核酸研究。2010年8月；38(14): 4708–4721.
Rad52 SUMO化影响DNA修复效率
,1,2 ,三 ,4 ,1,2 ,2,5 ,2,5 ,6 ,4 ,三和1,2,*
维罗妮卡·阿特曼诺娃
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
纳丁·埃克特·博莱特
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
米利卡·阿纳里克
1Masaryk大学生物系，Kamenice 5/A7，625 00布尔诺，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
彼得·科莱萨
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
拉德卡·查洛普科娃
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，DK-2200哥本哈根N，丹麦，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
吉里·丹博斯基
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
帕特里克·宋
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
赵小兰
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
迈克尔·利斯比
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学国家生物分子研究中心，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
卢米尔·克雷奇
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2国家生物分子研究中心，Masaryk大学，Kamenice 5/A4，625 00 Brno，捷克共和国，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
1马萨里克大学生物系，卡梅尼塞5/A7，625 00 Brno，2国家生物分子研究中心，Masaryk大学，Kamenice 5/A4，625 00 Brno，捷克共和国，三哥本哈根大学生物系，丹麦哥本哈根N，DK-2200，4分子生物学项目，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约，NY 10065，美国，5捷克共和国布尔诺市卡梅尼塞5/A4，625 00，马萨里克大学实验生物学研究所Loschmidt Laboratories，Institute of Experimental Biology，Masaryk University6美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院分子生物物理学和生物化学系，邮编06520
2009年12月18日收到；2010年2月7日修订；2010年3月8日验收。
- 补充资料
【补充资料】
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摘要
同源重组（Homologous recombination，HR）在DNA代谢过程中发挥着重要作用，包括减数分裂、DNA修复、DNA复制和rDNA稳态。HR缺陷会导致病理结果，包括遗传疾病和癌症。最近的研究表明，小泛素样修饰蛋白（SUMO）的翻译后修饰在有丝分裂和减数分裂重组中起着重要作用。然而，SUMO化在重组过程中的确切作用尚不清楚。这里，我们描述了磺酰化对酿酒酵母重组介体蛋白Rad52。有趣的是，Rad52的SUMO化被单链DNA增强，我们表明Rad52的suMO化也抑制其DNA结合和退火活性。SUMO修饰的生物化学效应在体外伴有较短的自发Rad52病灶持续时间体内以及SUMO缺陷Rad52突变体中自发有丝分裂重组从单链退火转变为基因转换事件。总之，我们的结果强调了Rad52 SUMO化作为调节重组和DNA修复效率的“质量控制”机制的一部分的重要性。
简介
DNA双链断裂（DSB）是一种毒性最强的染色体损伤，与癌症和许多其他疾病有关。一次未修复的断裂可能导致非整倍体、基因畸变或细胞死亡。DSB是由大量内源性和外源性因素引起的，包括遗传毒性化学物质或电离辐射，以及通过受损DNA模板的复制或复制叉崩溃。在酵母中酿酒酵母同源重组（HR）是DSB修复的主要途径(1).
基因RAD52型上位性组介导HR。该基因组的成员通过突变体对电离辐射的敏感性或其在DSB修复中的缺陷来鉴定，包括RAD50、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59、RDH54/TID1、MRE11和学而思2这些基因也是减数分裂I中HR和染色体分离所必需的，通常在真核生物中高度保守(2,三).
HR涉及DNA同源性搜索和DNA链侵入，以在重组DNA分子之间形成连接。这些反应步骤由Rad51重组酶介导大肠杆菌RecA重组酶(4). 在ATP的存在下，Rad51结合单链DNA（ssDNA），形成一种称为突触前丝的右手丝。由于突触前纤维的组装过程相当缓慢，因此容易受到其他竞争因素的干扰，例如复制蛋白A（RPA）(5,6). RPA是一种异三聚体ssDNA结合蛋白，在HR中具有复杂的作用。体外结果表明，RPA通过消除ssDNA中的二级结构和稳定D环的移位链来刺激重组。然而，由于其与ssDNA的高度亲和力，可以阻止Rad51与ssDNA结合，从而抑制突触前丝的形成(7). 这种抑制作用可以通过Rad52的重组介体活性来克服(1).
Rad52多聚并形成环状结构(8). 环状结构的组装需要Rad52进化保守的N末端结构域中的序列，该结构域还具有优先于ssDNA的DNA结合活性(9). 酵母Rad52可以与Rad51以及RPA相互作用，以帮助确保Rad51从ssDNA中高效置换RPA(10–12). 与RPA的相互作用由Rad52中部的一个域介导，而羧基末端包含Rad51相互作用域(13,14). 此外，C末端结构域还具有DNA结合活性，并且单独具有重组介体活性(5). Rad52也具有强大的DNA退火活性(9).
许多参与HR的蛋白质可以被小泛素样修饰蛋白（SUMO）翻译后修饰，这种修饰可能会影响目标蛋白的生化活性和功能。最近，Sacher等。(15)确定了在Rad52中作为SUMO受体位点的残基。除了SUMO结合酶Ubc9外，Rad52修饰还受到SUMO连接酶Siz2的刺激(15). SUMO被证明可以保护Rad52免受蛋白酶体降解，并有助于将Rad52重组灶从核仁中排除，以维持核糖体基因座的低水平重组修复(16).
