生物化学杂志。2010年7月30日；285(31): 23810–23817.
氨酰转移速率决定了三酰-tRNA合成酶编辑途径的选择*
‡和‡§,1
克里斯托弗·弗兰克林
从‡细胞和分子生物学项目
§佛蒙特州伯灵顿市佛蒙特大学健康科学院医学院生物化学系，邮编：05405
从‡细胞和分子生物学项目
§佛蒙特州伯灵顿市佛蒙特大学健康科学院医学院生物化学系，邮编：05405
收到日期：2010年1月18日；2010年5月24日修订
- 补充资料
补充数据
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摘要
氨酰-tRNA合成酶水解由近同源氨基酸形成的氨酰腺苷酸和氨酰-tRNAs，从而提高翻译保真度。转移前和转移后编辑路径对保真度的贡献大肠杆菌用快速动力学研究了苏氨酸-tRNA合成酶（ThrRS）。在预稳定状态下，在二聚体ThrRS的活性位点中观察到同源苏氨酸和非同源丝氨酸的不对称激活，激活率相似。在不存在tRNA的情况下，丝氨酸腺苷酸被ThrRS催化结构域水解的速度是苏氨酸腺苷酸的29倍。血清转移到同源tRNA的速度仅比苏氨酸慢2倍。比较ATP消耗率与氨酰基tRNA消耗率的实验AA公司形成表明，只有当转移速度显著减慢时，预转移水解才有助于校对。因此，在ThrRS中，转移前和转移后编辑的相对贡献受氨基酰转移速率的调节。
关键词：氨基酸、氨酰基tRNA合成、氨酰tRNA合成酶、RNA-蛋白质相互作用、转移RNA（tRNA）、氨基酸编辑、保真度、苏氨酸
介绍
生物系统中基因信息的准确传递需要多种机制来提高和保持基因表达的保真度，尤其是在蛋白质合成中。蛋白质合成过程中每10000个氨基酸的1-3个错误主要源于解码错误(1)但可以由前面的步骤产生，包括氨酰-tRNA合成酶（ARS）催化的氨酰化反应2(2). 在两个半反应中的第一个反应中，ARS浓缩氨基酸和ATP形成非共价酶结合的腺苷酸，然后发生转移反应，生成氨酰-tRNA和AMP作为产物。这种高度准确的反应（误差约为1/105)反映了ARS仔细区分化学相似标准氨基酸和非标准氨基酸的能力(三). 尽管如此，ARS或其同源tRNAs的突变仍然会产生与重大分子病理相关的错误，尤其是在神经组织中(4).
不同于单个甲基的氨基酸对ARS构成了特殊的歧视挑战(三,5,6). 氨基酸上的附加甲基通常提供不超过～1 kcal/mol的增量结合能，将判别上限定为1/5(7). 为了解释生物系统中的歧视加剧，提出了“双筛子”模型(8). 大于同源物的氨基酸被氨酰化位点的“粗筛”排除，而较小或等位氨基酸被编辑位点的“细筛”从tRNA末端裂解。原则上，非共轭氨基酸可以通过增加腺苷酸水解（转移前编辑）或通过水解错酰化tRNA（转移后编辑）进行编辑。这两种反应中的一种或两种都可以在一个结构上不同于标准合成站点的专用编辑站点中正式发生。由于系统之间存在差异，并且没有对任何单个编辑ARS进行全面的动力学描述，因此转移前和转移后编辑机制对ARS整体保真度的相对贡献尚不清楚。
编辑功能广泛分布在两个结构不同的ARS类的成员之间。I类异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸（LeuRS）tRNA合成酶具有一个插入Rossmann折叠的离散CP-1结构域，该结构域是错酰化tRNA脱乙酰化的活性位点(5). 在许多一级系统中，已经建立了转移后编辑机制与CP-1域之间的联系(9,–11). 事实证明，对翻译前编辑作用的评估更加难以捉摸，因为可能存在tRNA依赖和tRNA依赖机制，以及关于活动地点的竞争性提案(12,–15). 蛋氨酸-tRNA合成酶（MetRS）通过形成环状内酯来编辑同型半胱氨酸，是翻译前编辑的最清楚的例子之一(16).
