结果
TgCRND8小鼠脑内纤维蛋白（原）清除延迟
纤维蛋白（原）在AD患者的大脑中积聚(Fiala等人，2002年;Ryu和McLarnon，2009年)和人淀粉样前体蛋白（APP）转基因TgCRND8小鼠(Paul等人，2007年). 由于对小鼠纤维蛋白（原）积累的一种解释是血液中纤维蛋白原水平较高，我们测量了野生型（WT）和TgCRND8小鼠的纤维蛋白原含量，没有发现差异(图S1A). 第二种可能性是TgCRND8小鼠的血液高凝，但WT和TgCRND8小鼠的凝血时间相同(图S1B). 第三种选择是增加AD小鼠纤维蛋白（原）的持久性。因此，我们研究了这些小鼠是否增加了注入大脑的纤维蛋白原的稳定性。将荧光标记的人类纤维蛋白原注射到9周龄和6个月龄的TgCRND8小鼠及其同窝小鼠的海马中，并于第二天处死(). 使用两个不同年龄的转基因品系，我们可以确定纤维蛋白原清除率的差异是否与病理程度相关。在9周龄时，TgCRND8小鼠尚未完全发展成AD病理学，Aβ水平很低，而在6个月龄时，它们有丰富的淀粉样斑块和CAA(Chishti等人，2001年). 与年龄较大的小鼠相比，9周龄TgCRND8小鼠及其WT同窝小鼠几乎完全清除了注射的纤维蛋白原(). 然而，注射的纤维蛋白（原）在6个月大的小鼠中持续时间更长，与WT相比，TgCRND8小鼠的清除延迟了近三倍(). 与纤维蛋白（原）相比，6个月大的TgCRND8和WT小鼠的牛血清白蛋白（BSA）清除率相似()表明AD小鼠大脑中纤维蛋白（原）清除率受损和持续性增加是纤维蛋白原的特异性。
AD小鼠大脑不能有效清除纤维蛋白（原）用荧光标记纤维蛋白原（FBG-488）立体定向注射TgCRND8及其非转基因同胞（WT）。注射后一天，6个月大的WT（A）和TgCRND8（B）小鼠注射部位FBG-488（绿色）的典型共焦瓷砖扫描图像。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺，200μm。9周龄和6个月龄注射小鼠FBG-488区域的定量（C）显示淀粉样蛋白负荷和病理程度影响纤维蛋白（原）的清除。另一组6个月大的小鼠（D）也注射并定量了控制分子四甲基罗丹明-BSA（BSA-Rhod）。数值代表3-4只小鼠/组的平均值±SEM*p<0.05；TgCRND8号机组与重量。
为了检测纤维蛋白原的荧光标记是否干扰清除过程，将纯化的未标记人纤维蛋白原注射到6个月大的TgCRND8和WT小鼠中，并通过免疫染色进行检测。未标记的纤维蛋白（原）在TgCRND8小鼠中的持续时间也比WT小鼠长(图S1C-S1E). 通过检测脑匀浆中的D-二聚体证明注射的纤维蛋白原转化为纤维蛋白(图S1F)表明注射的纤维蛋白原在蛋白水解酶裂解之前被谷氨酰胺转胺酶聚合和交联。因此，注射的纤维蛋白原在TgCRND8海马体中转化为纤维蛋白，并且这种纤维蛋白在TgCRND8中的持续时间比在WT中长。
这些结果表明，纤维蛋白（原）清除受损，这取决于病理程度和淀粉样蛋白负荷。
Aβ42影响血栓形成和降解在体外
纤维蛋白（原）水平升高可能是由于形成增加或清除率降低。为了检验这些可能性，我们用纯化的人纤维蛋白原、凝血酶、tPA和纤溶酶原在Aβ42存在或不存在的情况下进行了血栓形成/降解实验(Merkle等人，1996年). 当凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白时，新形成的纤维散射光，溶液浊度增加。随着纤维蛋白纤维的形成，它们成为tPA激活的纤溶酶的底物，平衡从形成转移到溶解，随着血栓溶解降低浊度。Aβ42在室温下培养过夜，以促进低聚物的成核和生长(Chauhan等人，2001年)形成aβ原纤维和可溶性纤颤前淀粉样蛋白集合物的异质混合物(图S2A). 当在Aβ42存在的情况下进行凝块实验时，纤维蛋白凝块的溶解被延迟(). 检查Aβ42是否影响tPA和纤溶酶原相互作用(Hoylaerts等人，1982年)，使用链激酶重复实验，在Aβ存在的情况下，纯化的纤维蛋白凝块溶解也会延迟（数据未显示）。Aβ可能促进谷氨酰胺转胺酶活性，因为增加交联可以加强纤维蛋白凝块并降低溶解速度。然而，根据纤维蛋白降解产物的分析，在存在或不存在Aβ的情况下，D-二聚体没有差异（数据未显示）。为了在存在所有参与止血的成分的情况下测试这种效果，我们在tPA存在的情况下凝结了重新钙化的人血浆，与纯纤维蛋白凝块类似，Aβ42存在时纤溶延迟（数据未显示）。
Aβ改变纤维蛋白凝块浊度的发展并减缓降解（A） 纤维蛋白形成/降解联合测定。在tPA和纤溶酶原以及10μM Aβ42或载体（对照）存在的情况下，用凝血酶开始凝集纯化的纤维蛋白原（n=4/组）。（B） （A）中纯纤维蛋白凝块从开始溶解到完全溶解的总形成/降解时间**p<0.01。（C） 通过在时间0时向纤维蛋白原中添加人凝血酶，研究Aβ42对血栓形成的影响的剂量反应。控制（车辆）；Aβ42 100 nM；Aβ42 500 nM；Aβ42 5μM。（D） 添加其他β-折叠片淀粉样蛋白（降钙素和胰淀素；5μM）不会影响凝块的浊度，如Aβ42（5μM）。如实验程序所述，（D）中获得的较低总浊度是由于在每条曲线中添加了二甲基亚砜。C&D中的曲线代表了4个实验。
先前的结果表明，Aβ可以作为纤溶酶原通过tPA高效转化为纤溶酶的支架(Kranenburg等人，2002年)尽管Aβ42没有直接增强tPA蛋白水解活性(图S2B). 纤溶酶生成增加与纤溶延迟不一致。因此，Aβ必须在血栓溶解中发挥作用，抵消其对增加纤溶酶生成的影响。此外，Aβ42对凝血酶或纤溶酶活性没有影响(图S2C和S2D).
