100×（P/（S+P）]，其中P是产物，S是从荧光成像仪获得的残余衬底(34,35). 减去无酶对照组的背景值后，对P和S值进行校正。通过时间过程的初始线性部分，使用线性回归确定解卷速度。
电泳迁移率凝胶位移分析
在10µl 20 mM三乙醇胺–HCl、pH 7.5、2 mM MgCl中进行DNA结合反应2如图所示，添加或不添加1 mM ATPγS、0.1µg/ml BSA、1 mM二硫苏糖醇、DNA和蛋白质浓度。在室温下培养30分钟后，用负载缓冲液（6%菲科尔、0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯氰醇、40%甘油）停止反应，并通过4%非变性聚丙烯酰胺凝胶在4°C下电泳分离产物2小时。凝胶干燥、扫描和定量，如前所述。结合的百分比计算为结合的和未结合的放射性标记底物之间的比率。这个K（K）d日根据Scatchard分析估算值。
结果
WRN和DHX9都优选解旋含RNA的异质双工体
我们用DNA和RNA构建了几个同源和异源双链()并平行测定了WRN和DHX9的活性。为了避免不同的GC含量和一条链内可能形成稳定的二级结构，我们在直接比较中总是使用相同的DNA和RNA底物序列。此外，未标记寡核苷酸的10倍摩尔过剩量被用来掩盖未缠绕链的潜在再退火。两种酶解绕DNA：DNA双工体，解绕速率约为0.24和0.08 nM（17-mer）min−1微米−1分别用于WRN和DHX9的酶(A和B）。WRN解开了一个RNA:RNA17-mer双链，17-mer 3′单链延伸非常差(C） 而DHX9熔化RNA:RNA链的速率为0.72 nM min−1微米−1酶(D） 确认并扩展了早期的发现(36,37). DHX9在5分钟内将双链RNA底物R2:R1解链至约80%，将DNA:RNA杂交产物M2:R1解缠至72%。如果两条链中的一条由DNA组成，DHX9比WRN稍慢，产生0.74和0.86 nM（17-mer）min的解舒速率−1微米−1分别为(E和F）。WRN和DHX9的双重解卷数量如所示分别为G和H。总之，这两种酶释放含RNA的异源双链的速度比dsDNA快得多。
解开短的完全杂交股。WRN解卷M2:M1的时间进程(一)或DHX9(B类)，R2:R1由WRN展开(C类)和DHX9(D类)以及通过WRN熔化M2:R1(E类)或DHX9(F类)每个实验使用28 nM的WRN或DHX9和1 nM的底物。三角形代表热变性DNA底物控制，NE无酶。指出了底物和反应产物的位置；双线表示含有RNA的链。星号代表5′标记的核苷酸。通过WRN量化双重解卷(G公司)和DHX9(H（H）)也进行了描述。误差条表示SD来源于三个独立的实验。
WRN解旋酶最好解扩冈崎片断状结构
由于WRN对RNA-DNA杂交效果最好，我们接下来研究了冈崎片段状底物，它由17-mer与8-mer RNA在5′端混合组成，然后是9-mer DNA，与34-mer DNA模板（R8D:M2，). 出乎意料的是，DHX9解围R8D:M2不佳(A、 泳道8-12），甚至比相应的DNA:DNA底物的速率更低(B） ，比相应的RNA:DNA杂交慢10倍(D） ●●●●。与此形成鲜明对比的是，28 nM WRN在1.5分钟内分离出一半的R8D:M2结构(A、 通道3–7），产生最小约1.5 nM（17-mer）的解卷速率−1微米−1酶。因此，WRN取代了冈崎片段状引物6.2，但仍比可比的DNA:DNA或RNA:DNA构建物快1.8倍（另请参阅补充图S1A).