这里，我们表明在ssDNA的存在下，Rad52的SUMO化被显著刺激在体外我们发现增强的SUMO化通过Rad52的C末端DNA结合域介导，并需要赖氨酸K253。此外，我们证明SUMOylated Rad52对ssDNA和dsDNA的亲和力较低，并且单链退火活性也降低。这些数据提供了有关SUMO酰化在调节Rad52生化活性中作用的机制信息。
材料和方法
遗传方法、酵母菌株和质粒
使用标准遗传技术对酵母菌株进行操作，并按照先前所述制备培养基(17). 本研究中使用的所有菌株RAD5系统W303的衍生物(补充表S1) (18,19). 要生成（他的）6-RAD52（N+M）：：pET11d质粒（他的）6-RAD52:：pET11d质粒被消化巴米希从琼脂糖凝胶中分离、连接并测序得到的DNA产物。表达rad52（K43,44R）,rad52（K253R）和rad52（K43,44253R）利用特异性引物通过定点突变构建突变体(补充表S2). 氨基酸编号对应于GenBank登录号CAA86623的第一个ATG对Rad52蛋白的翻译。
DNA底物
寡核苷酸购自VBC Biotech。寡核苷酸的序列如所示补充表S2在5′端用荧光素修饰寡核苷酸-1和寡核苷酸-3。通过在杂交缓冲液H（50 mM Tris–HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl）中混合等摩尔量的组成寡核苷酸来制备DNA底物2)，在90°C下加热3分钟，然后缓慢冷却至室温，以便DNA退火。退火后的DNA底物在1-ml Mono Q柱（GE Healthcare Life Sciences）中分离纯化，20 ml梯度为50–1000 mM NaCl，10 mM Tris–HCl，pH 7.5。过滤峰级分，透析到50 mM Tris–HCl中，pH 7.5，含有5 mM MgCl2并集中在Vivaspin浓缩器中，具有5 kDa的截止值。DNA底物的浓度通过260 nm处的吸光度测量测定。
重组蛋白的表达与纯化
如前所述，表达并纯化了各种Rad52物种(5). 如前所述纯化Rad51和RPA蛋白(4,20).
Aos1/Uba2复合物（E1蛋白）的纯化
这个大肠杆菌用0.5 mM IPTG在37°C下诱导BL21（DE3）菌株表达含有GST标记的Aos1的E1（Aos1/Uba2复合物）蛋白（由B.Schulman博士馈赠）。将细胞制成颗粒并储存在−80°C下。将细胞颗粒（7 g）重新悬浮在含有150 mM KCl、0.01%NP40、1 mMβ-巯基乙醇的25 ml细胞破碎缓冲液（CBB）（50 mM Tris–HCl，pH 7.5，10%蔗糖，2 mM EDTA）中，经超声处理并离心（10万克，90分钟）。将澄清的上清液加载到7-ml SP-sepharose柱上，其出口连接到7-ml Q-sepharos柱（Amersham Biosciences）。使用缓冲液K（20 mM K）对两个色谱柱进行预平衡2高性能操作4，10%甘油，0.5 mM EDTA），含100 mM KCl。随后在缓冲液K中以100–800 mM KCl的70-ml梯度洗脱Q-sepharose柱。洗脱约330–470 mM KCl的E1蛋白峰组分被合并，并与800µl GTH-sepharose（Amersham Biosciences）混合，在4°C下在含有100 mM KClK的缓冲液中洗涤1 h。用8 ml 100 mM KCl在缓冲液K中洗涤含有结合蛋白的GTH-sepharose，并用800µl 10、50、100或200 mM谷胱甘肽（GTH）在含有100 mM氯化钾的缓冲液K内分步洗脱。将在10–100 mM GTH范围内洗脱的峰级分加载到0.5 ml Mono Q柱上，然后在缓冲液K中使用100–700 mM KCl的5 ml梯度洗脱。将在约560 mM KCl下从Mono Q柱洗脱的E1蛋白的主要级分浓缩在Centricon-30至5µg/µl中，并在−80°C下储存在小等分试样中。
Ubc9（E2蛋白）的纯化
将表达E2（Ubc9）蛋白的质粒（Erica Johnson博士馈赠的礼物）导入大肠杆菌菌株BL21（DE3）。将在37°C下在2×TY培养基中生长的隔夜培养物稀释100倍至新鲜的2×TY培养基中，并在37℃下培养。E2的过度表达是通过添加0.1 mM IPTG，然后在25°C下培养过夜来诱导的。制备细胞提取物，13克在含有150 mM KCl、0.01%NP40、1 mMβ-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物（胃蛋白酶抑制素、亮氨酸蛋白酶、抑肽酶、凝乳抑素、苯甲脒和苯甲基磺酰氟）的20 ml CBB中解冻细胞颗粒。细胞通过超声波破碎，粗提物通过离心（10万）澄清克，4°C，90分钟）。上清液通过7-ml Q-sepharose柱，将流通部分直接应用于7-ml SP-sepharos柱，该柱在缓冲液K中以100-750 mM KCl的70-ml梯度洗脱。E2蛋白在290-370 mM KCl下从SP柱洗脱。将峰馏分与750µl Ni–NTA琼脂糖（Qiagen）在4°C下混合75分钟。用含有100 mM KCl的7.5 ml缓冲液K清洗珠子，然后用含有100 m M KCl和10 mM咪唑的缓冲液K进行7.5 ml清洗。然后用分别含有100 mM KCl和50、150或300 mM咪唑的缓冲液K洗脱E2蛋白。将从Ni–NTA琼脂糖柱中洗脱的50至150 mM咪唑组分合并，应用于1 ml Mono S柱上，并在缓冲液K中使用100–750 mM KCl的10 ml梯度洗脱。在360–510 mM KCl洗脱的E2蛋白在Centricon-30中浓缩至20µg/µl，并在−80°C下保存在小份中。
SUMO蛋白的纯化