为了区分Aβ对血栓形成和溶解的可能影响，我们仅在形成阶段测试了Aβ42对纤维蛋白的影响。在凝血酶诱导的纯纤维蛋白原血栓形成过程中，Aβ42的存在使浊度的正常升高呈剂量依赖性降低()这可能反映出凝血不完全。然而，在Aβ42存在和不存在的情况下，所有纤维蛋白原都从溶液中去除，并并入血栓中（数据未显示），这表明两种情况下都已完全凝血。因此，较低的浊度表明Aβ42存在时形成的纤维蛋白凝块结构异常。结构性改变的血栓对纤溶有抵抗力(Collet等人，2000年)这可能解释了纤维蛋白在Aβ42存在下的持久性。在已知与其他人类疾病相关的其他类型淀粉样肽存在的情况下重复该实验。胰淀素(Clark等人，1987年)和降钙素(Arvinte等人，1993年)不会影响纤维蛋白凝块的形成，因为浊度与对照组没有差异(). 这一结果表明，Aβ42对纤维蛋白凝块形成的影响是该肽特有的。
凝块结构受到影响在体外通过Aβ42
Aβ42存在时凝块形成过程中浊度降低()提示检查血块结构。为了观察纤维蛋白网络，我们在荧光纤维蛋白原存在的情况下凝结人血浆。共聚焦显微镜显示，Aβ42存在时，凝块结构发生改变，纤维排列成不均匀网络。正常凝块区域被Aβ42影响的纤维蛋白中不规则的聚集区所中断(). 在不使用标记的纤维蛋白原的情况下，在Aβ42存在的情况下对纤维蛋白进行免疫染色，产生相同的聚集物（数据未显示）。纤维蛋白聚集体刚果红染色阳性()表明它们同时含有纤维蛋白和Aβ纤维形式。当反应混合物中省略凝血酶时，未观察到纤维蛋白荧光或刚果红阳性Aβ聚集体（数据未显示）。为了进一步研究纤维蛋白与聚集的Aβ的共定位，我们在凝血反应中使用生物素化的Aβ42，然后用荧光结合的链霉亲和素染色。仅在聚集体中观察到Aβ染色，证实肽仅限于这些区域（数据未显示）。在不含纤维蛋白原的情况下孵育的β未产生任何聚集形成（数据未显示）。
Aβ改变凝块结构使用血小板缺乏的人血浆和凝血酶，在荧光结合纤维蛋白原存在的情况下，低倍镜下对对照纤维蛋白凝块（a）或aβ42影响的凝块（B）进行共聚焦成像（倒置灰度）。A和B中的比例尺，36.5μm。（C） 荧光纤维蛋白在aβ42存在下与聚集物形成网络。（D） 刚果红荧光与（C）相同。C&D中的比例尺，36.5μm。添加凝血酶后15（E）和90（F）分钟，纤维蛋白凝块的共焦图像显示聚集物。E&F中的比例尺，8.75μm。从纯纤维蛋白原和凝血酶形成的对照纤维蛋白凝块（G）或在Aβ42（H）存在下获得的SEM图像。G&H中的比例尺，1.25μm。插图，1μm×1μm。（一） 红色和绿色分别表示添加tPA前和添加tPA后5分钟，aβ42存在时血浆形成的血栓边缘。比例尺，36.5μm。（J） 通过5分钟延时共聚焦采集（n=4）测定溶栓前退缩率（μm/min）***p<0.001。纤溶后剩余的聚集物包含纤维蛋白（原）（K）和Aβ42（L）。
这些骨料的直径在2-40μm之间，平均尺寸和数量随着时间的推移而增加(). 在胶原蛋白中添加等量的Aβ42不会给胶原蛋白原纤维网络带来任何不规则性(图S3A和S3B)表明纤维蛋白-Aβ相互作用的特异性。纯化纤维蛋白凝块的扫描电子显微镜（SEM）图像也显示在Aβ42存在下聚集形成(). 由于扫描电镜图像是从固定并经过后处理的血块中获得的，因此纤维出现缠结，比正常水合血块中的纤维薄10倍。Aβ可诱导血小板聚集(科瓦尔斯卡和巴德利诺，1994年)，但在我们的实验中观察到的聚集体不是血小板，因为我们使用的是血小板缺乏的血浆()以及纯化的纤维蛋白原(和图S3C、S3D).