冈崎碎块状结构的展开。(一)R8D:M2解卷的时间过程。(B类)R4D放卷的时间进程：M2。(C类)R1D放卷的时间进程：M2。用28 nM WRN（左）或DHX9（右）和1 nM基板展开任一结构，时间尺度为10分钟。三角形表示，热变性控制；NE，无酶。8R、4R和1R表示5′端的核糖核苷酸数量。(D类)通过WRN量化R8D（菱形）、R4D（正方形）和R1D（三角形）的展开。误差条表示SD来自三个独立实验。
接下来，我们检测了通过WRN刺激解旋的RNA的大小。为此，我们设计了5′端由四个（R4D）和一个（R1D）核苷酸组成的17聚体寡核苷酸，并测量了解旋的效率。与R8D:M2相比，DHX9解开R4D:M2和R1D:M2-速度更慢(B和C，8–12车道）。另一方面，WRN在3分钟内从DNA中取代了R4D和R1D(B和C，3–7道），这比R8D的解舒慢2倍，但与17-mer RNA链的解舒类似。28 nM WRN在3分钟内完全熔化R8D:M2，而R4D:M2s和R1D:M2%分别松开至60%和49%(D） ●●●●。
因此，显然只有5′端的一个核糖核苷酸足以标记相应的寡核苷酸，以便WRN快速解链。乍一看，这可能表明WRN识别两条链中的一条从RNA到DNA的转变。或者，5′-RNA–DNA杂交或其假定的A构象可能更适合WRN的活性位点，从而促进解链。这种情况也可以解释为什么全杂交比DNA双链更容易解开。
DHX9刺激WRN催化的冈崎碎片状结构的解舒
由于DHX9和WRN相互净化并影响对方的活动(17)我们研究了冈崎碎片状底物上可能的协同效应。R8D:M2由WRN展开(A、 车道3和6）受到DHX9的刺激(A、 通道5和8），以与时间相关的方式，而仅14 nM DHX9没有展开相同的模板-聚合物(A、 车道4和7）。有趣的是，DHX9没有刺激简单DNA:RNA上的WRN(B、 通道3–8）或DNA：DNA底物(C、 泳道3-8）与RNA:RNA杂交体也没有（数据未显示）。总之，DHX9在冈崎片断状底物上刺激WRN约2倍(D） ●●●●。因为在含有RNA的底物M2:R1中没有观察到这种情况(B） ，我们得出结论，这种刺激是由于蛋白质与蛋白质的相互作用，而不是由于DHX9捕获融化的RNA片段。为了确定这种增强是由于DHX9介导的WRN刺激，还是由于WRN刺激DHX9，我们用50mM处理了这两种解旋酶N个-乙基马来酰亚胺作用10分钟。该过程使两种酶的解舒活性失活(E、 车道3–5）。然而，用100 mM DTT补充灭活缓冲液可以挽救NEM失活(E、 车道6–8）。NEM处理的WRN（w）和未处理的DHX9（D）各有14 nM的量没有解开R8D:M2(F、 车道6）。相反，添加14 nM的中毒DHX9（d）刺激WRN（W）的效果与未经处理的DHX9相同（参见。E、 车道8F、 车道7）。这表明DHX9对WRN的刺激作用与其解旋酶活性无关。由于DHX9对dsRNA的高度亲和力，它应该非常适合解析冈崎片段5′端的任何潜在RNA二级结构，否则可能会阻止FEN1的裂解和/或WRN的解链(38).
DHX9通过WRN刺激冈崎碎片状结构的解舒(一)在37°C下孵育3 min（3–5车道）或5 min（6–8车道）后，14 nM WRN（3和6车道）、14 nM DHX9（4和7车道）或14 nM每个WRN和DHX9催化1 nM R8D:M2的解卷。(B类)除了使用1 nM R1:M2作为底物外，其他实验与面板A所示相同。(C类)除了使用了1 nM M1:M2外，其他实验与面板A所示相同。(D类)在存在14 nM DHX9的情况下，通过14 nM WRN量化R8D:M2的解卷。(E类)1 nM R8D:M2的解卷由21 nM中毒WRN（w，第3车道）、21 nM有毒DHX9（d，第4车道）和21 nM各中毒WRN和DHX9催化（wd，第5车道）。通过添加0.1 M DTT和NEM（6-8车道），可以挽救中毒。(F类)1 nM R8D:M2由21 nM WRN（3车道）、DHX9（4车道）、WRN+DHX9，NEM中毒WRN+未处理DHX9、NEM中毒DHX9+未处理WRN（w，6车道）、以及中毒WRN加中毒DHX8（w，8车道）催化展开。误差条表示SD来自三个独立的实验。
WRN倾向于与冈崎片段和其他DNA-RNA底物结合
