微RNA介导的mRNA衰变的数值模拟确定了微RNA控制的mRNA下调的新机制

摘要

简介

过去十年来，微核糖核酸（Micro-RNA）已成为分子生物学研究的主要焦点。miRNAs是一个小的非编码RNA家族，长约21-nt，以序列特异的方式调节基因表达(1–3). 它们最初是在秀丽隐杆线虫(4). 自那时以来，在所有后生动物基因组中已鉴定出数百个miRNAs。miRNAs表现出不同的表达模式，并可能在各种发育或生理过程中发挥调节作用。据估计，它们占动物基因的5%，是最丰富的调控基因之一。功能研究表明，miRNA参与了几乎所有细胞过程的调节，在包括癌症在内的许多人类疾病中都观察到了其表达的变化(5–8). 据估计，生物体中近30%的蛋白质编码基因受到miRNA-介导的控制(9,10).

miRNAs通过调节其靶mRNAs的翻译或稳定性来控制转录后的基因表达。miRNA由前体分子加工而成，前体分子由独立的miRNA基因或蛋白质编码RNA聚合酶II转录物的内含子部分转录而成(2). pri-miRNAs分两步处理，由RNA III型内切酶Drosha和Dicer催化，成熟的miRNAs随后输出到细胞质。在那里，它们与mRNA或翻译机制相互作用，导致其靶mRNA表达下调。在植物中，miRNAs与mRNAs基本配对，具有近乎完美的互补性，通过RNAi-like机制触发内核溶解mRNA的切割(11). 在动物细胞中，它们参与形成微核糖核蛋白（miRNAP），miRNAP与靶mRNA的3′UTR结合，并启动靶mRNA去烯基化和衰变(12). 或者，miRNAP可以在帽蛋白识别阶段或60 s亚单位连接阶段抑制翻译起始(13,14). 那些被二烯基化或翻译起始步骤抑制的mRNAs被转移到P体进行降解或储存。关于miRNA-介导的mRNA下调机制的现有知识已在几篇综述中讨论过(1–3,15–17).

大多数旨在理解miRNA介导调控的计算工作都集中在miRNA基因的鉴定上(18)和预测靶mRNA(9,19–21). 小RNA转录后调控的动力学模型(22–24)或已提出miRNAs(10,24,25). 莱文等。(25)提出了两类小RNA调控基因的线性模型大肠杆菌并证明该调节模型遵循阈值线性响应。这项研究的作者引入了一个两步模型，在该模型中，miRNA与信使核糖核酸结合，并启动一个导致无活性信使核糖核酸降解的二级过程。他们表明，信使核糖核酸水平和相应的蛋白质水平可以受靶点特异性参数的调节。此外，他们确定该系统的行为可能会被全球效应器针对某些miRNA靶点进行调节。研究还表明，当需要快速反应时，小RNA的调节是有利的，并且小RNA的调控经常用于额外的基因表达控制(23). 谢等。(10)分析了miRNA在基因表达负反馈调节中的作用。通过改变mRNA的衰变，miRNAs可以控制负反馈回路中mRNA基因表达的动态。最近，Khanin和Vincioti(24)介绍了一种基于miRNA的mRNA降解控制模型。该模型扩展了莱文先前的线性动力学(22)更逼真的饱和Michaelis–Menten型动能。该模型的参数使用实验测量的mRNA水平微阵列时间序列来计算，以响应miRNA的转染。参数使用复杂的最大似然优化来计算，最初是为了重建转录因子活性而开发的(26). 这项工作首次尝试量化游离miRNA的动力学以及对靶mRNA下调的影响。

在本文中，我们介绍了一个通过结合miRNA对mRNA表达进行转录后控制的动力学模型。该模型同时考虑了mRNA下调动力学和miRNA衰变动力学。对Wang的miRNA-124a转染实验中miRNA下调的一组mRNA的模型参数进行了估计等。(27). 模拟miRNA对mRNA降解的影响表明，miRNA控制细胞中靶mRNA浓度的新机制。