在II类ARS中，苯丙氨酸-（PheRS）的编辑功能也得到了类似的证明(17,–19)，丙氨酰-（AlaRS）(20,21)，苏氨酸-（ThrRS）(22)和脯氨酸-tRNA合成酶（ProRS）(23). 与I类酶共享一个保守的CP-1编辑域不同，II类ARS缺乏一个共同的编辑域。然而，有大量证据表明，转学后编辑在许多系统中的重要性，以及该活动在专业编辑领域的本地化(三). 关于翻译前编辑，丙氨酸的tRNA-independent-ATPase活性已被记录(21)和prolyl系统(24,25). 然而，这些机制在保真度保持中的作用尚不清楚，因为尚未通过详细的动力学分析进行研究。
ThrRS是代表性的II类α2具有与转移后编辑相关的专用N末端结构域、中心催化结构域和C末端反密码子结合结构域的同二聚体ARS(26). A催化锌2+活性位点中的离子直接与苏氨酸和丝氨酸的α-氨基和β-羟基进行配位，从而区分异构缬氨酸(27). 丝氨酸的结合受到多种机制的阻止，包括其对ThrRS活性位点的低亲和力和Ser-tRNA的脱酰作用苏氨酸在编辑域活动站点中(22,27,28). 结构和生物化学证据表明His-73可能是Ser-tRNA的一般碱催化水解的候选者苏氨酸(28,29). 基于先前的结构研究和未能观察到丝氨酸刺激的ATP水解，有人建议，转移后编辑足以解释所观察到的ThrRS的保真度(28,29). 这一结论尚未得到动力学分析的支持，其中详细比较了ThrRS在苏氨酸和丝氨酸底物上的活性。
编辑过程本质上是动态的，这突出了确定整个路径中特定单个速率常数速率的重要性，特别是对于与转移前和转移后机制相关的分支点。对于许多已被检测的II类ARS，氨基酸活化反应是不对称的(30,–32)，但在某些情况下，这种不对称性可以被同源tRNA调节(32,33). 这里，丝氨酸的编辑大肠杆菌应用预态和稳态动力学方法研究了ThrRS。发现ThrRS催化结构域主要通过提高腺苷酸周转率来区分丝氨酸。该机制的重要性取决于氨基酰转移的速率。
实验程序
酶和tRNA的制备
如前所述，表达并纯化了ThrRS和CCA添加酶(34)采用镍-硝基三乙酸亲和层析。活性组分通过SDS-PAGE鉴定，汇集，通过Centricon浓缩器低速离心浓缩，然后在缓冲液A（10 m）中透析米Tris，pH 8.0，100 m米KCl，10米米氯化镁2，3米米β-巯基乙醇）。将最终制剂储存在−20°C的50%甘油中。在实验中使用之前，测定活性部位浓度。在整个过程中，ΔN1N2 ThrRS的纯化包括10%的甘油。tRNA的完全修改版本苏氨酸由大肠杆菌如前所述的过度表达菌株(34).
ATP水解实验
这些测定基本上如前所述进行(35). 反应在37°C的缓冲液A中进行，缓冲液为1m米二硫苏糖醇，0.02单位/ml焦磷酸酶，3 m米[γ-32P] ATP，2μ米存在或不存在3′-脱氧A76 tRNA的酶（野生型ThrRS或ΔN1N2 ThrRS）。与含有苏氨酸的同源氨基酸在5 m米而非认知反应包含500 m米 我-丝氨酸。在活性炭上吸附之前，将10μl反应等分试样在7%高氯酸中淬火。以12000 rpm旋转混合物并旋转3 min-32P] 聚丙烯我在100μl上清液中用闪烁计数法测定。从所有测定中减去在不存在酶的情况下ATP水解的背景速率。数据分析如下“数据分析”所述
瞬态动力学实验
通过使用RQF-3快速化学猝灭仪（德克萨斯州奥斯汀Kin-Tek）测定预稳态腺苷酸化反应速率。所有反应都是在37°C、pH值为8的缓冲液A中进行的。反应条件和薄层色谱法的实验工作与HisRS的反应条件和实验工作相同(32,33). 作为技术约束，[α-32P] ATP浓度固定在100μ米以获得所需的信噪比(24,25,32,33). 在将TLC板暴露于Bio-Rad K屏幕后，使用Bio-Read Quantity One软件计算ATP到AMP的分数转换。如“数据分析”所述，所得曲线拟合到一个具有双指数项后接线性相位的复杂方程。如前所述，采用转移后编辑缺陷的H73A ThrRS进行单循环氨基酰转移实验(34). 简单地说，预先形成的ThrRS-[14C] 丝氨酸腺苷酸与tRNA快速混合，然后通过添加3米NaOAc公司。如“数据分析”所述，使用从时间点收集的10 ms至1 s的数据构建一阶进度曲线
溶剂腺苷酸水解
合成了腺苷酸就地在～5分钟的反应中，含有2μ米ThrRS，100μ米[α-32P] ATP，5米米苏氨酸，或500 m米缓冲液A中的丝氨酸。淬火溶液（0.5米添加EDTA（pH 8.0，0.2%十二烷基硫酸钠）以终止反应并使酶变性。在TLC板上对一μl反应等分样品进行色谱分析，并使用Bio-Rad荧光成像仪进行检测。通过拟合指数衰减方程对所得数据进行分析，如“数据分析”所述
ATP消耗与氨酰-tRNA形成（能量效率）实验
在37°C和pH 8下，使用相同浓度的底物和反应条件，在多种周转条件下平行进行与标记氨基酸和ATP的氨基酰化反应。为了监测ATP的消耗和氨酰-tRNA的形成，反应包含100μ米ATP，1米米氨基酸和15μ米tRNA苏氨酸在ATP消耗量之后的实验组分中，100μ米[α-32P] ATP被用作底物，尽管氨基酰-tRNA生成后的其他成分使用了1 m米 14C标记氨基酸作为标记底物。在以下情况下，通过三氯乙酸沉淀监测产品形成14病例中的C-标记氨基酸和TLC[α-32P] ATP。涉及野生型ThrRS和含有0.1μ米ThrRS野生型或2μ米当丝氨酸为底物时，H73A ThrRS。涉及H73A、H309A ThrRS和苏氨酸的反应采用的酶浓度为0.5μ米，尽管那些具有丝氨酸的使用了5μ米双突变酶。通过线性回归分析结果图(33).