为了进一步探索WRN与各种底物的结合模式，我们进行了凝胶位移分析。在缺乏ATP的情况下，WRN结合的DNA-DNA（M2:M1）比DNA-RNA（M2:R1）更好K（K）d日值约为1×10−7M和5×10−7M、 分别(A） ●●●●。令人惊讶的是，几乎没有与冈崎碎片状底物R8D:M2结合，只有在酶的最高含量时才能检测到这种结合K（K）d日约4×10−6M（M）(A） ●●●●。但在存在水解性较差的核苷酸ATPγS的情况下，WRN对DNA–DNA底物的亲和力显著降低，产生一个K（K）d日约3×10−6M（比较A和B），而与DNA-RNA底物的结合似乎未受影响（5×10−7M）(A和B）。有趣的是，在存在ATPγS的情况下，WRN与冈崎片段样寡核苷酸R8D:M2结合得更好(K（K）d日= 2 × 10−7M） 与不含核苷酸辅因子相比（参见第3和第4车道A和B）。这种行为并非没有优先权。5′-3′解旋酶Pif1也被认为参与冈崎片段的解旋，在没有任何三磷酸核苷的情况下，同样能很好地结合分叉的DNA–DNA和DNA–RNA底物(39). 然而，在ATPγS的存在下，即最接近DNA解旋的条件下，DNA–DNA分叉的结合比DNA–RNA分叉紧密得多(39). 尽管如此，Pif1解开RNA-DNA分叉比相应的DNA-DNA分岔好得多，而WRN解开结合最好的底物R8D:M2的速率最大。我们的数据表明，ATP刺激WRN与R8D:M2的结合，并因此刺激其解除。因此，ATP可能有助于酶初始加载到该底物和/或在加载后稳定酶-底物复合物，以刺激任何解舒。
WRN以ATPγS依赖的方式与R8D:M2、M2:R1和M2:M1结合。(一)在不存在任何核苷酸的情况下，在没有（NE，泳道1）和具有增加量的WRN（如所示）的情况下孵育底物（50fmol）。(B类)与面板A所示相同的实验，但这次是在1 mM ATPγS的存在下进行的。放射性标记的DNA物种在天然的4%聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分析，并通过磷光成像进行可视化。凝胶顶部缝隙中的条带在许多无酶对照中也可见，可能代表聚集的底物。
当一条链以RNA片段开始时，DHX9通过WRN解旋酶刺激HJ的解链
我们的所有数据强烈表明，WRN在冈崎片段成熟过程中起作用。然而，WRN不是一种必需酶，其他酶，如5′-解旋酶Pif1和Dna2，被建议在DNA聚合酶δ进行链置换合成后进行滞后链成熟(32). 此外，在正常增殖的原代人成纤维细胞中，只有60%的复制病灶含有WRN(10,11)而WRN显然会被复制分支停止的位置所吸引，这很可能是因为潜在的DNA损伤(12). 停滞的复制叉可能退化并形成HJ和鸡脚结构(40,41)因为冈崎片段不可避免地参与其中，所以必须从四条链中的一条上的短RNA开始。为了解释这种特殊情况，我们设计了一种HJ，首先在一条链上有一段8 nt长的RNA，然后是24 nt的DNA(，R8M4:M2:S1:S2）。WRN同样很好地解开了含有HJ的RNA和DNA(A、 3号车道，以及补充图S1)，而DHX9无法展开任一构造(A、 4号车道，以及补充图S2). 与观察到的WRN对含RNA片段的解舒的刺激一致，DHX9刺激了WRN对含有HJ的RNA-配体的解舒，其量约为化学计量单位(A、 车道5），但当交叉点仅由DNA组成时，明显抑制了它。在该底物上，需要大约2倍的WRN摩尔过量来克服DHX9的抑制作用(补充图S2B). 因此，在DHX9存在的情况下，WRN只能在其中一个臂上含有引物RNA的情况下解析HJ。
DHX9刺激含有HJ的RNA-配体的WRN催化的分支迁移。(一)WRN催化（28 nM）1 nM合成RNA-大分子HJ底物R8M4:M2*：S1:S2的解卷。WRN在37°C（3道）下30分钟内解开约一半的基板，而DHX9未能解开（4道）。使用28 nM的DHX9和WRN实现了完全解卷（通道5）。将反应产物在10%的天然聚丙烯酰胺凝胶上进行拆分，并通过PhosphorImaging进行可视化。(B类)60 fmol放射性标记HJ与指定量的WRN和/或DHX9孵育。在37°C和1 mM ATPγS存在下预培养20分钟后，通过4°C下4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离产物，并使用荧光成像仪进行可视化。凝胶顶部缝隙中的条带在无酶对照组（通道1）中也可见，可能代表聚集的底物。
WRN与含有HJ的RNA引物的结合通过凝胶迁移率转移测定法直接测定(B） ●●●●。40-160 fmol WRN生产了大量HJ产品(B、 通道2-4），而相同数量的DHX9没有结合到基质上(B、 车道5-7）。大约80%的RNA-HJ与160 fmol的WRN结合(B、 车道4），带有K（K）d日值约为5×10−8M.WRN的底物结合不受160nM DHX9的影响(B、 参见泳道2-4和泳道8-10）。这表明DHX9通过提高WRN的催化常数对其分支迁移活性起刺激作用(k个猫)而不是通过增加底物亲和力(K（K）一).