为了单独观察降解过程，我们将tPA添加到先前由血浆形成的血栓中，并使用共焦延时图像采集观察纤维蛋白（原）降解(Collet等人，2000年) (). 当凝块被纤溶酶降解时，溶解前沿后退，并计算后退率。在Aβ42的存在下，裂解被延迟，裂解前沿的后退被减缓(). 在凝块溶解过程中，聚集物通常会分离并缓慢溶解(电影S1). 周围纤维蛋白降解后，刚果红阳性的抗降解聚集体仍然存在(). 在对照凝块或在存在搅乱的Aβ42肽的情况下形成的凝块中未检测到聚集物形成和延迟溶解（数据未显示）。所有这些结果表明Aβ42对纤维蛋白凝块结构及其形成和降解有影响在体外.
纤维蛋白（原）沉积在CAA阳性血管中
接下来，我们分析了纤维蛋白（原）和Aβ在脑血管中是否相互作用，因为过量的脑源性Aβ通过血管系统主动排出(Shibata等人，2000年). 我们检测了6个月大的TgCRND8小鼠皮层和海马CAA阳性血管中的纤维蛋白（原）沉积。刚果红染色和纤维蛋白（原）免疫组织化学显示含有纤维蛋白（原）的淀粉样蛋白负载血管沉积在血管内和血管外(). 为了探讨这一发现的临床意义，我们分析了对照组和AD患者尸检脑切片中的纤维蛋白（原）沉积。我们发现AD患者表现出的受纤维蛋白（原）沉积影响的大实质血管（>20μm）明显多于非痴呆对照组(). 我们使用硫黄素S染色检测CAA，发现血管壁和中膜中纤维蛋白（原）与Aβ沉积共存()以及CAA阳性血管，其中纤维蛋白（原）排列在内部()或者占据了整个血管的内腔(). 我们还发现CAA阳性血管完全被纤维蛋白（原）沉积物堵塞，血管壁中有额外的纤维蛋白（源）积聚().
TgCRND8小鼠和人类AD患者CAA阳性血管中的纤维蛋白（原）沉积6个月大的灌流TgCRND8小鼠在CAA部位的皮层（A-C）和海马（D-F）有纤维蛋白（原）沉积，用刚果红荧光检测。对5名对照和9名AD患者的额叶皮层的人死后切片进行纤维蛋白（原）免疫组织化学。含有纤维蛋白（原）的>20μm的实质血管数量被量化（G），被诊断为AD的患者的纤维蛋白阳性血管数量几乎是对照组的两倍**p＜0.01。有代表性的20张图像显示对照组（H）和AD患者（I）的纤维蛋白（原）阳性血管（箭头）。高倍镜显示，AD患者的纤维蛋白（原）与CAA共定位（绿色，通过硫黄蛋白S染色；J-L），排列在血管壁内部（M-O），并填充管腔（P-R），此外沉积在CAA阳性血管（S-U）的中膜中。比例尺，20μm。
纤维蛋白（原）水平降低可减轻CAA病理
关于CAA形成的一个假设是，Aβ清除率在整个血管系统中受损，导致其积聚在血管壁中(Nicoll等人，2004年; Thal等人，2008年b）。由于我们在小鼠和人类CAA阳性血管中检测到纤维蛋白（原）沉积，我们分析了这种沉积是否在CAA发病机制中起直接作用。我们通过注射ancrod（一种从马来亚蝮蛇毒液中纯化的丝氨酸蛋白酶）来去除3个月大的TgCRND8小鼠血液中的纤维蛋白（原）蝮蛇红血肿用于缓解纤维蛋白介导的病理学(Akassoglou等人，2004年;Busso等人，1998年). 我们用泵将小鼠植入体内，以输送安克洛或生理盐水4周，并通过硫黄素S染色定量CAA的总面积。我们发现，与生理盐水治疗相比，用ancrod治疗可显著降低血管淀粉样蛋白(). 如前所述(Paul等人，2007年)ancrod处理的小鼠血浆中的纤维蛋白原水平下降了约50%，ancrod治疗对植入小鼠大脑中aβ42的总量没有显著影响（详情见下文）。这些数据表明，ancrod对CAA水平的影响不是由于对aβ生成的直接影响，而是由于纤维蛋白（原）水平的降低。为了补充这一药理学实验，我们将TgCRND8小鼠与纤维蛋白原Aα链基因（TgCRND8-光纤光栅+/-小鼠），并确定CAA是否也降低。我们发现纤维蛋白原基因减少也会减轻CAA病理(). 这些结果表明，作为CAA的Aβ沉积受血液中纤维蛋白原数量的影响，因为无论是在药物上还是遗传上，纤维蛋白原水平的降低都会降低CAA的病理学。
纤维蛋白原水平降低降低AD小鼠的CAA在TgCRND8小鼠和Tg6799（C）AD小鼠中，纤维蛋白原水平在药理学上（A）或遗传学上（B）降低。分析治疗后淀粉样变在大脑中的分布。纤维蛋白原水平的降低导致两种转基因AD小鼠的CAA总量显著下降。用硫黄素S染色法测定4-7只/组小鼠2-4个切片的CAA。条形代表平均值±SEM。*p<0.05。