将含有SUMO（Smt3）基因的质粒引入大肠杆菌菌株BL21（DE3）。将生长在37°C下2×TY培养基中的过夜培养物稀释100倍至新鲜培养基中，并在37°C下培养至OD600达到0.8。当时，将IPTG添加到0.5 mM，并在37°C下培养3 h。通过离心收集细胞并将其储存在−80°C下。在含有150 mM KCl、0.01%NP40、1 mMβ-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物的25 ml CBB中，通过超声处理制备5 g细胞糊的提取物。通过超速离心澄清裂解液，并将所得上清液串联通过SP-和Q-sepharose柱（各7 ml）。然后用缓冲液K中100–750 mM KCl的70 ml梯度洗脱Q柱。将含有SUMO的级分（370–470 mM KCl）合并并与600µl Ni–NTA琼脂糖混合。用6 ml含100 mM KCl的缓冲液K洗涤珠结合蛋白，然后用6 ml含有100 mM氯化钾和10 mM咪唑的缓冲液K洗涤。用含有50、150或300 mM咪唑和100 mM KCl的缓冲液K洗脱结合蛋白。将含有从50至300 mM咪唑洗脱的SUMO蛋白的组分合并到0.5 ml Mono Q柱上，然后在缓冲液K中以100–900 mM KCl的5 ml梯度洗脱。将峰组分（400–700 mM KCl）合并，浓缩在Centricon-30至10µg/µl中，并保存在−80°C下。
体外SUMO酸化分析
在含有5.6µM纯化SUMO蛋白（Smt3）、400 nM E1蛋白（Aos1/Uba2）、2.8µM E2蛋白（Ubc9）、2.5 mM ATP、缓冲液S（50 mM HEPES、100 mM NaCl、10 mM MgCl）的20µl反应体积中进行分析20.1 mM DTT）和2.7–4.1µM各种Rad52蛋白质。在30°C下培养反应3 h，通过添加30µl SDS-Laemmli缓冲液（62.5 mM Tris–HCl，2%SDS，5%β-巯基乙醇，10%甘油，0.002%溴酚蓝）停止反应，并通过SDS-PAGE和western blotting进行分析。使用Quantity One软件（Bio-Rad）对Rad52 SUMOylation进行量化，并以单磺酰化与非改性Rad52的比率表示。
圆二色光谱法
使用Jasco J-810光谱仪（Jasco，Tokyo，Japan）和Peltier温度控制器在10°C下记录圆二色性（CD）光谱。使用0.1cm石英试管，在20 mM磷酸盐缓冲液和50 mM KCl（pH 7.5）中含有研究蛋白质/DNA，在195至340 nm、100 nm/min、1s响应时间和2 nm带宽下收集数据。通过从蛋白质-DNA复合物的光谱中减去DNA的光谱来计算CD差异光谱。每个光谱代表10次单独扫描的平均值，并根据缓冲液引起的吸光度进行校正。CD数据以毫度表示（CD的仪器单位）。
电泳迁移率变化分析
将指示量的各种形式的Rad52蛋白与荧光标记的DNA底物（0.44µM核苷酸）在37°C下在10µl缓冲液B（50 mM Tris–HCl，pH 7.8，5 mM MgCl）中孵育2添加凝胶负载缓冲液（60%甘油、10 mM Tris–HCl、pH 7.4和60 mM EDTA）后，反应混合物在4°C的TBE缓冲液（40 mM Tris-HCl、20 mM硼酸、2 mM EDTA、pH 7.5）中的7.5%天然聚丙烯酰胺凝胶中溶解，并使用Quantity One软件（Bio-Rad）量化DNA物种。
单牌退火分析
分析基本上按照前面所述进行(14). 将寡核苷酸-2和荧光标记寡核苷酸-1（0.26µM核苷酸）在37°C的单独试管中培养3分钟，在20µl缓冲液D（40 mM Tris–HCl，pH 7.5，50 mM KCl，1 mM DTT和100µg/ml牛血清白蛋白（BSA））中不存在或存在RPA（20 nM）。将不同数量的Rad52或Smt3-Rad52添加到含有Oligo-2的试管中，然后与Oligo-1混合。将完成的反应在37°C下培养8分钟。在指定的时间，去除9µl退火反应，并用0.5%十二烷基硫酸钠和500µg/ml蛋白酶K在37°C下处理10分钟，总体积为10µl。单个样品在TBE缓冲液中运行的12%天然聚丙烯酰胺凝胶中溶解。DNA退火被量化为荧光标记的寡核苷酸-1转化为双链形式的部分。
Rad52与Rad51的结合及仿射凝胶固定化RPA
如前所述，制备含有Rad51（Affi-Rad51；300 ng/µl）或RPA（Affi-RPA；350 ng/¦Μl）的Affi-gel 15珠(21). 将纯化的Rad52或Smt3-Rad52与30µl的Affi-Rad51或Affi-RPA在25µl缓冲液T（20 mM Tris–HCl，pH 7.5，150 mM KCl，1 mM DTT，0.5 mM EDTA和0.01%NP40）中混合30 min。在用30µl SDS-Laemmli缓冲液处理珠子以洗脱结合蛋白之前，用100µl缓冲液T洗涤珠子两次。用SDS-PAGE在10%凝胶中分析含有未结合Rad52或Smt3-Rad52蛋白的上清液和SDS洗脱液（各10µl）。
凝胶过滤
使用Sephacryl S400柱（共25 ml）监测Rad52和SUMOylated Rad52蛋白的寡聚状态。蛋白质在含有200 mM KCl的缓冲液K中以0.1 ml/min的速度通过筛分柱过滤，收集0.5 ml组分。通过SDS-PAGE电泳分离指示的柱部分，以分别测定Rad52或SUMOylated Rad52蛋白的含量。
有丝分裂重组率的测定
非功能染色体间和直接重复重组吕2如前所述测量异质等位基因(22)除了将单个菌落接种到含有100µg/ml腺嘌呤的液体SC培养基中。通过在SC和SC-Leu培养基上接种适当数量的细胞来确定接种效率和重组体的数量。在30°C下放置3天后，计数菌落数量。Leu人+将菌落复制到SC-Leu-Ura上，以区分基因转化（Ura+)和单线退火（Ura−)直接重复试验中的事件。对每种菌株进行了15-19次独立试验。根据中值法计算相应的重组率及其标准偏差(23). The rate ofADE2型rDNA处的标记缺失如所述进行测定(24). 简而言之，在30°C的液体YPD培养基中隔夜培养单个菌落。然后，将培养物稀释至指数期，然后在YPD上培养适当数量的细胞。在30°C下放置3天后，将半扇形红-白菌落的数量计算为rDNA重组率的直接测量值。
减数分裂重组分析
将新鲜细胞片从固态YPD复制到SPO培养基中，然后在30°C下培养3天，诱导孢子形成。接下来，将细胞重悬于H中2O和显微镜检查以确定产孢效率。对每个菌株，解剖18个四孢子四分体，以确定发芽效率。为了确定减数分裂重组频率和相对活力，OD600在SC和SC-Leu培养基上电镀适当数量的细胞之前，对细胞进行超声处理。
反向重复基底复合和断裂诱导复制的分析
使用ade2-5′Δ：：TRP1:：ade2-n系统（由美国纽约州纽约市哥伦比亚大学L.Symington提供）分析反向重复序列之间的重组。实验基本上按照描述进行(23). 采用染色体片段分析法测定Rad52 SUMOylation缺陷突变体的断裂诱导复制（BIR）效率。实验按照前面所述进行(25).