材料和方法

在建模miRNA-介导的mRNA转录后沉默时，我们从以下简化情况开始图1如引言所述，miRNA是由前体miRNA合成的，前体miRNAs由Drosha和Dicer分两步加工成成熟的miRNA(1,2,17). 为了建模的目的，在不损失通用性的情况下，可以假设这些步骤中的合成速率完全由miRNA基因转录物的量给出。因此，pri-miRNA处理步骤可以组合成驱动miRNA基因表达的速率常数。成熟的miRNA与靶信使核糖核酸结合，然后复合物被降解或储存在P-体中，对游离信使核糖核酸总量产生相同的净影响(1–3,15,17,28). 通过考虑三种不同形式的mRNA浓度，即游离mRNA、mRNA–miRNA复合物中结合的mRNA和定位于P-体的mRNA，对mRNA下调机制进行了建模(25). 在后两种情况下，mRNA的翻译受到抑制是由于miRNA与目标结合所致，因此无法区分这两种过程。这两个过程都会导致mRNA下调，因此这两种控制机制可以组合成一个速率常数。

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图1。

miRNA-介导靶mRNA沉默的简化方案。mRNAs和miRNAs都是从其基因前体转录而来的。在第二步中，miRNAs与目标mRNAs的互补区域结合，允许复合物转运到p体并降解。这一过程有效地减少了作为miRNA局部浓度函数的转录靶基因mRNA的数量。活性miRNA分子的合成包括几个步骤，这里省略了这些步骤，并在引言中进一步讨论。

在基因表达建模中，通常假设给定目标基因的表达速率由转录因子的数量及其与启动子区域的结合强度控制。给定mRNA表达的动力学方程可以写成

(1)

哪里表示依赖于转录因子数量的mRNA表达动力学z（z）_i=1.n和转录特定参数b条通常，转录率取决于一个或多个转录因子，其影响由参数向量加权b条在本研究中，转录被假定为恒定的，并且独立于其他基因或miRNAs(). 这个假设与王的实验设计是一致的等。(27)在此分析，其中用miR-124a转染细胞系。第二项表示由常数控制的降解速率k个_d日在没有miRNA的情况下，降解速率是恒定的，加上mRNA的生成速率，会导致mRNA丰度的稳定状态。在miRNA与mRNA结合的情况下(图1)，降解速率不再是恒定的，而是取决于miRNA的数量k个_d日因此不是一个常数，而是取决于结合miRNA的量，秒和一组参数，一:

(2)

哪里k个_d0级是基本降解速率常数k个_d日秒是由miRNA结合给出的降解速率。这个质量平衡方程以线性形式被用于小RNA的基因调控建模(22)以更一般的饱和迈克尔斯-芒登型形式(24).

之前已经显示过(29–31)生物控制过程的速率通常遵循一个sigmoid函数，在初始阶段，对输入信号的反应被延迟，随后呈线性增长直至饱和。根据这个假设，方程式(2)可以写为

(3)

参数一₁与miRNA与其靶点的结合强度成正比一₂可以被视为反应延迟参数(32–34). 重写方程式(1)–（3）给出了miRNA介导的mRNA水平抑制率的微分方程：

(4)

稳态解(dy/dt=0)导致

(5)

对于稳态水平，年目标mRNA的。

如果miRNA浓度不随时间变化(s=常数)mRNA的表达水平可以固定为一个恒定值。如前所述，一开始(t吨=0）Wang进行的转染实验等。，mRNA的数量尚未受到miRNA的影响。因此，年(t吨=0）在方程式中(1)可以固定到年₀。基于此假设，方程式(1)–（3）可用于目标mRNA。

(6)

使用方程式(6)、控制参数可以独立地拟合每个靶基因。

与任何其他细胞大分子一样，需要适当控制miRNA的稳态水平，以确保正常发育，并且必须以可控的方式降解miRNA分子。虽然人们对miRNA介导的mRNAs的抑制作用给予了很多关注，但对miRNAs自身的控制却很少关注。拉马钱德兰等。(35)表明在拟南芥中，SDN基因产物降解成熟miRNAs。王先生等。这里分析的实验表明，对于被转染miR-124a潜在控制的所有靶基因，mRNA靶在最后一个时间点增加。这种行为可以用miRNA水平降低到抑制靶mRNA所需的限度以下来解释。这种不均衡导致mRNA数量的恢复，而这些mRNA数量并没有被如此低数量的miRNA结合所充分阻断。因此，miRNA水平不能被视为恒定的，而是随时间而变化的。

考虑到一级降解动力学，miRNA的水平由质量平衡方程给出

(7)

哪里秒_第页表示miRNA的生成速率一_三秒用速率常数表示退化一_三假设将miRNA导入缺少miRNA的细胞系（如Wang的实验等。miR-124a被转染到通常不存在的细胞系），miRNA时间分布由以下公式给出

(8)

哪里秒₀表示miRNA的初始量t=0.