鉴于降低CAA对AD进展的重要性，我们研究了在不同的AD转基因小鼠模型中降低纤维蛋白原水平是否会产生相同的效果。Tg6799小鼠携带五种不同的家族性AD突变，早在2个月大的时候就出现淀粉样蛋白沉积，表现出神经元死亡、记忆障碍和突触标记物水平下降(Oakley等人，2006年). 由于尚未对其CAA病理学进行研究，我们分析了2.5、4.5和7.5个月龄Tg6799小鼠的大脑。由于硫黄素S染色显示CAA阳性血管从4.5个月开始（数据未显示），我们在该年龄的Tg6799小鼠中植入了充满ancrod或生理盐水的泵。我们分析了治疗4周后的CAA总量，与TgCRND8小鼠一样，我们发现与盐处理小鼠相比，非激素处理的Tg6799小鼠的CAA总面积显著减少(). 鉴于CAA参与AD发病机制(Nicoll等人，2004年; Thal等人，2008年b）的研究发现，纤维蛋白（原）水平降低可减轻两种不同转基因AD小鼠系的CAA病理学，这表明纤维蛋白（根）是CAA发病机制的促因，因此也是AD的促因。
TgCRND8小鼠出现血栓形成增加趋势
由于纤维蛋白凝块的形成受到Aβ42的影响在体外(和)纤维蛋白（原）沉积在CAA阳性血管中()，我们调查了血栓的形成体内我们使用活体显微镜系统实时诱导和监测6个月大的TgCRND8小鼠和WT室友的血栓形成。建立了一个颅窗，并通过注射荧光结合右旋糖酐监测血流。我们使用两种不同但互补的方法在不同组小鼠中诱导血栓形成。诱导血栓形成的第一种方法是局部应用氯化铁三导致氧化损伤、内皮损伤和随后形成富含血小板的血栓。它被广泛用于诱导啮齿动物的动脉血栓形成(Westrick等人，2007年). 增加FeCl浓度三正常血流上叠加着一个增大的阴影，这表明脑表面形成了血栓(&电影S2). 我们计算了TgCRND8和WT小鼠随时间推移可见闭塞大血管（>20μm）的数量，发现TgCRND8小鼠经常自发血栓形成，甚至在添加FeCl之前三，并且需要较低的剂量来闭塞类似大小的血管().
TgCRND8小鼠血栓形成的改变在6个月大的TgCRND8和WT窝友中打开颅骨窗，并且体内进行成像和血栓形成。添加2.5%（B）、10%（C）和20%（D）FeCl前后凝块形成时间序列的代表性图像三荧光标记血流（灰色）被代表血栓形成的黑色区域所阻断。（E） FeCl后闭塞血管的数量三随着时间的推移，在TgCRND8小鼠和WT同窝小鼠中记录递增剂量的治疗。TgCRND8小鼠表现出更早的闭塞，且FeCl剂量较低三使用双光子激光扫描荧光显微镜的近红外激光也可以诱导凝块形成。TgCRND8小鼠激光损伤前（F-H）和后（I，J）相同区域的最大投影（Z叠加）的代表性图像。注射Methoxy-X04标记Aβ沉积并识别CAA阳性血管（G，伪红色）。白色方框显示了激光聚焦形成凝块的感兴趣区域（J中的箭头）。比例尺，40μm。（K） 量化损伤后血管闭塞的百分比。与WT血管相比，TgCRND8血管的闭塞程度显著增加。注意，在与TgCRND8小鼠相同的条件下，WT小鼠中的一些血管没有闭塞。（五十） 根据Methoxy-X04染色，将（K）中定量的相同血管分为CAA阳性和CAA阴性*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；TgCRND8号机组与WT小鼠。
作为诱导血栓形成的第二种方法，我们使用双光子激光扫描显微镜进行激光诱导血栓形成过程(Nishimura等人，2006年). 与添加FeCl后发生的广义损伤相反三，这种方法允许在单个血管中诱导血栓形成(电影S3和)，并且可以使用荧光染料Methoxy-X04可视化这些特定血管中淀粉样蛋白的含量(Klunk等人，2002年) (). 对每个靶血管中凝块所占面积的量化显示，WT小鼠平均出现46±7%的血管阻塞，而TgCRND8出现79±5%的血管阻塞(). 这些实验中使用的激光条件是在测试不同波长的脉冲、激光强度和足以诱导TgCRND8小鼠再生损伤的重复次数后选择的。然而，同样的条件不足以导致非转基因WT窝友的某些血管闭塞(). 这一发现，加上FeCl后闭塞血管数量增加三应用程序()与对照组相比，TgCRND8小鼠激光诱导血栓形成后的闭塞程度更高()表明AD血管更容易发生血栓。
为了确定血管壁中的淀粉样蛋白含量是否影响TgCRND8小鼠血管中的血栓倾向，我们使用Methoxy-X04染色(Klunk等人，2002年)体内将脑血管淀粉样蛋白视为血管周围的环状结构(). 重新绘制受伤的AD血管CAA阳性或阴性表明，与WT小鼠相比，激光靶向CAA阳性血管几乎完全闭塞（83±5%），而CAA阴性血管的闭塞程度（74±10%）没有达到统计显著性差异（p=0.075）(). 这一结果表明，作为CAA，Aβ在血管中的沉积促进了血栓事件后更高程度的闭塞。然而，值得注意的是，与WT血管相比，缺乏CAA的血管也往往表现出较高的闭塞程度。因此，除CAA外的其他因素可能会影响AD大脑中的凝血。