显微镜
如前所述，对细胞进行荧光显微镜处理(26). 黄色荧光蛋白（YFP）使用Chroma（美国弗吉尼亚州布拉特波罗）的带通YFP（产品目录号41028）过滤器组进行可视化。使用10%的中性密度滤光片采集图像，以减少光漂白和光毒性。使用Volocity软件（Improvision）以任意单位（AU）测量荧光强度。
结果
ssDNA对Rad52 SUMO化的增强作用
先前的研究表明，Rad52蛋白在赖氨酸K43、K44和K253处被氨酰化，以应对DNA损伤[A、(15)]. 为了确定该反应的生化要求，我们建立了一个在体外使用纯化的酵母Ubc9、Aos1、Uba2和Smt3（酵母中的SUMO）蛋白质进行SUMO酸化分析(B和补充图S3). 将Rad52蛋白添加到此反应中导致其修饰(A） ●●●●。我们还确认赖氨酸K43、44和253是主要的在体外观察到的SUMO结合位点体内[(15),补充表S3)]. 由于已知Rad52同时结合ssDNA和dsDNA，我们决定评估DNA对Rad52 SUMO化的影响。重要的是，当在ssDNA辅因子存在下进行Rad52的SUMO化时，我们注意到SUMO修饰的显著刺激（～3倍，A） ●●●●。抗Smt3和抗Rad52抗体的免疫印迹证实了通过SUMO偶联修饰Rad52(B和C）。相反，添加dsDNA并没有提高SUMOylated Rad52物种的水平(A） 表明只有ssDNA结合才能产生这种刺激。有趣的是，ssDNA滴定实验表明，当Rad52与核苷酸的比率达到大约1:37时，刺激Rad52 SUMO化是最佳的(D和E）。这与之前公布的数据有很好的相关性，表明Rad52蛋白结合～36 nt的ssDNA(27). 最大刺激对应于25%的改良Rad52蛋白。总之，这些数据表明：（i）Rad52可以进行SUMOylated在体外，（ii）SUMO化模式与观察到的模式相同体内和（iii）Rad52与ssDNA的结合刺激其SUMO化。
Rad52种和SUMO机械蛋白的纯化。(一)内部功能域的示意图酿酒酵母Rad52蛋白，包括已知SUMO受体赖氨酸的位置。显示了RPA相互作用域（黑盒，残基308–311）和Rad51相互作用域。(B类)纯化的SUMO机制蛋白：GST标记的Aos1/Uba2异二聚体（1μg），（His）6-标记的Ubc9和Smt3蛋白（各1μg）在15%SDS-PAGE上运行，并用考马斯蓝染色。(C类)净化（他的）6-标记的Rad52物种（每种1μg）：Rad52、Rad52（K43,44R）、Rad52和Rad52（K43,44253R）在10%SDS–PAGE上运行并用考马斯蓝染色。
体外Rad52的SUMO化受ssDNA刺激。(一)ssDNA和dsDNA对Rad52 SUMO化的影响。体外如图所示，在存在或不存在ATP（2.5 mM）、Rad52（2.7μM）、83-mer ss-DNA（100μM核苷酸）或dsDNA的情况下，使用重组Aos1/Uba2（400 nM）、Ubc9（2.8微米）和Smt3（5.6微米）进行SUMO酸化分析。反应混合物在30°C下培养3 h，通过添加30μl SDS-Laemmli缓冲液停止，并在7%SDS-PAGE上进行分析，然后进行银染色。哈希符号表示Rad52和E1的高分子多糖基化物种。凝胶底部的数字代表改性和未改性Rad52的比率。SUMOylated Rad52蛋白经抗Smt3蛋白免疫印迹证实(B类)或抗Rad52(C类)抗体。(D类)体外在不含DNA（第1和第2道）或增加83-mer ssDNA（15、50、100、150、300μM核苷酸；第3-7道）的情况下对Rad52蛋白进行SUMO酸化分析。哈希符号表示高分子量SUMOylated物种。(E类)面板D中凝胶的图形表示，以单磺酰化与非改性Rad52的比率表示。(F类)83米ssDNA（黑色）、Rad52（红色）和Rad52-ssDNA复合物（白色）的CD光谱。差异光谱（绿色）表示与DNA复合物中Rad52的值，从中减去DNA光谱。为了形成复合物，在分析之前，将蛋白质和DNA在37°C下共同培养10分钟。蛋白质浓度为3.87μM，DNA浓度为2.24μM。在10°C下，在含有50 mM KCl（pH 7.5）的20 mM磷酸盐缓冲液中测量样品。