数据分析
测定[α]形成的TLC实验-32P] AMP和[α-32P] AA-AMP适合爆裂方程式1,
哪里k个1是突发相位的速率，以及k个2是AA-AMP形成的稳态速率常数，以及一表示突发相位的振幅。或者，方程式2与双指数项和线性相位一起使用，
哪里k个1和k个2分别是活性位点1和活性位点2中AMP（或Thr-AMP）形成的速率常数；一1和一2表示各自的振幅，以及k个三表示腺苷酸周转的稳态速率。溶剂腺苷酸水解速率符合以下指数衰减方程式3,
哪里一表示振幅；k个表示衰减率，以及C类代表年抵消。单循环氨基酰转移反应监测[14C] Ser-tRNA符合单指数方程式4,
哪里k个反式是传输速率；一是振幅，以及C类是年抵消。数据用万花筒绘制。
编辑效率可以根据费希特计算(36). 在一种简单的处理中，在一个具有独立分支的酶中间体上有一条分支通路，用于生产性合成和编辑，腺苷酸酶的部分进入氨酰基tRNA产物(F类第页)由提供方程式5,
哪里k个秒是腺苷酸酶转化为氨酰-tRNA的速率（本质上是氨酰转移速率），以及k个d日是腺苷酸水解破坏的速率。每摩尔生成的氨酰-tRNA消耗的ATP分子数量等于1/F类第页例如，如果氨酰-tRNA的形成速率和腺苷酸复合酶的破坏速率相等，则在转移之前，50%以上的腺苷酸络合物被水解，每形成一摩尔氨酰-tRNA，就会消耗2摩尔ATP。
结果
在ThrRS中存在丝氨酸时发生传输前编辑
丝氨酸和苏氨酸腺苷酸类似物配合物中ThrRS的结构研究(27)表明ThrRS活性位点缺乏区别丝氨酸的结构特征(补充图1). 翻译前编辑的一个迹象是，相对于同源氨基酸，存在非同源氨基酸时ATP的消耗增加(12). 为了测试ThrRS是否表现出翻译前编辑，在同源苏氨酸和非同源丝氨酸存在的情况下进行ATP水解分析。苏氨酸和丝氨酸诱导ATP水解率分别为0.08和1.1 min−1分别代表丝氨酸的14倍刺激(一). 在没有酶或氨基酸的情况下，ATP水解可以忽略不计。tRNA的非氨基酰化版本的包含苏氨酸（3′-脱氧A76）不影响ATP水解率(B类). 一些翻译前编辑模型提出腺苷酸在水解之前转移到编辑活性位点(37,38). 在ATP水解实验中，使用缺少转移后编辑的N末端缺失突变型ThrRS（ΔN1N2 ThrRS）对这种可能性进行了测试(22). 使用ΔN1N2 ThrRS对丝氨酸和苏氨酸进行ATP水解的稳态速率与使用全长酶获得的速率相当(C类). 总之，ThrRS是一种高效的丝氨酸依赖型ATP酶，该功能独立于经典编辑域。
ThrRS中丝氨酸刺激的ATP酶活性在没有编辑结构域和tRNA的情况下发生。 A–C用野生型ThrRS描述37°C和pH 8下的稳态ATP水解分析(TRSWT公司)没有tRNA(一)，野生型ThrRS(TRSWT公司)和3′d-A76 tRNA苏氨酸(B类)，或无tRNA的ΔN1N2 ThrRS(C类). ATP转换是通过形成[γ-32P] 聚丙烯我在含有ThrRS或ΔN1N2-TrRS（2μ米), [γ-32P] ATP（3米米)和苏氨酸（5米米) (填充的正方形)或丝氨酸（500 m米) (实心圆圈)或者没有酶(无Enz)/氨基酸(实心三角形).误差线表示三个独立实验的平均值±S.D。
苏氨酸和丝氨酸存在下氨基酸活化的不对称催化
大多数II类ARS是二聚体或二聚体的倍数，其对编辑功能的影响尚未被研究。最近，在没有tRNA的情况下，观察到二聚体II类HisRS的氨基酸激活率与活性位点1的比率存在差异(k个1)超过活性部位2的速率(k个2)乘以25倍(32,33). 在随后的移交中，观察到以速率常数为特征的稳态k个三(一). 这可能代表腺苷酸形成和水解的缓慢重复循环(32,33). 为了探索ThrRS中的这一机制，在存在过量氨基酸和[α-32P] ATP，在生成[α-32P] AMP和[α-32P] 薄层色谱法测定AA-AMP(补充图2，一和B类). 正如之前在HisRS中看到的那样，生成的进度曲线最好用两个指数来描述(k个1和k个2)然后是线性稳态阶段(k个三) (,B类和C类).