在9周龄的预设小鼠中也进行了激光诱导血栓形成实验。我们发现9周龄TgCRND8小鼠（60±23%）和WT小鼠（57±15%）的平均血管闭塞百分比没有差异，这表明TgCRN8小鼠血栓形成的增加趋势取决于AD进展的程度。
凝块降解在TgCRND8小鼠中受到抑制
因为血栓降解过程受到了影响在体外(和)，我们检查了这个过程体内通过对含10%FeCl的血栓局部注射tPA来测定纤溶速率三如中所述凝块溶解是指荧光标记血流上阴影的缩小和最终消失(电影S4). 以1分钟的时间间隔测量阴影的大小。TgCRND8小鼠体内形成的凝块在5分钟以上保持相似大小，而WT凝块快速溶解，通常在1分钟内溶解(). TgCRND8动物缺乏血栓溶解不是由于AD脑中纤溶酶原激活物抑制剂水平增加所致(Melchor等人，2003年)，因为添加的tPA活性在TgCRND8小鼠和WT同窝小鼠之间具有可比性（数据未显示）。这些实验表明，血块降解在一只活着的AD小鼠的大脑中受到抑制。
TgCRND8小鼠的延迟纤溶（A） 局部施用10%FeCl后形成的凝块三在TgCRND8和WT小鼠中用tPA治疗，并随时间跟踪和测定血栓大小。对WT（B）和TgCRND8小鼠（C）中预先形成的血栓进行tPA治疗后，血栓溶解时间序列的代表性图像。血流被代表血栓形成的黑色区域阻断（箭头）。比例尺，50μm*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；TgCRND8号机组与WT小鼠。
纤维蛋白（原）水平影响小鼠的记忆和认知能力
分析脑血管中纤维蛋白（原）沉积的生理意义()TgCRND8小鼠凝血倾向增加()，我们检测了纤维蛋白原水平降低的TgCRND8小鼠的认知能力。将WT和TgCRND8小鼠注射安克罗4周以降低纤维蛋白原水平，并在Morris水迷宫中进行测试，这是一项学习和空间记忆任务。将注入生理盐水的小鼠作为对照。隐藏平台测试期间逃避潜伏期的减少表明，四组小鼠学会了定位平台（数据未显示）。TgCRND8小鼠存在严重的记忆障碍；他们在目标象限的时间明显少于WT室友(和S4A系列). 然而，输注ancrod的TgCRND8小鼠表现出更好的表现，因为它们在目标象限的时间明显多于输注盐水的TgCRND8小鼠(和S4A系列)显示出比TgCRND8对照组更高的空间记忆保留率。
小鼠纤维蛋白原水平的调节影响认知能力（A） 将TgCRND8小鼠植入输送ancrod或生理盐水的泵4周，并在Morris水迷宫中进行测试。纤维蛋白原水平降低的TgCRND8小鼠在靶象限的停留时间明显多于TgCRND8对照组，表明纤维蛋白原的药物降低可提高空间记忆保持能力。（B） 纤维蛋白原杂合的TgCRND8小鼠（TgCRND8-光纤光栅+/-)他们的室友在Y迷宫中接受了测试。TgCRND8号机组-光纤光栅+/-与TgCRND8对照组小鼠相比，小鼠花在探索新手臂上的时间要长得多，这表明纤维蛋白原的基因减少可以改善工作记忆。（C） 相反，缺乏纤溶酶原的小鼠（磅-/-)与Morris水迷宫中的WT小鼠相比，易发生严重血栓形成，不同器官中存在纤维蛋白原沉积，表现出记忆障碍。条形代表平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。
血浆中的纤维蛋白（原）水平在三个不同的时间（ancrod治疗前、治疗期间和治疗结束时）进行测量，纤维蛋白（根）平均减少46%（*p=0.0112，与含盐相比）。纤维蛋白（原）水平在任何时候都没有显著下降的小鼠被排除在分析之外。为了确定ancrod是否影响Aβ水平，我们测量了植入盐水或ancrod泵的TgCRND8小鼠脑匀浆中的总Aβ42含量，发现Aβ42的含量没有显著差异（25.9±5.2μg/g组织TgCRND8盐水与21.6±8.2μg/g组织TgCRND8-ancrod；p=0.668）。这些结果表明，安克洛治疗降低TgCRND8小鼠记忆障碍和认知缺陷的效果是由于纤维蛋白（原）水平的降低，而不是淀粉样蛋白总负荷的降低。