ssDNA结合导致Rad52的构象变化
ssDNA对Rad52 SUMO化的刺激促使我们测试ssDNA结合是否会导致Rad52蛋白的构象变化。因此，我们测量并比较了在DNA存在下Rad52单独的CD光谱和Rad52的差异光谱(F；红色和绿色方块）。结果表明，Rad52蛋白与ssDNA的相互作用导致了该蛋白的构象变化。这种构象变化发生时DNA结构没有任何变化，因为DNA光谱在240 nm以上没有变化。我们将负谱带的增加归因于Rad52的α螺旋度的增加(28). 总之，ssDNA的结合导致Rad52内的构象变化，相当于α螺旋度的增加。
RPA而不是Rad51结合的ssDNA可以刺激Rad52的SUMO化
DSB修复过程中产生的ssDNA通常通过与其他ssDNA结合蛋白（即RPA和Rad51）的相互作用而受到保护。因此，我们测试了RPA或Rad51结合的ssDNA是否仍然可以与Rad52相互作用，以及它是否增强了Rad52 SUMO化。我们将ssDNA与越来越多的RPA蛋白预孵育，并检测RPA对Rad52 SUMO化的影响在体外在实验条件下，RPA与ssDNA有效结合(补充图S4)化学计量比为每30吨一个RPA三聚体。如所示A和B的刺激水平与不含RPA的相似，表明包被RPA的ssDNA可以增强Rad52 SUMO化。即使在ssDNA上有2倍的RPA摩尔过量(A、 通道8），Rad52 SUMO化的刺激与ssDNA的观察结果相当(A、 车道3）。接下来，我们将ssDNA与越来越多的Rad51蛋白预孵育，以形成突触前丝。值得注意的是，该DNA不再适用于Rad52，并导致Rad52 SUMO化降低至缺乏ssDNA时观察到的基础水平(C和D）。具体地说，Rad52 SUMO化的最大抑制发生在每个Rad51单体的ssDNA的3 nt处，对应于Rad51的ssDNA结合位点大小，并确保完全包覆DNA(20). 进一步增加Rad51量对Rad52 SUMO化没有任何额外影响(C、 车道10和数据未显示）。综上所述，这些数据表明，由RPA结合的ssDNA完全可以被Rad52结合，而Rad51核蛋白丝中的DNA则不能。
RPA-或Rad51涂层ssDNA可接近性对Rad52 SUMO化的影响。(一)与ssDNA结合的RPA不影响Rad52 SUMO化。增加量的RPA蛋白（1.2、3.5、4.6、5.9和8.3μM）在37°C下与83-mer ssDNA（100μM核苷酸）预孵育10分钟，然后与E1（400 nM）、E2（2.8μM）、Smt3（5.6μM。在30°C下培养3小时后，用7.5%SDS-PAGE和银染色分析反应。(B类)通过量化（A）中的相应频带，给出了单磺酰化与非改性Rad52的比率。(C类)Rad51涂层的ssDNA不会刺激Rad52 SUMO化。除使用越来越多的Rad51（3、7、14、21、27、34、41μM）外，反应按（A）进行。停止反应混合物，用10%SDS-PAGE进行分析，然后进行银染色。(D类)C的Rad52-Smt3共轭物的量化，作为单-SUMOylated与非修饰Rad52的比率。箭头表示完全覆盖ssDNA的Rad51数量。哈希符号表示Rad52和E1蛋白质的高分子多-SUMO链。
K253残基处Rad52 SUMO化的增强通过C末端DNA结合域介导
Rad52 SUMO化发生在三个赖氨酸残基上：K43、K44和K253(15)因此，我们构建并纯化了缺乏一个或多个SUMO结合位点的Rad52突变蛋白在体外研究(C） ●●●●。有趣的是，Rad52（K43,44R）突变体在无ssDNA和有ssDNA的情况下显示出与野生型Rad52相似的SUMO化模式(A） ，表明ssDNA增强的SUMO化可以单独在K253处发生。其他两个含有K253R突变的Rad52突变蛋白[Rad52（K253R）和Rad52（K43,44253R）]在Rad52 SUMO化中受到严重损害(A） ，表明残基K43和K44因赖氨酸253处的SUMO化而被修饰(A） ●●●●。这与之前公布的数据不同，这些数据可能反映了E3连接酶在体内形势(15). 为了帮助消除单个突变可能影响蛋白质折叠的可能性，我们测试了所有突变蛋白质的DNA结合和DNA链退火，发现野生型和突变蛋白质之间没有差异(补充图S1).