在缺乏tRNA的情况下，ThrRS对氨基酸的激活是不对称的。 一，不对称催化基本机理的图示。ThrRS的两个活性位点描述为圈子具有k个1和k个2表示两个活性位点的腺苷酸合成速率。速率常数k个三表示腺苷酸周转的稳态速率。[α]的形成-32P] 在TLC上监测AMP(补充图2，一和B类)，将数据绘制为苏氨酸存在下的预稳态进程曲线(B类)和丝氨酸(C类). 实验使用10μ米ThrRS活性位点，100μ米[α-32P] ATP和5米米苏氨酸或150 m米丝氨酸。显示了来自三个独立实验之一的具有可比性结果的代表性数据。进度曲线拟合为具有单一指数和线性相位的突发方程(红线)或具有线性相位的双指数(黑线). 这个插入扩大时间刻度以显示反应的最早部分。
在同源底物苏氨酸的饱和浓度下，活性位点1中AMP的形成速率(k个1=17.7秒−1)比活性部位2的测量值高8倍(k个2=2.1秒−1). 两个活性部位的AMP形成幅度几乎相等（活性部位1为0.5与活性部位2）为0.4。AMP形成的稳态速率(k个三)在0.001秒时可以忽略不计−1(). 然而，与HisRS相比，苏氨酸腺苷酸的稳态积累率较高。与AMP形成相比，苏氨酸-（和丝氨酸-腺苷酸，见下文）形成的过程曲线可以很容易地拟合为单指数或双指数方程，振幅相对于活性中心的浓度来说是亚化学计量的(补充图3，一和B类). 随着时间的推移，亚化学计量浓度的腺苷酸积累表明，新形成的分子被分割成一个保持稳定结合的群体和一部分在酶上发生水解。这还有待进一步调查。
表1
无tRNA条件下ThrRS和HisRS合成腺苷酸的速率常数
在pH 8和37°C的快速急冷流动仪器中进行ThrRS介导的腺苷酸化反应。反应产物通过TLC进行解析，并按照“实验程序”进行量化。数值代表三个以上独立实验的平均值，具有标准误差。ND表示未确定。
| ARS/氨基酸 | 形成速率[32P] 通过快速化学淬火测量AMP
| 参考文献。 |
|---|
| k个1（个）−1)活动站点1 | k个2（个）−1)活动站点2 | k个三（个）−1)稳态 |
|---|
| 苏氨酸/苏氨酸 | 17.7 ± 4.2 | 2.1 ± 0.33 | 0.001 ± 0.0002 | 这项工作 |
| ThrRS/丝氨酸 | 3.8 ± 1.2 | 0.15 ± 0.02 | 0.029 ± 0.003 | 这项工作 |
| 组氨酸/组氨酸 | 18.1 ± 4.7 | 0.68 ± 0.16 | ND（无损检测） | 32 |
以丝氨酸为氨基酸底物，AMP在爆发期的形成速度在位点1比位点2快约25倍(). 与振幅基本相等的苏氨酸不同，丝氨酸的第二指数振幅更高，这可能是编辑的结果。同源丝氨酸和同源苏氨酸之间的另一个显著差异是k个三参数，一个可能反映seryl-adenylate反复合成和破坏的线性速率。值得注意的是，在丝氨酸存在下AMP形成的稳态速率（0.029 s−1)是苏氨酸存在时的29倍（0.001s−1) (). 这个k个三参数是在丝氨酸相对于苏氨酸的情况下显著更大的奇异速率常数。Ser-AMP的形成速率也以与苏氨酸类似的方式进行分析(补充图3B类). 形成的Ser-AMP与活性位点总数的比率也小于1，这说明Ser-AMP不是从活性位点主动释放的。
在这些条件下形成的AMP反映了腺苷酸在酶上水解产生的AMP和腺苷酸分解后在溶液中水解产生的AMP的总和。为了解决这两个单独事件的速率，测定了溶剂诱导腺苷酸水解的速率。在溶液中，发现苏氨酸和丝氨酸腺苷酸以几乎相同的速率衰减（0.0007和0.0008秒−1) (补充图4，一和B类). 这些速率比k个三在丝氨酸存在的情况下(). 因此，正如之前在ProRS中观察到的那样，在ThrRS活性位点中的seryl-adenylate水解可能是主要途径(25).