为了补充药物降低纤维蛋白（原）水平的结果，我们用TgCRND8进行了水迷宫实验-光纤光栅+/-老鼠和它们的室友。TgCRND8号机组-光纤光栅+/-尽管结果不显著（目标象限时间：38.8%±4.2 TgCRND8与46.6%±3.05 TgCRND8-光纤光栅+/-; p=0.169）。TgCRND8的空间记忆改进-光纤光栅+/-小鼠没有用ancrod治疗的TgCRND8小鼠强壮(). 这种差异可以用动物体内的纤维蛋白原水平来解释，因为用ancrod治疗可使纤维蛋白（原）水平降低约50%，而与携带两个该基因副本的小鼠相比，一个纤维蛋白原基因副本的基因缺失仅产生约35%的降低(Suh等人，1995年). 此外，我们发现光纤光栅+/-小鼠干扰水迷宫分析，因为在此背景下WT和TgCRND8小鼠之间的差异减小。因此，我们在另一项记忆任务——新型臂型Y迷宫中对小鼠进行了测试。我们发现TgCRND8-光纤光栅+/-与TgCRND8小鼠相比，小鼠在新手臂上花费的时间明显更多(). 这些数据补充了我们之前的结果，即降低纤维蛋白原水平在药理学上改善了TgCRND8小鼠的记忆。
如果AD脑中纤维蛋白（原）沉积和血栓形成倾向增加是导致AD认知功能低下的因素，那么血栓形成率增加的小鼠将出现记忆障碍。纤溶酶原缺乏小鼠(液化天然气-/-)纤维蛋白（原）沉积在不同的组织中，容易形成血栓(Bugge等人，1995年;Ploplis等人，1995年). 因此，我们对3个月大的婴儿进行了测试plg公司-/-老鼠在水迷宫里。虽然这些老鼠在一生中都会逐渐消瘦(Bugge等人，1995年;Bugge等人，1996年)，前三个月体重增长正常(Bugge等人，1996年)在探针试验期间，它们的游泳速度与WT小鼠相似（20.1±0.3 cm/s WT与18.4±1.0厘米/秒plg公司-/-; p=0.12）。此外，隐藏平台测试期间逃逸延迟时间的减少表明plg公司-/-老鼠在训练过程中没有受损（数据未显示），表明在这个年龄段没有运动或视觉问题。然而，在调查试验期间，plg公司-/-与WT小鼠相比，小鼠表现出严重的记忆障碍(和S4B系列). 纤维蛋白原的去除plg公司-/-小鼠纠正了许多异常，这表明不能降解纤维蛋白是主要的病理原因(Bugge等人，1996年;Degen等人，2001年). 因此，在plg公司-/-小鼠可能是由于纤溶功能受损，纤维蛋白（原）在这一过程中发挥了作用。
讨论
这里介绍的工作与AD的两个关键特征特别相关：1）神经系统功能的缓慢、渐进性丧失和认知能力下降，以及2）aβ的作用。我们将在讨论结果时考虑到这些特性。
阿尔茨海默病发病机制的假设模型
将我们的结果与之前的发现结合起来，我们提出了一个可以解释AD病理学许多方面的模型：aβ在大脑中积聚，在那里它可以与实质、血管周围或血管内的纤维蛋白原相关。血栓前环境会导致血栓形成，Aβ的存在会使这些血栓异常，并具有抗溶性。纤维蛋白的持续存在可能会阻碍血流或引发炎症，从而损害神经元并导致其功能障碍。AD患者血管中的纤维蛋白原也可能夹带Aβ，阻碍其通过血管系统的清除，并增强CAA的形成，减少血液循环，最终导致认知能力下降。
对淀粉样蛋白依赖性血管病理学的更全面了解将有助于确定这种疾病的候选治疗方法(Greenberg等人，2004年). 我们提出的机制的一个方面是，它可以在治疗上具有特定的靶向性。理论上，一种可以干扰Aβ对纤维蛋白凝块形成的影响的药物可以使大脑中形成的任何血凝块正常化，并增加其溶解，从而改善脑血流量、神经功能和存活率。在其他aβ水平较低的地方，这种药物对一般凝血几乎没有影响。因此，这种方法，也许结合其他策略，可能对AD的治疗有显著的疗效。
实验程序
动物
TgCRND8转基因小鼠(Chishti等人，2001年)表达由人类朊蛋白启动子驱动的APP695双突变形式（K670N/M671L+V717F），在混合背景下（C57XC3H/C57），发展aβ相关病理学，并在3个月大时表现出记忆缺陷（由加拿大多伦多大学a.Chishti和D.Westaway提供）。Tg6799小鼠（Jackson Laboratory）是APP/Presenilin 1的双转基因小鼠，共表达5种早发家族性AD突变，在2个月大时快速积累Aβ42(Oakley等人，2006年). 纤维蛋白原Aα链杂合小鼠(光纤光栅+/-) (Suh等人，1995年)与TgCRND8杂交，用于CAA测定和行为实验。在所有实验中，非转基因（WT）窝友被用作对照。纤溶酶原缺乏小鼠(plg公司-/-) (Bugge等人，1995年;Ploplis等人，1995年)本研究中使用了年龄匹配的WT C57/BL6小鼠（Charles River）。通过在献祭当天采集尾部组织样本，对基因型进行双重检查。所有实验均使用了两种性别，在比较各组时，雌雄比例保持不变。小鼠在洛克菲勒大学比较生物科学中心饲养，并按照IACUC批准的方案进行治疗。