Rad52通过C末端结构域与ssDNA结合可增强赖氨酸K253的SUMO化。(一)ssDNA刺激赖氨酸K253处的SUMO酸化。标准在体外使用野生型Rad52（2.7μM）或SUMO缺陷受体赖氨酸Rad52突变体进行SUMO化反应：Rad52（K43,44R）、Rad52（K253R）和Rad52。(B类)Rad52的C末端DNA结合域负责刺激SUMO化。Rad52蛋白及其片段：Rad52（N+M）（4.13μM）、含有GST标签的Rad52（M）（3.52μM）和Rad52（M+C）（4.03μM）被SUMO化在体外在存在或不存在83-mer ssDNA（100μM核苷酸）的情况下进行分析。星号表示主要SUMOylated Rad52物种。哈希符号表示Rad52和E1蛋白质的高分子多-SUMO链。
Rad52被证明含有两个DNA结合域，一个位于氨基末端，另一个位于羧基末端[A、(5)]. 我们希望研究这些结构域中哪些是负责增强Rad52 SUMO化的。由于这种刺激是通过位于Rad52中间区的K253介导的，我们使用三个Rad52片段检查了SUMO化状态及其在ssDNA结合后的增强，这三个片段含有蛋白质的氨基末端和中间部分（N+M），仅中间部分（M）或中间部分和羧基末端（M+C）。尽管这三个片段都可以被SUMOylated在体外，只有涉及Rad52（M+C）的反应被ssDNA刺激(B） 表明C末端结合区负责SUMO化增强。
SUMO酸化减弱DNA结合和链退火
ssDNA对SUMO酸化效率的影响促使我们测试SUMO化Rad52蛋白的生化特性。Rad52的低聚物状态阻止了从在体外SUMO酰化反应。因此，SUMO化反应是在存在或不存在ATP的情况下进行的，以确保单个实验中相同数量的Rad52，从而得到高达10%的改性Rad52。首先，我们使用成熟的电泳迁移率变化分析测试了游离和SUMOylated Rad52结合DNA的能力。SUMOylated Rad52对ssDNA和dsDNA的DNA结合效率显著降低(A和B以及未显示的数据）。接下来，我们讨论了对DNA的低亲和力是否也会影响Rad52蛋白的退火活性。未修饰和SUMOylated Rad52均与互补的ssDNA链孵育，并监测其退火能力。重要的是，SUMOylated Rad52在退火反应中表现出较低的活性(补充图S2). 当ssDNA被RPA包被以反映体内条件和防止可能的DNA自修复效应(C和D）。未观察到SUMO酰化反应组分或ATP单独对DNA结合或单链退火活性的影响（数据未显示）。总之，仅10%的总Rad52蛋白的SUMO化足以显著降低Rad52对ssDNA和dsDNA的亲和力，并降低单链退火活性。
Rad52 SUMO化影响其生化活性。(一)Rad52的SUMO化抑制其与DNA的结合。增加量的Rad52或Smt3-Rad52（20、40、80、200 nM）与荧光标记的49米ssDNA（0.49µM核苷酸）在37°C下孵育10分钟。反应混合物在7.5%天然聚丙烯酰胺凝胶中溶解，DNA物种使用Quantity One软件（Bio-Rad）定量。(B类)绘制了（A）的结果。(C类)Rad52的SUMO化抑制其链退火活性。将标记的寡核苷酸-1（0.25µM核苷酸）和寡核苷酸-2（0.25μM核苷酸）分别与RPA（20 nM）在37°C下孵育3分钟。通过混合RPA包被的寡核苷酸和Rad52或Smt3-Rad52蛋白质（0.7、5、10、20 nM）启动退火反应，并在37°C下培养。培养8分钟后，去除9µl退火反应，并用0.5%十二烷基硫酸钠和500µg/ml蛋白酶K在37°C下处理10分钟。反应混合物在12%天然聚丙烯酰胺凝胶中溶解。(D类)绘制了三个独立实验结果的平均值。
Rad52的SUMO化不影响其与Rad51和RPA的相互作用
已知Rad52具有自关联性(8)并与包括Rad51在内的其他HR蛋白相互作用(10,11)和RPA蛋白(12,29,30). 我们已经测试了Rad52 SUMO化对这些相互作用的影响。由于本实验中Smt3蛋白含有FLAG标签，我们首先检测了抗FLAG琼脂糖珠上的Rad52寡聚状态。如所示A、 抗FLAG下拉后，修饰与未修饰Rad52蛋白的比率没有变化。尺寸排除色谱进一步证实了这一点（Sephacryl S400，见“材料和方法”一节），这表明SUMO化对Rad52的低聚物状态几乎没有影响(B） ●●●●。总之，Rad52的低聚状态不受SUMO化的影响。此外，单个Rad52低聚物之间发生的SUMO共轭程度相同(A和B）。然而，我们不能排除SUMO化和下拉分析期间SUMO修饰和未修饰亚基重新分布的可能性。未修饰和SUMOylated Rad52的电子显微镜也显示Rad52的低聚物状态没有差异（数据未显示）。
Rad52齐聚以及与RPA和Rad51的相互作用不受其SUMO化的影响。(一)Rad52的SUMO化不影响其齐聚状态。将40µl缓冲液S中的Rad52和Smt3-Rad52（2.3µM）与4µl抗FLAG琼脂糖在10µl含有200 mM KCl的缓冲液T中培养30分钟。用25µl SDS-Laemmli缓冲液清洗珠子并处理，以洗脱结合蛋白。在12%凝胶SDS-PAGE上分析含有未结合Rad52或Smt3-Rad52蛋白的上清液（S）、洗涤液（W）和SDS洗脱液（E）（各10µl），然后用考马斯蓝染色。箭头和符号散列分别表示抗FLAG IgG和高阶SUMOylated物种。(B类)凝胶过滤法分析Rad52齐聚状态。通过sephacryl S400柱过滤200µl缓冲液S中纯化的Rad52或Smt3-Rad52蛋白（9µM）。在10%SDS-PAGE上运行指示的部分，然后用考马斯蓝染色。大小标记物的洗脱位置显示为：TG、甲状腺球蛋白（669kDa）和CAT、过氧化氢酶（223kDa。(C类)Rad52的SUMO化不会影响其与Rad51的相互作用。将纯化的Rad52（M+C）或Smt3-Rad52（M+C）（22µM）与Affi-Rad51珠（4,6µM Rad51）混合在25µl缓冲液K中，并在4°C下培养30分钟。用25µl SDS-Laemmli缓冲液清洗珠子并处理，以洗脱结合蛋白。含有未结合Rad52或Smt3-Rad52蛋白的上清液、洗涤液和SDS洗脱液（各5µl）在12%凝胶中通过SDS-PAGE进行分析，然后使用抗Rad52抗体进行蛋白质印迹。(D类)Rad52的SUMO化不影响其与RPA的相互作用。使用纯化的Rad52（M）或Smt3-Rad52（M）（230 pmol）和Affi-RPA（1µM RPA）珠在37°C下与ssDNA（1μgФX174）预孵育10分钟来测试与RPA的相互作用。将这两种混合物混合在45µl缓冲液T中，然后在4°C下孵育30分钟，然后按照面板C进行分析。
接下来，我们检查了SUMO相关的Rad52与Rad51相互作用的能力。为此，我们生成了Affi-Rad51珠子，用作亲和矩阵，用于测试与未修改和修改的Rad52的交互作用。我们使用了一个没有N-末端齐聚结构域[Rad52（M+C）]的Rad52片段，以最小化其对SUMO化对Rad51相互作用的作用的影响。该实验的结果表明，SUMO修饰的Rad52与未修饰的蛋白质一样能够与Rad51结合(C） ●●●●。为了测试与RPA的相互作用，我们制作了Affi-RPA微珠，并进行了如前所述的下拉分析(5). 缺失N端和C端DNA结合域的Rad52（M）片段用于监测其与DNA-结合RPA相互作用的能力(5). 对于RPA关联，在Rad52（M）和SUMOylated Rad52（M）之间观察到很少或没有变化(D） ●●●●。综上所述，上述结果使我们得出结论，SUMOylation不会影响Rad52的自结合或其与Rad51和RPA的相互作用。
Rad52 SUMO化调节重组体内
为了解决Rad52 SUMO化的影响体内，我们检测了SUMO缺陷突变体(rad52-K43,44R，-K253R或-K43、44253R)使用多种重组分析。与之前的工作一致(15)，我们发现这些突变对有丝分裂期间的细胞内或细胞间重组率没有显著影响(和)但导致了从单链退火到基因转换事件的转变(). 此外，这些突变导致rDNA重组中轻微的超重组表型[, (16)].