在氨酰基转移步骤中不发生氨基酸歧视
当存在功能性同源tRNA时，由非同源氨基酸形成的腺苷酸可以被水解或转移到tRNA的3′端。如果转移速度实质上大于水解速度，则很少会发生翻译前编辑；如果是类似的或更少的，那么翻译前的编辑可以提高保真度(36). 按照“实验程序”中的描述，使用快速化学猝灭在一个单循环实验中测量使用非共轭seryl-adenylate的氨酰转移速率。为了防止Ser-tRNA水解苏氨酸，该实验使用H73A ThrRS进行，它将Ser-tRNA脱乙酰化苏氨酸比野生型ThrRS慢7000倍(29). 7.8 s的值−1对于k个反式是通过单次翻转实验获得的()，仅比野生型ThrRS氨基酰转移苏氨酸的速度慢2倍(34). 该值是AMP形成速度的2倍和52倍(即k1和k个2)在丝氨酸腺苷酸形成的爆发阶段，但比k个三腺苷酸形成和水解的表观稳态速率().
丝氨酸的氨酰基转移相对腺苷酸的周转较快。[14C] seryl-adenylate-H73A ThrRS（8–10μ米)按照“实验程序”中的描述制备，然后与tRNA（4-6μ米)在10 ms–1 s的快速淬火条件下，然后将所得曲线拟合为一个单指数方程，以导出氨酰转移速率(k个反式). 这个误差线每个时间点代表三个独立实验的平均值±S.E。
ThrRS法合成氨酰-tRNA的能量效率
考虑到不同的编辑机制，一种可能性是同源tRNA加速了腺苷酸水解酶的速度。在转移后编辑被阻断的情况下，预计这将产生相对于每摩尔氨酰-tRNA形成的ATP的过量消耗(25,39). 为了解决ThrRS的这种可能性，在多次周转实验中测定了ATP消耗量与氨酰-tRNA产物的比率，按照“实验程序”中的描述，这两个参数同时遵循。为了消除任何转移后编辑的可能性，还测定了H73A ThrRS和H73A，H309A ThrRS的比例，这两种病毒都含有H73A突变(28,29). 在苏氨酸存在下，AMP形成的稳态速率（0.16±0.01 s−1)和Thr-tRNA苏氨酸（0.15±0.01秒−1)野生型ThrRS的形成是相等的，表明每摩尔同源腺苷酸在数量上转化为氨酰化-tRNA产物(一并在中进行了总结). 以H73A-ThrRS为酶，非共轭丝氨酸为底物，AMP的形成速率为0.013±0.0002 s−1)也相当于Ser-tRNA的形成速度苏氨酸（0.015±0.0003秒−1) (B类并在中进行了总结). 每摩尔Ser-tRNA消耗的[ATP]摩尔数接近1:1苏氨酸形成表明Ser-tRNA的效率苏氨酸H73A ThrRS的合成接近100%。在存在功能性tRNA的情况下，TLC既没有检测到苏氨酸也没有检测到丝氨酸腺苷酸苏氨酸这也与氨酰基转移的快速速率一致，相对于在没有tRNA的情况下测量的腺苷酸转换速率。因此，在腺苷酸水解和氨酰基转移之间的分支路径中，几乎所有的血清腺苷酸都转移到tRNA苏氨酸.
丝氨酸和苏氨酸存在下能量效率的测定。[α]的形成-32P] 放大器(实心圆圈)和形成[14C] 氨酰-tRNA(填充的正方形)在pH 8.0和37°C下，使用100μ米[α-32P] ATP，1米米 14C标记氨基酸底物，15μ米tRNA苏氨酸.一, 0.1 μ米以野生型ThrRS和苏氨酸为底物；B类, 2 μ米H73A-ThrRS和丝氨酸作为底物；C类, 0.5 μ米H73A、H309A-ThrRS和苏氨酸作为底物；D类, 5 μ米H73A、H309A ThrRS和丝氨酸作为底物。这个误差线与每个时间点形成的反应产物量相关的是三个独立实验的平均值±S.E。
表2
使用野生型和突变型ThrRS估算苏氨酸和丝氨酸存在时的能量效率
在pH 8.0和37°C下进行氨酰化反应。为了确定ATP和AA-tRNA的消耗量，[α-32P] ATP和14C标记氨基酸分别用于平行反应。以苏氨酸为底物，H73A为转移后编辑缺陷的丝氨酸突变体，使用ThrRS野生型酶。当研究氨酰转移的效果时，使用H73A/H309A双突变体。绘制进度曲线并进行线性回归分析。数值表示三个实验的平均值±S.E。
