图3

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RhoGDI1缺失后Rho家族GTPase的降解不需要Rho蛋白的激活,但取决于它们的香叶基香叶酰化,并涉及分子伴侣机制

()用对照或RhoGDI1 siRNA和p190RhoGAP cDNA共同转染HeLa细胞。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。(b条)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞,并用细胞可渗透的C3毒素处理。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。(c(c))用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞,并用香叶基香叶基转移酶抑制剂GGTI 2417处理。细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。(d日)HeLa细胞与对照或RhoGDI1 siRNA和编码细菌蛋白酶YopT的cDNA共同转染。细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。(e(电子))用对照或RhoGDI siRNA转染HeLa细胞,并从细胞裂解物中免疫沉淀RhoA。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。((f))转染对照组或RhoGDI1 siRNA的HeLa细胞,无论是否含有蛋白酶体抑制剂LLnL,都被分为细胞溶质或膜组分,RhoA从细胞溶质和膜组分中免疫沉淀。为了确保相似数量的RhoA被免疫沉淀,用限制数量的抗体和饱和数量的细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白和细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。()用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞,并用格尔德霉素处理12小时。细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析,并通过Western blotting进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。显示RhoA印迹的短期和长期暴露。所有siRNA实验在转染后72小时进行分析。对于过表达实验,在siRNA转染48小时后,用所示cDNA转染细胞,并再培养24小时。