表1。
的影响雷达52SUMOylation缺陷突变体对有丝分裂异等位基因和直接重复重组的影响
| 基因型 | 异等位基因重组率（×10−8)一 | 相对于野生型的折叠变化b条 | 直接重复重组（×10−6)一 | 相对于野生型的折叠变化 | P（P）-值（直接重复）c（c） | 分数Ura+GC公司 | P（P）-值（Ura+)d日 |
|---|
| RAD52型 | 219 ± 29 | 1 | 51 ± 8 | 1 | 不适用。 | 0.33 | 不适用。 |
| rad52Δ | 0.7 ± 0.4 | 0.005 | 2.3 ± 0.5 | 0.03 | <0.001 | 0.0004 | <0.001 |
| K43,44卢比 | 253 ± 48 | 1.2 | 107 ± 15 | 2.1 | 0.06 | 0.45 | <0.001 |
| K253R公路 | 179 ± 30 | 0.8 | 70 ± 11 | 1.4 | 0.13 | 0.37 | 0.075 |
| K43,44253米 | 216 ± 36 | 1 | 74 ± 11 | 1.4 | 0.16 | 0.40 | <0.001 |
表2。
的影响放射性52-K43,44253R反向重复基板的复合速率一
| 基因型 | 费率（10−8)一 | P（P）-值（χ2)b条 | 相对于野生型的折叠变化 |
|---|
| 重量 | 28 432 ± 4982 | 不适用。 | 1 |
| rad52Δ | 5 ± 1.4 | 未注明日期 | 0.0002 |
| rad51Δ | 5631 ± 1358 | 不适用。 | 0.20 |
| rad51Δ，rad52Δ | 0 | 0.002 | <0.00004 |
| rad51Δ，rad52K43，44253R | 4986 ± 1617 | 0.31 | 0.18 |
表3。
的影响雷达52rDNA重组的SUMOylation缺陷突变体
| 基因型 | ADE2型损失一
| 相对于野生型的折叠变化 |
|---|
| 损失率（×10−3) | P（P）-价值b条 | 半扇区/总计 |
|---|
| RAD52型 | 2.89 | 不适用。 | 112/38 700 | 1 |
| rad52Δ | 0.85 | <0.001 | 17/20 029 | 0.29 |
| K43,44卢比 | 3.71 | 0.095 | 79/21 279 | 1.28 |
| K253R公路 | 3.95 | 0.036 | 84/21 271 | 1.36 |
| K43、44253R | 9.51 | <0.001 | 380/39 939 | 3.29 |
我们还扩展了先前的研究，并检查了雷达52额外有丝分裂和减数分裂重组分析中的SUMO化突变体。我们发现了放射性52-K43,44253R表现出60%的野生型BIR水平()表明Rad52 SUMO化对这种重组有积极作用。在减数分裂中，尽管三者都有雷达52SUMO突变体在亮氨酸2轨迹(),放射性52-K43,44253R，但不是放射性52-K43,44R和rad52-K253R型细胞的孢子活力增加。这种效应不是由于这些突变蛋白结合ssDNA或dsDNA或退火互补DNA的能力发生改变，因为Rad52-K43,44253R、Rad52-K43,44R和Rad52-K153R蛋白在这些反应中表现出野生型活性在体外(补充图S1). 因此，对孢子活力的影响可能是由于Rad52的SUMO化影响其他减数分裂事件。综上所述，这些结果表明，Rad52 SUMO化促进了某些重组亚途径，而不利于其他亚途径，并可能有助于决定孢子活力的减数分裂过程。
表4。
的影响放射性52-K43,44253R防波堤诱导复制频率突变一
| 基因型 | 稳定Ura频率+(×10−2)带CFV/D8B-tg | P（P）-值（χ2)b条 | 相对于野生型的折叠变化 |
|---|
| RAD52型 | 3.94 ± 0.75 | 不适用。 | 1 |
| rad52Δ | <0.0002 | 未注明日期。 | <0.0039 |
| K43、44253R | 2.39 ± 0.44 | 0.0044 | 0.60 |
表5。
的影响雷达52SUMOylation缺陷型减数分裂重组突变体
| 基因型 | 减数分裂重组频率（×10−4)一 | 相对于野生型的折叠变化 | 产孢效率b条, % | 发芽效率c（c）, % | 相对生存能力d日 |
|---|
| RAD52型 | 118 ± 31 | 1 | 41 | 96 | 1 |
| rad52Δ | 0.06 ± 0.06 | 0.001 | 1 | 不适用。 | 0.10 |
| K43,44卢比 | 144 ± 38 | 1.2 | 58 | 69 | 0.95 |
| K253R公路 | 77 ± 24 | 0.7 | 55 | 88 | 0.84 |
| K43,44253米 | 109 ± 27 | 0.9 | 53 | 96 | 2.39 |
最后，我们还测试了体内通过细胞学分析定位Rad52 SUMO缺陷突变体。野生型以及Rad52-K43,44253R蛋白与YFP的融合表明，突变蛋白形成的病灶与野生型相似，但病灶持续时间明显缩短(P（P）= 0.01,t吨-测试）(A和B）。野生型和SUMO缺失突变病灶的YFP信号的平均强度相似，表明病灶持续时间的差异不是由于蛋白质数量的差异造成的（数据未显示）。