| 氨酰化酶/AA底物 | 监控的产品 | 产品形成率 | ATP消耗与AA-tRNA形成的比率 |
|---|
| | 秒−1 | |
| 野生型ThrRS/Thr | [α-32P] 放大器 | 0.16 ± 0.01 | 1 |
| [14C] 苏氨酸核糖核酸苏氨酸 | 0.15 ± 0.01 | |
| H73A阈值/序列 | [α-32P] 放大器 | 0.013 ± 0.0002 | 0.9 |
| [14C] Ser-tRNA苏氨酸 | 0.015 ± 0.0003 | |
| H73A/H309A阈值/阈值 | [α-32P] 放大器 | 0.01 ± 0.0005 | 1 |
| [14C] Thr-tRNA苏氨酸 | 0.01 ± 0.001 | |
| H73A/H309A阈值/序列 | [α-32P] 放大器 | 0.002 ± 0.0002 | 2 |
| [14C] Ser-tRNA苏氨酸 | 0.001 ± 0.0001 | |
因此，只有在传输速度显著放缓的情况下，传输前编辑才是重要的。该假设在使用H73A、H309A ThrRS双突变体进行的测量中得到了解决。第一个突变消除了转移后的编辑，尽管第二个突变将氨酰基转移率降低了242倍，对氨基酸活化的影响最小(34). 以苏氨酸为底物，AMP形成速率和Thr-tRNA苏氨酸形成基本相同（0.01±0.001秒−1)用于H73A、H309A ThrRS(C类，总结于). 然而，以丝氨酸为底物时，AMP的形成速率（0.002±0.0002 s−1)比Ser-tRNA的比率高2倍苏氨酸形成（0.001±0.0001 s−1) (D类并在中进行了总结). 因此，H73A、H309A ThrRS的ATP消耗率是Ser-tRNA消耗率的2倍苏氨酸合成表明，当氨基酰基转移受到影响时，翻译前编辑可以提高保真度。
讨论
涉及编辑的生化反应依赖于动力学分配，并具有支点，其中中间体要么经过水解（直接在酶上或释放到溶液中后），要么在下一步转化(12,36,40). 在氨酰化过程中，氨酰基腺苷酸和氨酰基tRNA都是受动力学分配影响的中间体。通过快速化学猝灭来测量ThrRS催化的整个氨酰化反应序列中基本步骤的速率，可以容易地识别那些指示氨基酸特异性的步骤，从而评估转移前和转移后编辑对整体保真度的贡献。通过使用这种方法，我们发现ThrRS刺激腺苷酸丝氨酸的水解，这是一种转移前编辑的形式。出乎意料的是，腺苷酸的形成速度就其本身而言丝氨酸和苏氨酸的氨酰基转移几乎相同。如下文所述，这对转移前和转移后编辑机制对整体保真度的相对贡献具有重要影响。
非同源腺苷酸的酶促周转在Ⅱ类ARS中广泛分布
在这项研究之前，已经得出结论，ThrRS在很大程度上防止了tRNA的错误酰化苏氨酸通过原核生物和真核生物中定位于保守N末端结构域的转移后活性。过去工作的失败(22,27)检测此处报告的ATP酶活性可能反映了使用次优条件和检测，包括氨基酸和酶浓度过低以及使用木炭捕获产品。这里报告的数据表明，在氨基酸结合饱和的条件下，ThrRS以类似的速率激活苏氨酸和丝氨酸，即在腺苷酸合成化学的水平上，对丝氨酸的区分相当温和（不到10倍）。这与焦磷酸盐交换实验的结果一致，其中k个猫苏氨酸值（36 s−1)和丝氨酸（26秒−1)活性被确定为类似(27). 如下文进一步详细讨论的，当tRNA缺失时，丝氨酸腺苷酸转换的稳态速率明显快于苏氨酸腺苷酸酶(). 而不是促进腺苷酸从合成酶活性位点扩散到之前提出的编辑位点(38,41)，该活性被证明定位于氨酰化活性位点，而不是编辑位点(,一和C类). 氨酰化活性部位中负责水解的残留物尚未确定。ThrRS对丝氨酸的选择至少涉及三种离散机制，包括初始结合水平的区分(27)增强丝氨酸腺苷酸的水解（本工作），以及丝氨酸tRNA的脱乙酰化苏氨酸(22,28). 类似的机制可能在相关的II类ARS AlaRS、ProRS和seryl-tRNA合成酶中起作用(21,25,42). 相比之下，第一类LeuRS中的翻译前编辑被tRNA刺激亮氨酸(14).