立体定向注射
将含有500ng荧光标记的人纤维蛋白原（Alexa Fluor 488纤维蛋白原，Molecular Probes）的500nl溶液立体定向注射到右半球（后2.0mm，侧1.8mm，深度1.2mm(Franklin和Paxinos，2008年))6个月大和9周大（预沉积）的TgCRND8和WT小鼠。作为对照，在另一组6个月大的小鼠中注射相同数量的四甲基罗丹明-BSA（分子探针）。24小时后用生理盐水/肝素溶液灌流小鼠，将注射半球20μm厚的冠状脑切片固定在乙醇中，清洗，并用含有DAPI的Vectashide（加利福尼亚州伯灵盖姆Vector Labs）固定。使用配备电动台的倒置LSM 510激光扫描共聚焦显微镜（Zeiss）对10个切片/只小鼠（n=3-4只小鼠/组）进行荧光化合物检查。为了量化荧光出现的区域，使用Plan-NeoFluor 25×/0.80物镜获得平铺扫描（4×4），并使用图像J（NIH）进行阈值化。将结果归一化为WT小鼠获得的面积。
凝块形成/降解和浊度实验
将纯化的人类纤维蛋白原（10μM；Calbiochem）或柠檬酸化的正常人类血浆（纽约血液中心，以10000×g离心15分钟以获得血小板缺乏的血浆）与人类凝血酶（1 U/ml；Sigma）在Aβ42肽（100 nM-10μM，Anaspec）或载体（PBS）存在下混合，形成纤维蛋白凝块。氯化钙2调整至5 mM。在450 nm下测量吸光度10 min。在淀粉样肽降钙素和胰淀素（5μM；Anaspec）存在下也会形成凝块。人降钙素在dH中重组2O、 二甲基亚砜中的人胰淀素（1-37）。为了对所有三种淀粉样肽进行比较，将Aβ42、胰淀素或降钙素存在时形成的凝块控制为存在载体的最终浓度。对于形成/降解曲线，在与tPA（14 nM；Genentech）和纯化人纤溶酶原（100 nM；Sigma）相同的条件下形成凝块。淀粉溶液在使用前在室温下摇晃24-48小时。
共焦图像分析和分析前沿后退率
如上所述，在含有或不含有500 nM aβ42的情况下，用Alexa Fluor 488-纤维蛋白原（50μg/ml；分子探针）在玻璃底培养皿上形成凝块。一些血栓含有刚果红（10 mM；Sigma）。在溶血实验中，将tPA注射到预先形成的血栓的中心（混合后20分钟），当溶血前沿从中心后退时，每隔15秒记录一次延时图像叠加5分钟。将初始图像和最终图像重叠，裂解前沿之间的距离除以5分钟的采集时间（4个独立实验中的n=3-4个随机裂解前沿）。使用倒置Axiovert 200显微镜获得图像，使用LSM 510 v.3.2共焦软件（Carl Zeiss，Mannheim，Germany）获得图像，并使用MetaMorph软件（Universal Imaging）进行分析。
电子显微镜
玻璃盖玻片上纯化的纤维蛋白原形成纤维蛋白凝块。20分钟后，用碳酸钠缓冲液清洗血块，用2%戊二醛固定，脱水，临界点干燥，然后用金钯溅射涂层。使用LEO 1550扫描电子显微镜获得图像。
纤维蛋白（原）免疫组织化学
对6个月大的TgCRND8小鼠进行盐水/肝素灌注，制备20μm冠状脑切片，乙醇固定，并用FITC-结合纤维蛋白（原）抗体（Dako）染色。在室温下用0.2%刚果红（Sigma）和70%异丙醇对组织进行30分钟的复染，以检测CAA。使用倒置蔡司Axiovert 200显微镜获取免疫荧光图像。
人脑免疫组织化学
人类死后脑组织由哈佛脑组织资源中心和华盛顿大学AD研究中心提供。对5例对照组（52-90岁）和9例AD（77-91岁）额叶皮质石蜡切片（7μm）进行脱蜡处理，用蛋白酶K（Dako）处理，并浸泡在甲醇/H中2O（运行）2灭活内源性过氧化物酶。根据制造商的说明，使用兔多克隆抗纤维蛋白（原）抗体（Dako）和Tyramide Signal Amplifation™系统（Perkin Elmer）进行免疫组织化学。使用二氨基联苯胺制作切片，在70%乙醇中用1%硫代黄素S（Sigma）共染色30分钟，脱水后贴装。使用倒置蔡司Axiover 200显微镜采集每个切片20至25个视野，并对含有纤维蛋白（原）的>20μm的血管进行量化。
Ancrod处理和CAA测定