Rad52-K43,44253R病灶的持续时间比野生型短。自发野生型Rad52和突变型Rad52-K43,44253R病灶的时间推移。菌株W5094-1C(RAD52-YFP型)和ML228(rad52-K43,44253R-YFP型)如“材料和方法”部分所述，每隔5分钟通过荧光显微镜进行检查。(一)延时图像序列的典型示例。箭头标记Rad52焦点。(B类)时间推移分析的定量分析。所分析的细胞周期数为n个=173，对于野生型Rad52和n个对于Rad52-K43,44253R突变蛋白，＝252。未观察到病灶的细胞类别分别为62%和63%RAD52型和雷达52-K43、44253R（图中未显示）。
讨论
HR对基因组维护至关重要，必须严格控制以避免杂合性丢失、染色体易位和基因缺失(1,三). 最近的研究记录了几个HR蛋白和相关因子被SUMO蛋白翻译后修饰的例子。特别是，Rad52、Rad59和RPA的SUMO化缺陷导致HR和染色体重排的基因组上下文相关变化(31). 此外，在S期，通过与SUMOylated PCNA（增殖细胞核抗原）的相互作用，Srs2（一种通过破坏Rad51核蛋白丝阻止重组修复的解旋酶）被招募到复制叉，从而阻止Rad51核蛋白质丝在与复制叉相关的ssDNA上的组装(32).
在本研究中，我们努力确定SUMO化对Rad52蛋白的影响。使用在体外生化分析中，我们发现Rad52以ssDNA刺激并依赖羧基末端DNA结合域的方式进行SUMO化。该刺激对ssDNA具有特异性，因为dsDNA对SUMO化水平没有影响。此外，CD分析显示，Rad52与ssDNA的结合伴随着构象变化。通过用精氨酸替换每个SUMOylation靶向的赖氨酸，我们观察到在ssDNA存在的情况下增加SUMOylization直接指向残基K253。此外，我们发现与RPA结合而非与Rad51结合的ssDNA促进Rad52 SUMO化，这表明在细胞HR期间，Rad52 SUM化优先于Rad51核蛋白丝的形成。值得注意的是，虽然Rad52 SUMO化对其寡聚以及与RPA和Rad51的相互作用没有影响，但少量（<10%）的SUMO酸化Rad52显著降低了其对ssDNA和dsDNA的亲和力，并导致其DNA退火活性降低。
总的来说，我们的生化结果表明，当Rad52与被RPA包裹的切除的ssDNA尾部结合时，会发生构象变化，从而促进其高效SUMO化。因为SUMO化不会影响Rad52与RPA和Rad51的相互作用或其齐聚，所以这种修饰似乎不会通过改变蛋白质-蛋白质相互作用发挥作用。相反，我们的结果表明SUMO化减弱了Rad52链退火活性，并促使其与DNA分离。这可以提供一种机制，使适当的路径优于其他路径，或在DNA上动态交换Rad52。与以前的报告保持一致(15,16)，我们发现Rad52的SUMO化体内抑制rDNA重组，并在LEU2级轨迹。此外，我们还发现N末端（K43，44）和中心（K253）SUMO化位点都有助于这些效应。此外，我们在本研究中表明，Rad52 SUMO化降低了减数分裂孢子的活力，似乎有利于BIR事件。虽然这些影响的机制尚待确定，但它可能反映了这些路径中Rad52动力学的要求，或SUMO在促进这些路径特有事件中的作用。
最后，值得注意的是，SUMO对Rad52活性的影响有点像对胸腺嘧啶-DNA糖苷酶的影响，其SUMO化诱导其从碱性位点分离(33). 然而，与胸腺嘧啶-DNA糖苷酶不同，Rad52与几个额外的介质和重组蛋白协同作用，因此其调控更为复杂，任何单一调控形式的缺陷都可以通过其他机制缓冲。我们的体内结果表明，情况很可能是这样的，因为缺乏Rad52 SUMO化不会显著影响这里研究的几个有丝分裂或减数分裂重组过程。然而，观察到的重组途径使用的变化以及重组灶持续时间的变化雷达52SUMO酸化缺陷突变体表明Rad52的修饰确实会影响重组途径的选择或效率。一种有趣的可能性是SUMO化与其他Rad52功能（如拮抗Srs2）结合(34,35)，有助于微调重组修复的效率。此外，由于其他重组蛋白和Rad52相互作用因子也会发生SUMO化，这些因子的存在和修饰可能共同提供了一种质量控制机制，以根据底物类型和染色体环境指导HR途径的选择(36). 这项工作初步表征了氨酰化在HR中的作用；进一步的研究将需要我们进一步了解潜在的分子机制。
基金
威康信托国际高级研究奖学金（WT076476）；捷克科学基金会（301/09/317和203/09/H046）；捷克共和国教育、青年和体育部【授予ME10048；MSM0021622413和LC06030（授予L.K.）、MSM002622412（授予J.D.）和LC06010（授予R.Ch）】；丹麦科学、技术和创新署（致M.L.）；维伦·坎·拉斯穆森基金会（M.L.）；伦德贝克基金会（致N.E.B.）；RO1ES07061（发给P.S.）；R01GM080670拨款（给X.Z.）。开放存取费用的资金来源：Wellcome Trust（WT047276）。
利益冲突声明。未声明。
致谢
我们要感谢E.Johnson和B.Schulman提供了蛋白质表达质粒，并感谢我们实验室的所有成员进行了有益的讨论。
参考文献
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