ThrRS区分苏氨酸和丝氨酸的结构基础尚不明确(27). 虽然苏氨酸和丝氨酸的β-羟基与活性中心Zn之间有接触2+离子是保守的，Thr-482、Ala-513和苏氨酸侧链之间的相互作用不是(补充图1). ThrRS活性位点对丝氨酸的低亲和力(27)阻止检测到伴随苏氨酸结合和腺苷酸形成的诱导的适配构象变化(43). 一种可能性是，与丝氨酸结合相关的活性位点基团的次优排列允许不定溶剂分子进入，从而促进水解。丝氨酸对ThrRS活性位点腺苷酸转换的刺激使人想起ProRS的ATP酶行为(24,25)、HisRS(33)和seryl-tRNA合成酶(33,42). 在每一个II类ARS中，重复的腺苷酸合成和分解似乎发生在经典II类活性部位。II类ARS活性位点的进化似乎反映了同源腺苷酸的高效合成和近同源物的便利水解之间的平衡。
氨酰基转移对ThrRS中氨基酸选择保真度的影响
这项工作的一个新发现是，苏氨酸和丝氨酸以类似的速率进行氨酰转移(). 这表明氨基酰基转移步骤，就像与腺苷酸形成相关的化学步骤一样，在ThrRS系统中赋予很少的氨基酸特异性。尽管这是ProRS在与丙氨酸的异酰化反应早期提出的(25)，本文报道的结果提供了同源氨基酸和近同源氨基酸的氨酰基转移的具体定量比较。在谷氨酰胺-tRNA合成酶中k个化学这反映了活化和氨酰转移，谷氨酸比同源谷氨酰胺至少慢165倍(44). 在这种非编辑的ARS中，有相当大的化学水平介导的特异性，这让人想起DNA聚合酶(三). DNA聚合酶对输入核苷酸的错误定位可能会对反应施加不利的几何或空间限制，为合并提供一个显著的高能屏障(45). 对于小于同源氨基酸的氨基酸，预计不存在此类屏障。相反，较小氨基酸的熵惩罚增加，但在结合和活化步骤中这些都是“预先支付的”，这说明了对氨基酰转移速率的影响有限。
比较tRNA存在和不存在时的预转移编辑速率以及不对称的重要性
在不具备氨基酸编辑功能的HisRS中，二聚体第一位点的氨基酸活化速度比第二位点快25倍，第二摩尔腺苷酸很容易通过色谱法去除(32,33). 然而，在存在氨基酰化同源tRNA的情况下，不对称性消失，并且这两个位点催化活化的速度不快于氨酰化的总速度(33,46). 在这里，我们发现ThrRS在与同源苏氨酸和近同源丝氨酸底物相关的tRNA-independent激活反应中表现出类似的性质。对于苏氨酸，AMP在一个亚基中的形成速度是另一个亚单位的8.4倍，尽管对于丝氨酸，一个位点的速度是第二个位点的25倍(). 我们将AMP产物形成曲线的双指数性质以及拟合方程中两个指数的近似等效振幅作为ThrRS tRNA依赖二聚体功能不对称的假设证据。双指数行为的其他可能解释包括存在两种或两种以上不同形式的ThrRS，和/或每个活性位点中两种不同的氨基酸活化率。一些观察结果反驳了这些替代性解释。如果存在不同化学形式的ThrRS，我们将在纯化和/或结晶过程中观察到改变和复杂的稳态动力学、氨酰转移的多种速率以及多种物种。所有这些都没有观察到。此外，在突变体酶（如H309A-ThrRS）中存在tRNA时，也可以揭示ThrRS形成AMP的不对称性，在这种酶中转移速度显著减慢(34). 这让人想起与HisRS版本中观察到的一个亚单位对应的腺苷酸形成爆发，其中两个二聚体中的一个因突变而失去活性(32). 因此，这两个系统之间高度相似的数据优势以及显著的无显著差异，有力地证明了ThrRS在缺乏tRNA的情况下不对称地激活腺苷酸形成，但它转化为对称速率()当tRNA存在时。
这两个系统之间的一个不同之处是ThrRS对苏氨酸和丝氨酸腺苷酸的明显积累。在tRNA缺失的条件下腺苷酸和AMP的积累强烈表明，对于第一次周转，形成的腺苷酸中有很大一部分被迅速水解。在这里，苏氨酸和丝氨酸的行为差异是值得注意的。苏氨酸没有翻译前编辑，因此必须抑制产物的离解、底物的重新结合和新一轮腺苷酸合成。根据观察，AMP被观察为ThrRS-tRNA中的一种不定结合配体苏氨酸晶体结构当在纯化或结晶过程中不添加时，同源氨基酸的转移前编辑似乎在AMP释放水平上被阻断(26).
对于需要编辑的近同源底物如丝氨酸，两种速率(k个1和k个2具有k个1>k个2)在爆发阶段以及较慢的线性阶段记录(k个三)这很可能代表了seryl-adenylate再合成和破坏的稳定速率。仅仅这些实验并不能唯一地建立物理过程k个三是速率常数；它可能代表底物再结合、新腺苷酸形成或AMP释放的极限速率。然而，它显然是丝氨酸相对于苏氨酸的一个加速速率，其大小（0.029 s−1)等于ProRS报告的丙氨酸翻译前编辑的tRNA依赖率(25).