与以前的工作类似(22,24)，我们忽略了miRNAs降解随时间非线性控制的可能性，并考虑参数一_三作为常量。

当miRNA水平与时间相关时，方程(1)–（3）无法解析求解，必须通过将模型函数拟合到实验数据来估计其参数。

结果

时间miRNA影响

对于42个选定的mRNA谱，我们分析了miRNA对mRNA表达下调的时间影响

(9)

在大多数情况下，此功能遵循逐渐减少的乙状结肠，如图2a、 这是意料之中的。对于一组特定的基因来说，miRNA的影响是完全不同的(图2b） ●●●●。miRNA影响的过程类似于阈值函数。在第一个时期，信使核糖核酸的影响最大（等于1），在某个时刻降至0，过渡期很短(图2b） ●●●●。为了在更广泛的集合中研究此属性，我们选择了所有轮廓（从773个潜在目标记录集合中），其中轮廓的减少量与对照相比高于任意设置的值0.5。该程序选择了339个mRNA图谱（219个单个基因），其中11个因实验误差较大而被排除在外（标记为红色补充表S1). 使用模型，参数年₀，k_d0级，k_ds、，一₁、和₂，进行了优化，以符合实验mRNA图谱（图2，请参阅补充表S1)和miRNA影响曲线（中的虚线图2)，由方程式给出(9)为该集合中的所有配置文件计算。miRNA影响曲线下降的陡度可以用其一阶导数的最小值来表征（为了方便起见，将最小值乘以-1）。为了找到第图2b、 我们计算了所有miRNA影响谱的一阶导数，并记录了它们的最小值。mRNAs根据显著转化极小值的增加进行分类。排序值的绘图显示膝关节的近似值为0.16(图3)将整个集合分成两个不相交的部分。第一部分表示中给出的轮廓图2a、 第二部分代表了具有以下特征的轮廓图2b.分布图中的膝盖非常尖锐，表明两种控制类型之间存在短暂的过渡，并且这两种类型彼此不同。这一发现表明，存在一种模拟控制，其特征是图2a、 或数字开关，其特征是图2b.总共有98个开关型基因（80个个体基因）(图2b） 在339个miR-124a下调的信使核糖核酸谱（219个单独的基因）中，鉴定出了基因（在补充表S1).

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图2。

miR-124a下调mRNA的两种典型时间谱。mRNA剖面用圆圈绘制。实线表示使用模型的数据的最佳拟合。公式给出的miRNA的影响(9)（右轴）用虚线表示。左轴相关基因表达。(一)由ATP6V0E1剖面表示的“模拟”控制模式。(B类)由TEAD1轮廓表示的类数字控制模式。

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图3。

计算的miRNA影响曲线的符号反转一阶导数[等式(9)]根据增加值排序的选定mRNA。垂直线将mRNAs分为模拟和类数字两种类型。

讨论

miRNA的双值特性对mRNA积累的影响(图2b、 虚线）表示以下控制模型。在第一阶段，miRNA与mRNA结合并介导其衰变。在某一时刻，mRNA受到保护，不受miRNA的结合，miRNA的影响降至零。因此，信使核糖核酸仅以其基本速率衰减。因此，mRNA的积累速率仅是合成速率和基本降解速率之间的差异。与这种行为相关的mRNA剖面形状(图2b） 具有特征，不同于图2a、 这是miRNA-介导的mRNA下调的预期模型。这种类型的单个轮廓之间的差异仅由过渡阶段的位置给出。在大多数情况下，过渡期位于转染后的前40小时内。Khanin还将mRNA轮廓的特征“V”形确定为单个mRNA轮廓簇等。(24)（作为集群10英寸图2）。卡宁等。使用了不同的算法来识别潜在的miR-124a目标，因此分析了一组略有不同的潜在目标。在这两种情况下，都鉴定出一组具有特征形状的轮廓，表明这组mRNA是保守的。卡宁等。在他们的分析中使用了Michaelis–Menten型动力学，他们没有分析miRNA随时间的影响，这表明miRNA对识别此处发现的“数字”型控制至关重要。他们的方法更侧重于识别miRNA的潜在靶点，而不是阐明其控制机制。