Tg6799、TgCRND8和它们的WT同窝仔按照描述用ancrod处理(Paul等人，2007年). 为了计算总淀粉样变性，3个月大的TgCRND8和4.5个月大的Tg6799小鼠植入输送盐水或安克罗的泵，以及7-11个月大的TgCRND8-光纤光栅+/-使用小鼠。对小鼠进行盐水/肝素灌注，用乙醇固定20μm冠状脑冷冻切片，并用0.5%硫黄素S（Sigma）在70%乙醇中染色30分钟。采集所有CAA区域的图像，使用图像J进行阈值分割，并计算每个截面的CAA总面积。测定每组4-7只小鼠2-4个不同切片的平均值，并绘制出与相应对照组相关的图。
血栓的活体内成像
为了观察血液循环并诱导血栓形成，按照所述的手术程序，在6个月龄和9周龄TgCRND8小鼠和WT同窝小鼠的顶叶皮层上制备一个颅骨窗(莫斯坦尼和Portera-Cailliau，2008年)进行了一些修改（请参见补充实验程序). 使用两种不同的方法诱导血栓形成：
局部施用氯化铁三
增加FeCl浓度三（2.5%-20%）以约15分钟的间隔直接添加到大脑表面，并使用安装在垂直蔡司Axiover 200荧光显微镜（Metavue软件）上的摄像机通过实时视频采集记录血栓形成。整个过程每只小鼠持续约60分钟（n=2-4只小鼠/组，每只动物最多有10条>20μm的血管血栓形成）。用10%FeCl处理后三，一些小鼠被局部注射重组tPA（140 nM；Genentech）以激活纤溶。成像后，对小鼠进行灌注，并对其大脑进行处理就地描述的酶谱(Melchor等人，2003年). 使用带时间戳的图像堆叠来观察凝块的形成和溶解。用Metamorph软件手工追踪血块大小，计算代表血块的暗区面积，。
激光诱导血栓形成使用Fluoview 1000MPE双光子激光扫描荧光显微镜（Olympus）激发并成像，该显微镜配备SpectraPhysics MaiTai DeepSee激光器（可调范围为690-1040 nm）和25×/1.05 NA物镜。识别CAA阳性血管，Methoxy-X04(Klunk等人，2002年)（Neuroptix Corporation）在成像前1小时通过尾静脉注射给药（3 mg/kg溶解，如所述(Garcia-Alloza等人，2009年)). 诱导局部激光血栓形成的程序与所描述的程序不同(Nishimura等人，2006年). 请参见补充实验程序了解详细信息。我们以直径大于20μm的3-4条血管/只小鼠为研究对象（6个月龄时，n=5-6条；9周龄TgCRND8和WT时，n=2条）。使用图像J（血栓直径）对血栓形成区域进行2倍缩放Z轴叠加，以量化血管阻塞与容器在所有平面上的直径）。
行为分析
莫里斯水迷宫
TgCRND8和WT小鼠输注盐水或安克洛（n=7，3-5个月龄），TgCRN8-光纤光栅+/-小鼠及其窝友（n=5-10，～4个月大），以及plg公司-/-和C57/BL6小鼠（n=5-6，3个月龄）在Morris水迷宫中进行测试，以评估认知功能(Chishti等人，2001年)进行了一些小修改（请参见补充实验程序详细信息）。通过量化探针试验期间在目标象限内花费的时间百分比和平台交叉次数来测量空间记忆。使用Ethovision视频跟踪系统（Noldus）对实验进行记录和分析。
Y型迷宫
TgCRND8号机组-光纤光栅+/-在Y迷宫中对小鼠及其窝友（n=8-16，7-11个月龄）进行测试。实验在软照明的消声室内进行，视觉线索被放置在测试室的墙上。每个试验包括两个5分钟的周期，间隔2分钟的试验间隔，将小鼠放在家中的笼子中。在最初的5分钟内，三条手臂中的一条被不透明有机玻璃嵌件堵塞；该机械臂在随后的5分钟测试期间充当新型机械臂。记录整个实验，并使用Ethovision（Noldus）对测试期的前2分钟进行分析。对在新手臂上花费的时间进行平均并在各组之间进行比较。
Aβ42与纤维蛋白原ELISA
为了计算总Aβ42脑含量，称量组织并在5 M胍HCl/50 mM Tris-HCl pH 8缓冲液中均质，在室温下搅拌4小时，在16000×g下离心20分钟以提取总Aβ(Chishti等人，2001年). 根据制造商的说明（Covance），使用BetaMark™x-42 ELISA试剂盒测定β42浓度。在用ancrod治疗的小鼠的泵植入之前、期间和之后采集尾刺血样本，并通过ELISA（GenWay Biotech）测量血浆中纤维蛋白原水平的降低。
统计分析
图表中显示的所有数值均为平均值±SEM。使用双尾t检验分析确定统计显著性，将对照组与实验组进行比较。