为了了解AMP的形成速率如何在总氨酰化的背景下发生改变，比较tRNA存在和不存在时测定的速率是有用的。当苏氨酸或丝氨酸是底物且存在tRNA时，既没有腺苷酸的积累，也没有AMP的突然合成，表明tRNA的存在抑制了tRNA与苏氨酸和丝氨酸在缺乏tRNA的情况下第一次转换中腺苷酸的快速水解(). 如之前对HisRS和ThrRS的研究所示，tRNA因此起到协调二聚体两个活性位点的活性的作用，从而使腺苷酸合成速率正常化(34,46). 基于消耗的ATP相对于形成的氨酰基tRNA的比率的实验()，只有一种情况导致ATP消耗过多（从而导致传输前编辑）。这是丝氨酸作为底物和H309A、H73A ThrRS作为酶的组合(和). 如下文所述，与此特定实验场景相关的速率数据限制了可能的翻译前编辑速率。
以先前的观察为背景，丝氨酸存在下AMP形成的三种速率(k个1，k2、和k个三)可以与中的数据进行比较导出翻译前编辑的一致模型。对于三种速度中最快的，k个1在氨酰基转移没有明显减慢的情况下，翻译前编辑的速度将产生大量ATP消耗。未观察到这种情况(B类). 这一快速速率还可以预测ThrRS-丝氨酸腺苷酸复合物的快速分解，从而可以阻止其通过旋转色谱法进行分离，而这也没有发生。因此，k个1不太可能代表翻译前编辑的速度。这就留下了一个k个2（0.15秒−1)和k个三（0.029秒−1). 相对于丝氨酸氨基酰转移的测量速率，k个2慢了52倍，而k个三速度慢268倍。虽然两者之间存在明显的数字差异k个2和k个三，就研究的总体中心发现而言，与任一价值相关的定性结论是相同的。在这两种情况下，翻译前的编辑将明显慢于氨基酰转移的速度，因此只有当氨基酰转移速度显著减慢时，翻译前编辑才会显示出来。
作为进一步的比较点k个2和k个三可以用于计算两种情况下各自的编辑成本，并且这些成本会产生不同的预测。使用费希特的方法(36)如“实验程序”所述，可以使用以下任一方法计算氨酰-tRNA合成的效率k个2或k个三作为对翻译前编辑速度的估计，这些导致了不同的ATP消耗值。对于H309A，H73A ThrRS突变体k个反式（丝氨酸）=0.031秒−1可以根据单个营业额转移率（0.06秒）进行估算−1)H309A ThrRS在苏氨酸存在下(34)与丝氨酸相关的比率相对于苏氨酸下降了50%(). 使用以下任一值k个2或k个三，对于F类第页（形成产品的分数）k个2值为0.51k个三将这些值转换为消耗的ATP的化学计量单位，我们得出以下值5.8：k个2和1.9k个三。在实验中，获得值2(). 考虑到转移前编辑速率是一个稳态值，并且ATP消耗的化学计量是从产物形成的稳态斜率得出的，这种间接速率计算分析表明k个三对编辑速度的估计可能比k个2.
氨酰基转移在ThrRS编辑通路选择中的作用
因此，根据所示数据和上述论点，在野生型或H73A ThrRS的情况下，翻译前编辑对保真度的贡献最小，但当传输速度显著减慢时，如H73A、H309A的情况，这一点就变得很重要。引人注目的是，最近对I类异亮氨酸和缬氨酸RNA合成酶编辑特性的比较表明，这一结论可能对这两类ARS都适用。缬酶催化的氨酰转移速度至少比异亮氨酸-tRNA合成酶快150倍，这与缬基-tRNA合合酶只使用转移后编辑的观察结果有关，而异亮氨酸-tRNA合成酶则使用这两种方法(47). 考虑到valyl-tRNA合成酶和ThrRS是两类ARS中每一类的代表，这就提出了一种可能性，即对转移前或转移后编辑机制的偏好可能是由两类中类似的机械约束驱动的。
结论
在这里，我们证明了ThrRS的催化结构域具有排斥非共轭丝氨酸的固有能力。在没有tRNA的情况下，同源苏氨酸和非同源丝氨酸相对于二聚体以不对称速率被激活。丝氨酸腺苷酸以比苏氨酸高29倍的稳态速率水解。无论是氨基活化率还是丝氨酸活化率都没有差别就其本身而言或氨基酰转移。传输步骤的速度足够快，与腺苷酸周转率相比，除了H73A、H309A ThrRS外，传输前编辑对整体保真度的贡献很小。这里提出的ThrRS氨酰化的最小动力学方案强调了氨基酸活化和氨酰转移在确定氨基酸特异性方面的作用。因此，将预稳态动力学应用于其他编辑型ARS可能同样有助于确定不同可能的编辑路径中哪个是首选路径。
确认
我们感谢加州大学圣巴巴拉分校的约翰·佩罗纳博士对手稿的批判性阅读。
2使用的缩写如下：
- ARS公司
- 氨酰-tRNA合成酶
- ThrRS公司
- 苏氨酸-tRNA合成酶
- HisRS公司
- 组氨酸-tRNA合成酶
- ProRS公司
- 脯氨酸-tRNA合成酶。
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