我们的数据分析表明，结合mRNA 3′UTR的蛋白（PTBP1、Quaking、Vigilin和ARPP-19）在该组中高度表达(补充表S2). 最近，研究表明，RBP与mRNA的3′UTR结合可以阻止miRNA与这些区域的结合，并保护mRNA免受miRNA介导的抑制(36,37). 因此，我们假设，对于一组特定的mRNA，miRNA-dependent/miRNA-independentswitch可能通过RBP与3′UTR的结合介导，阻止miRNA与这些mRNA的结合。然而，作为一个开关，RBP与mRNA和mRNA保护的结合也应显示开关样行为，可能是通过RBP水平的突然增加。重要的是，我们已经鉴定了四种编码RBP的mRNA（Quaking、PTBP1、Vigilin和ARPP-19），它们被miR-124a靶向，并对miR-124a表现出开关样依赖性，使它们成为可能以开关样方式保护mRNA的RBP的良好候选者。这个假设的证据需要额外的实验工作，这超出了本文的范围。

miRNA介导的靶mRNA降解假定成熟的miRNA与mRNA结合，从而提高降解率或向P-体的转运。通常认为，miRNA对mRNA降解的贡献与成熟miRNA的细胞内水平成正比。因此，当输出（mRNA降解）与输入（miRNA水平）成正比时，miRNA对于mRNA降解贡献可以被视为分级或类似物。除了分级反应外，这里提供的数据还表明存在一种开关样或数字反应，其中miRNA的贡献具有双值特征。在第一阶段，miRNA介导靶mRNA的衰变。然而，在某一时刻，miRNA的影响降至零。这种开关样行为可能对mRNA控制产生深远影响。假设基因转录速率恒定，如果miRNA以数字模式“开”运行，mRNA的下调完全受miRNA的控制。相反，如果miRNA以“关”模式运行，则mRNA的积累仅由mRNA合成速率和基本衰变速率之间的差异控制，另一方面，在非开关模式下，mRNA受miRNA数量减少的控制，因此，如果真的发生了mRNA水平的最终增加，则会延迟得多（相比之下图2a和b）。因此，这种类似开关的行为可能允许快速控制mRNA水平，以响应外部信号，对miRNA数量的下降没有反应。此外，这种行为可能会抵消miRNA本身的“噪音”表达。这种行为表明了一种控制模式，即当可疑基因的mRNA表达谱达到最小值时，mRNA受到保护，不与miRNA结合。mRNA不再被降解机制识别，可以以基本速率积累。基本速率对应于从表达谱第二部分计算的速率(图2b） ●●●●。对开关样基因的分析表明，这种机制可能与RNA结合蛋白有关，而RNA结合蛋白可以作为RNA保护剂。这个假设仍有待实验验证。

结论

总之，我们建立了miRNA介导的mRNA表达下调的数值模型。将该模型应用于时间序列的微阵列数据，确定了miRNA介导的mRNA表达控制的新机制。我们的结果表明，miRNA介导的mRNA降解可能以分级反应或类似数字的方式进行，其中miRNA的影响在某一时刻停止。我们假设，“miRNA ON/miRNA OFF”开关是由RNA-binding蛋白介导的，该蛋白与靶mRNA的3′UTR结合，阻止miRNA结合这些区域，阻止随后的mRNA降解。这种机制允许功能相关蛋白的转录物快速积累，允许细胞执行细胞特异性或组织特异性基因表达程序。

补充数据

补充数据可从NAR Online获取。

基金

捷克科学基金会，编号310/07/1009和303/09/0475，机构研究概念AV0Z50200510和EC综合项目ActinoGEN，LSHM-CT-2004-005224的拨款；捷克共和国科学院的JE Purkynje奖学金将IAA500200716授予T.V.开放获取费用基金：捷克科学基金会（编号310/07/1009）。

利益冲突声明。未声明。

补充材料

参考文献