讨论
WRN和DHX9代表一对解旋酶，在功能水平上进行共纯化、共免疫沉淀和合作。早些时候，相互作用位点已分别定位到WRN的N末端核酸外切酶结构域以及位于N末端和C末端的DHX9的双链RNA结合结构域II（dsRBD II）和富含精氨酸/甘氨酸的RGG盒。在这项研究中，我们观察到这两种解旋酶解绕完全杂交的DNA链，但速度较慢，而DNA:RNA异源双链的熔化速度比DNA:DNA链快得多。这是值得注意的，因为目前已知的解旋酶中只有少数能够有效地解DNA–RNA杂交。双链杂交的有效解链最初向我们表明，标记冈崎片段开始的RNA引物可能是这两种酶的理想底物。事实证明，这对WRN来说是正确的，因为这个解旋酶解绕了5′-R8D类9-3′寡核苷酸比相应的DNA:DNA甚至RNA:DNA链更快。RNA片段从8个核苷酸连续缩短为4个核苷酸，显示5′端的单个核苷酸足以刺激WRN的解舒活性，但当5′端RNA核苷酸较少时，解舒速度变慢。然而值得注意的是，在17聚体链上带有单个5′-核糖核苷酸的DNA:DNA构建体与相应的RNA:DNA杂交体一样快地被解开。只要两个核糖核苷酸中有一个（潜在的），就会保留一个5′-核苷酸哺乳动物引物去除酶RNase H1或2将RNA引物从冈崎片段上切割下来(42)]. 因此，即使剩余的一个5′-核苷酸也足以将WRN解旋酶导向冈崎片段的解旋。在这里，WRN可以催化RNase H裂解片段的熔化，作为FEN-1核酸内切酶随后裂解的先决条件，而FEN-1内切酶又是去除DNA聚合酶α插入的易出错DNA引物所必需的(43). 令人惊讶的是，在体外，DHX9刺激了WRN催化的冈崎碎片样混合杂合物的解链，表明后者也可能被加载到这些位点体内因为DHX9优先去除RNA双链(D） ，它特别适合解开含有发夹结构的RNA，而发夹结构又可能阻碍FEN-1的分裂(41)或RNase H消化(42). 与此观点一致，DHX9和WRN都与PCNA相互作用(26,27)并且WRN被证明可以刺激滞后链DNA聚合酶δ(28)和去除引物的核酸内切酶FEN-1(29). 因此，如前所述，WRN可能在冈崎碎片解卷中发挥作用[参见示例(44)]，可能还讨论了5′-3′解旋酶Dna2和Pif1(45,46).
除了讨论DHX9在冈崎片段解链中的作用外，这种酶似乎有助于WRN重新启动暂停的复制叉。最终冈崎碎片5′端的熔化是形成鸡脚结构的先决条件。在停滞的复制叉处，DNA聚合酶δ不能完成链置换合成，而链置换合成是装载5′-3′-解旋酶Dna2或Pif1所需的。因此，需要一个3′-5′-解旋酶样的WRN来取代冈崎片段靠近停滞叉的5′-末端。根据我们的结果，DHX9将刺激这一反应，同时阻止最外层5′RNA部分的二级结构形成(，顶部）。主导链也必须解开，可能是通过Dna2或Pif1，或者是通过5′-3′解旋酶BACH1（BRCA1相关的C末端解旋酶，也称为BRIP1和FancJ），其可能通过WRN-和DHX9-结合蛋白BRCA1被吸引(47)，其活性是细胞周期S期及时进展所必需的(48). BACH1感应并解开其中一条双绞线中的损伤(49)因此可能是受损DNA上鸡爪形成的主要候选5′解旋酶。此外，分叉回归要么需要在停滞的分叉之前进行正的超螺旋运动，要么需要BLM解旋酶的作用，有趣的是，它是BRAFT超复合体的一部分(50)包括BLM复合物和Franconia贫血复合物，包括BACH1/FancJ(51). 由于DHX9的链退火活性强于WRN（未发表的观察结果），DHX9也可能有助于形成含RNA的HJ(，中间）。此外，一旦倒退的叉恢复知觉，例如在潜在的DNA损伤修复后，DHX9可以通过WRN刺激鸡爪的溶解(，底部）。因此，与WRN类似，DHX9可能在消除复制阻塞方面发挥作用。
WRN和DHX9在暂停的复制分叉处的合作模型。箭头表示3′端，三角形表示受损部位，双线表示引物RNA，灰色线表示建议的中间结构。有关更多详细信息，请参阅文本。
总之，我们的研究结果强烈表明，WRN和DHX9在迁移和停滞复制叉中都具有协同作用，它们似乎参与了去除含有引物RNA的Okazaki片段和通过刺激溶解消除复制障碍，还有鸡爪结构的形成。因此，与WRN一样，DHX9可能对维持基因组稳定性有显著贡献。然而，为了更好地理解处理鸡脚结构和停滞复制叉的中间产物的机制，需要进行进一步的研究。
基金
Deutsche Forschungsgemeinschaft（授权号：Gr 895/17-1）；图林根州和德意志联邦共和国弗里茨·利普曼研究所。开放存取费用的资金来源：弗里茨·利普曼研究所。
利益冲突声明。未声明。
致谢
作者感谢赫尔穆特·波斯皮奇博士的有益建议和对手稿的批判性阅读。
参考文献
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